JPH03112484A - 新規制限酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な制限酵素及びその製造法に関するもので
ある。

【従来の技術］ 制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上のある特定
の塩基配列を認識し、この配列内または近傍の二本鎖を
切断するエンドヌクレアーゼである。

この酸素は、その酵素活性に高い基質特異性と再現性を
有しており、遺伝子の単離、塩基配列の解析やタンパク
質の構造解析を始め、遺伝物質の大量生産などの遺伝子
操作を行う上で不可欠である。

また、今後の遺伝病の解明や治療、遺伝子の人工変換等
に重大な産業的意義を有する試薬である。

制限酵素は種々の微生物より単離されており、その認識
する塩基配列、切断様式により。

現在までに約１００種類が知られている。しかし、これ
ら制限酵素も理論上考えられる種類の酵素の半分はどし
か発見されていない。

［本発明の目的］ 本発明者等は有能な制限酵素の開発の目的で多数の制限
酵素生産菌の研究を行なってきた。

その結果、ビフィドバクテリウム属に属する菌が既存の
制限酵素Ｍｌｕｌに比べ、遥かに高い温度安定性を有し
、塩の要求性もなく、また高い塩濃度でも非常に高い活
性を有する制限酵素Ｂｂｉ２４１を生産することを突き
止め、本発明を完成するに至った。

すなわち１本発明は従来使用されてきた制限酵素Ｍｌｕ
ｌに比べ、高い温度安定性と汎用性を有する新規制限酵
素Ｂｂｉ２４１及びその工業的生産方法を提供すること
にある。

［問題点を解決する為の手段］ 本発明中の第１発明は次の酵素化学的諸性質を有する新
規制限酵素Ｂｂｉ２４１に関するものである。

（ａ）作用及び基質特異性 制限酵素Ｂｂｉ２４１は二本鎖デオキシリボ核酸中の↓ ↑ という塩基配列を認識し、上記矢印部位で切断する酵素
である。

制限酵素Ｂｂｉ２４１の認識部位の決定のため、大腸菌
ファージλＤＮＡ　、動物ウィルスＡｄ２ＤＮＡ、大腸
菌ファージφＸ１７４ＲＦＤＮＡ　、大腸菌ファージＭ
１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡ、動物つ４　ルス５Ｖ４０ＤＮ
Ａ　、大腸菌プラスミドＰＢＲ３２２［ＩＮＡの各ＤＮ
Ａの切断数を調べた。

その結果、入ＤＮＡを７箇所以上、　Ａｄ２ｔｌＮＡを
５箇所以上、またφＸ１？４ＲＦＤＮＡを２箇所切断し
、その他のＤＮＡは切断していなかった。

これをロバートの表（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ、　１９８５．１３．　ｒ１８５）に照し
合わせたところ、制限酵素Ｍｌｕｌのアイソシゾマーで
あることが示された。

そこで、大腸菌ファージ入ＤＮＡを用い、制限酵素Ｂｂ
ｉ２４１と制限酵素ＭｌｕＩのダブルダイゼッションを
試みたところ、切断片に変化はなく。

制限酵素Ｂｂｉ２４１は制限酵素Ｍｌｕｌのアイソシゾ
マーであることが確かめられた。

切断点の決定は次の方法で行った。

まず、制限酵素Ｂｂｉ２４１で大腸菌ファージφＸ１７
４ＲＦＤＮＡを切断し、切断末端のリン酸をアルカリフ
ォスファターゼで除いた。

次に、ポリヌクレオチドカイネース及び［γ−３２Ｐ］
アデノシン三リン酸を用いて、ＤＮＡ断片の５°末端に
放射性リン酸を付加した。

この放射性リン酸を付加したＤＮＡ断片を制限酵素Ｄｒ
ａｌで切断し、新たに生成された３断片の内、小さい２
断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離・分取し
た。

この２断片をマクサム・ギルバート法によりその５°末
端からの塩基配列を調べたところ、これらの実験から得
られた制限酵素Ｂｂｉ２４１は、↓ ５°−Ａ　　ＣＧ　　ＣＧ　　Ｔ−３゜３°−Ｔ　　Ｇ
　　ＣＧ　　ＣＡ−５゜↑ という塩基配列を認識し、上記矢印の位置で切断してい
ると判明した。

（ｂ）酵素反応の至適条件及び酵素の安定性至適ｐＨ：
制限酵素Ｂｂｉ２４Ｉの至適ＰＨは７．５であった・ た。

至適温度　　：制限酵素Ｂｂｉ２４Ｉの至適温度は３７
℃であった・ 安定温度　　＝６０℃、５分間の加熱でも１００にの活
性を維持していた。

安定塩濃度　：５分間の加熱濃度θ〜１３０５Ｍで１０
ｏｚの活性を示した。

（Ｃ）分子量 τＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ　Ｇｌａｓｓ　（東ソー
株式会社製）を用いたゲルろ過法でｓｏ、ｏｏｏであっ
た。

本発明中の第２発明は、ビフィドバクテリウム属に属す
る制限酵素Ｂｂｉ２４１生産菌を栄養培地で培養し、培
養物より制限酵素Ｂｂｉ２４１を栄養培地で培養し、培
養物よりものである。

本発明で使用する微生物はビフィドバクテリウム属に属
するＢｂｉ２４１生産菌であればいずれでも良いが、例
えば人糞便中より分離されたビフィドバクテリウム・ビ
フィダム　Ｓ−２４（Ｂｉｆｉｄ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕ＋ｗ　Ｓ−２４１を
工研菌寄第１０９９？号）である。

本菌は以下に示す生理学的性質を備えていた。

ｌ偏性産気性菌 本菌は以上の生理学的性質から「腸内菌の世界・嫌気性
菌の分離と同定」　（光間　知足著）によりビフィドバ
クテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕ＋ｓ　ｂｉｆｉｄｕ＋ｓ）と同定された。

培養法に制限はなく１通常行われるビフィドバクテリウ
ム属細菌の培養法で増殖可能であるものなら何でもよい
。

例えば、炭素源としてはグルコースなどの糖類、及び窒
素源としてペプトン、アミノ酸、酵母エキスなど、その
他の無機塩類として５分間の加熱や塩化マグネシウム、
リン酸カリウムなどを用いる。

また、血液成分を数％加えることにより成育が良くなる
。

本酵母の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に従った方
法で行なえる。

すなわち、培養菌体は常法に従って集菌し、超音波処理
などの方法により菌体を破砕する。

破砕後、遠心分離などの方法で無細胞抽出液を得る。

この抽出液をイオン交換クロマトグラフィー法、ヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィー法、ゲルろ過法、ア
フィニティークロマトグラフィー法などのクロマトグラ
フィー法の組合わせにより精製を行い、制限酵素Ｂｂｉ
２４１を得る。

Ｂｂｉ２４１の活性測定は次の通り行った。

ｌＯ■にトリス塩酸、　ｐＨ７，５、７ｍＭ　２−メル
カプトエタノール、　７ｍＭ塩化マグネシウム、５０■
Ｎ５分間の加熱＋ＩＩＩｇ入［ＩＮＡからなる反応系に
、酵素を加えて全量を５０１．１１とし、３７℃で１時
間反応させた。

反応液に１＄ｉＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）　、　５
０％グ！Ｊ　セロ−ル、　０．１ＸＢＰＢ（ブロモフェ
ノールブルー）からなる酵素反応停止液を５１Ｊ＋加え
て反応を停止させた。

反応液中の大腸菌ファージ八ＤＮＡを０．５１．Ｉｇｌ
ｌのエチジウムブロマイドを含ませた１ｚアガロースゲ
ル電気泳動にて分離し、ＵＶ照射で［ｌＮＡのバンドの
数と量が変化しなくなった時を終点とした。

上記反応において１１℃ｇ入ＤＮＡを完全にν」断する
酵素活性を１単位とした。

【実施例］ ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ−２４（微工研菌
寄第１０９９７号）はスチールジャー及び調整カザミノ
酸液体培地（表１）を用いて産気培養を行った。

前培養は３７℃で２４時間、本培養は前培養液を本培養
液の１／１００ 量摂取し。

３７℃で１８時間行つ た。

遠心分離で菌体を集めたところ、約１２ｇの湿菌体を得
た。

プロテオースペプトンＮｏ、３　　　３．０ｇグルコー
ス　　　　　　　　　　　１０．０ｇ得られた菌体１１
ｇに緩衝液Ａ（１０■にトリス塩酸、ｐＨ７，５，１（
１＋Ｍ　２−メルカプトエタノール。

７＋ｗＭ塩化マグネシウム）１１０ｍｌを加え、超音波
で処理し、遠心分離で無細胞抽出液を得た。

精製は以下の高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式
会社製）にて精製を行った。

得られた無細胞抽出液を０．４５１Ｊｗのフィルターに
通した後、緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７，５
，７ｍＭ　２−メルカプトエタノール塩化マグネシウム
）で平衡したＤＥＡＥ　）ヨパールバック８５０Ｍ．（
イオン交換クロマトグラフィー）に吸着させた。

０−４００ｍＭの５分間の加熱の直線的濃度勾配を持つ
緩衝液Ｂで溶出させ、１２０〜２００ｍＭ５分間の加熱
濃度に制限酵素画分を得た。

得られた制限酵素画分を１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む前記緩衝液Ｂに一夜透析し、この透析液を２回に
分けて精製した。

１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールを含む緩衝液Ｂで平衡し
たＴＳＫｇｅｌ　Ｈｅｐａｒｉｎ−５ＰＷ　Ｇｌａｓｓ
　（アフィニティークロマトグラフィー〕に透析液を吸
着させ，　３００ｇＭ５分間の加熱を含む同緩衝液を流
した後、１Ｍ５分間の加熱を含む同緩衝液を流した結果
．　１Ｍｔｆｉ化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出され
た最後の２つのピークを制限酵素画分として得た。

この制限酵素画分を３倍に濃縮して、２００ｍＭ５分間
の加熱及びｔｏ！（Ｖ／Ｖ）グリセロールを含む緩衝液
ＢにてＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ　Ｇｌａｓｓ　（
ゲルろ過）に供した、リテンションタイム１１．５〜１
３．０分に制限酵素画分を得た。

得られた制限酵素画分を５０！（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む緩衝液Ｂで一夜透析を行い、最終酵素標品とした
。

ゲルろ過画分においては非特異的なりＮＡ分解酵素は見
られなかった。

［効　果］ 上述した本発明により、従来使用されてきた制限酵素Ｍ
ｌｕｌに比べ、高い温度安定性と汎用性を有する新規制
限酵素Ｂｂｉ２４１及びその工業的生産が可能となった
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の酵素化学的諸性質を有する新規制限酵素Ｂｂ
   ｉ２４Ｉ。 （イ）作用及び基質特異性 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 【遺伝子配列があります】 を認識し、かつこれを上記矢印の位置で切断する（式中
   、Ａはアデノシン、Ｇはグアノ シン、Ｔはチミジン、Ｃはシチジンを示 す）。 （ロ）至適ｐＨ７．５ （ハ）安定ｐＨ５．０〜８．５ （ニ）至適温度３７℃ （ホ）安定温度６０℃ 但し、５分間の加熱による。 （ヘ）安定塩濃度０〜１３０ｍＭ 但し、塩化ナトリウムによる。 （ト）分子量８０，０００ 但し、ゲルろ過法による。
2. （２）ビフィドバクテリウム属に属する制限酵素Ｂｂｉ
   ２４Ｉ生産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵素
   Ｂｂｉ２４Ｉを採取することを特徴とする制限酵素Ｂｂ
   ｉ２４Ｉの製造方法。
3. （３）特許請求の範囲第２項記載の発明において、ビフ
   ィドバクテリウム属に属する制限酵素 Ｂｂｉ２４Ｉ生産菌が、ビフィドバクテリウム・ビフィ
   ダムＳ−２４である制限酵素Ｂｂｉ２４Ｉの製造方法。