JPS5998687A - 制限エンドヌクレア−ゼの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は制限エンドヌクレアーゼの調製法に関する。詳
しくはサーマス・サーモフィラスｌｌｌ菌体から制限エ
ンドヌクレアーゼを調製する方法の改良に関する。

デオキシリボ核酸のヌクレオチド配列を特異的に識別し
て切断する制限エンドヌクレアーゼが、種々の微生物か
ら単離され、現在数子種が知られておシ、これらの酵素
は、デオキシリボ核酸の１次構造の研究や遺伝子工学な
どで試薬として使用されている。本発明者の四宮貴久、
佐藤尚武等は、さきに、サーマス・サーモフィラスｌｌ
ｌ菌体から、従来の制限エンドヌクレアーゼとは異る認
識部位を有する新規な制限エンドヌクレアーゼを発見し
、これを単離し、その作用および基質特異性等の諸性質
全解明した。

（ＮｕｃｌｅｉＣＡＣｌｄＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７　
、第？巻、第１号、≠３〜ｊ６頁（ｌりざ０年）；特開
昭５！−４ｔｊ３．２０号公報〕 本発明は比較的大量の上記制限エンドヌクレアーゼを工
業的に有利に単離調製する方法について種々検討した結
果達成てれたものであって。

その要旨は、サーマス・サーモフィラス／／／菌体から
二重鎖デオキシリボ核酸を下記の矢印の位置で切断する ６’−ＧＡＣＮ↓ＮＮＧ’ｌ’Ｑ　−Ｊ’３’−ＯＴ　
Ｇ口↑ＮＣＡＧ−ｊ’ （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｃはシチジン
、Ｔはチミジン、Ｎは前記Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのうちい
ずれカー一つをそれぞれ示し、上下の鎖は相補的である
） １ｕ１］限エンドヌクレアーゼ全単離調製するに際し、
菌体全緩衝液中で破砕し、不済物を除去し、制限エンド
ヌクレアーゼを含有する緩衝液をセルロースンオスフエ
ートのカラムクロマトグラフィー、ヘハリンー架橋アガ
ロースゲルのカラムクロマトグラフィーおよびハイトロ
キシルアパタイトのカラムクロマトグラフィーによりＮ
　製することを特徴とする制限エンドヌクレアーゼの調
製法に存する。

本発明の詳細な説明するに、本発明の処理の対象とする
サーマス・サーモフィラスｌ／／（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｅ　／　／　／　）は、ジャーナ
ル・オプ・パイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｖｉ
ｒ０１０ｇ７　）第１！巻、／４ｔ≠り〜ｌ≠５３頁（
／り７！年）に記載されている細菌で、サーマス属に属
するサーマス・サーモフィラスの一菌株で次の菌学的性
質を有する。

形　　態：長さ３μｍ×巾０．６μｍ１　　胞子形成せ
ず、ダラム陰性、培養状態は とんど単細胞 コロニー：凸、円形、黄色、径／ｊ　Ｍ生育温度：ＩＯ
Ｃ以下、至適温度７ｊＣＤ　　Ｎ　　Ａ：Ｇ＋ｏ＝Ａざ
、０％ ペプトン・イーストエキス培地での生育状態：濁。ペグ
トンとイーストエキスの濃度がそれぞれ、２％、１％で
生育、それぞれ４Ｌ％、２％以上では生育せず。それぞ
れ０，１．０゜３％が至適。

炭素源（０，５％）：よく生育＝グルコース、ガラクト
ース、マルトース、澱粉、 アミノ酸混合物 生育ニラクトース、アルブミ ン 不可二すッカロース、マンニ ット 栄養要求性：ビタミン混合物（ビオチン、Ｐ−アミノ安
息香酸、ビタミ ンＢ１２１パントテン酸、ビタ ミンＢ２　ｍ　　ビタミン”１　ｈビタミンＢ６、リボ
酸、ニコチンア ミド、葉酸）要求。

食　　　　項二コチ以下生育 ４Ｌ％以上生育不能 生化学的性質＝ｏ、ｏ２％アジド：生育可ＮＯ３の還元
　　：マイナス インドールの生産：マイナス グルコース　：酸生産、ガス 生成せず。

そしてその菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。（受託番号、微工研菌寄第グ６３３号
） 一方、本発明方法によシ上記菌体から単離調製する制限
エンドヌクグアーゼ（以下「本酵素」と略記する）は、
４ｊＣで１時間処理してもその活性は失なわれず、その
酵素活性に対する最適温度はｔｏ〜７０’Ｑで６Ｄ、つ
ぎの理化学的性質を有する。

ｔｌＪ　　作用および基質特異性 イ）二重鎖デオキシリボ核酸全下記の矢印の位置で切断
する。

よ−６え。、↓ＮＮＧＴＯ−８・ Ｊ’−０ＴＧＮＮＮＯＡＧ−ｊ’ ↑ （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン。

Ｃはシチジン、ＴはチミジくＮは前記Ａ。

Ｔ、ＧおよびＣのうちのいずれか一つ全それぞれ示し、
上下の鎖は相補的である。）（ロ）　ラムダ・ファージ
のデオキシリポ核酸を全長の、２３ｊ％と７４ｔ。３俸
のλ個所で切断する。（即ち、全長の２３・ｊ％、２３
．７％およびｔｏ３％の３個の断片に切断する。）ナオ
、本［ｔ　８　ハ当初φＸ／７４ｔＲＦＤＮＡ”に対し
てｔｉ′ｆ累活性全活性ないものと理解されていたが、
その後、活性測定時にマンガンを含む媒体を用いた場合
に、本酵素のφＸ／７＆ＲＦＤＮＡに対する活性が強く
発現することが明らか［７１，φに／−７４１，ＲＦＤ
ＮＡ會基質として、本酵素による切断点配列を、Ｓａｎ
ｇｅｒ　等のｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄ、ｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉＯｎ
ａＩ　ＡＣａａｅｍｙＯｆ　５ｃｉｅｎｃｅＥ３第７ｙ
巻、Ｊ−４ｔＪ　ｊ　〜Ｊ４Ｚ　７頁（ｌり７７）に記
載〕によシ調べた結果。

本管Ｙ索の認識配列 ↓ ｊ’−（）ＡＣＮＮＮＧＴＯ−ｊ’ における４個の特異的塩基（Ｇ、Ａ、ｃ、Ｇ、Ｔ、ｃ）
のうちのいずれか一つがＮで置換された配列ケ認識し、
矢印の位置で切断することが判明した。即ち、上記の１
条件下では本酵素の特異性がゆるやかになることが示さ
れた。

Ｃ→　φＸｉ７グＲＦＤＮＡ： バクテリオファージφＸ１７４ｔ、ａｍ３　を大腸菌の
宿主中で増殖し、その増殖型 （ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ、略してＲＦ）の
ＤＮＡ乞ＡｌｔｍａｎとＤｅｎｈａｒｄｔの方法〔Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａａｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔ
ａ、第２２４を巻、、２／〜、２．ｒｉ（１７７ｏ））
により抽出したもの。

（２）分子量 本酵素タンパク質のセファデックスＧ−／　００　（Ｐ
ｈａｒｍａＣ１ａ社商標）カラム上のゲル濾過による分
子量は約７６．０θｏ、５ＤＳ（ドデシル硫酸ンーダ）
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では約３ＪＯＯＯの
単一のバンドが見出され、本ｔＪ？累タンパク質は分子
量約３２，０００の同一のサブユニット２個からなるこ
とが判明した。

従来、サーマス・サーモフィラスｌｌｌ菌体から本酵素
を単離精製するには、例えば前記のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ａｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、第ｒ巻、第１号、４ｔ
オ〜≠を頁に記載のように、菌体を緩衝液中で破砕し、
遠心分離した上清を、（１）硫安沈澱分画、＋２１ＤＥ
ＡＫ（ジエチルアミノエテル）−セルロースのカラムク
ロマトグラフィー、（３）硫安分画、（４）ヘパリン−
架橋アガロースゲルのカラムクロマトグラフィー、つい
で（５）等電点電気泳動処理の諸精裂操作を逐次実弛し
ている。

このように、従来の調製法は多段階の操作全１及し、か
つ上記操作中、ＤＥＡＲ−セルロースのカラム処理の場
合、比較的多量のＤＥＡＢ−セルロース試薬を要し経済
的に有利でない。また、等電点電気泳動処理も大量の精
製処理には不適当である。しかも従前の方法によっては
本酵素はタンパク質的に均一な標品として得られるまで
には到っておらず。

収率も必ずしも良好とはいい難い。

本発明は、上記従来法の欠点がなく、大量の本酵素を、
比較的簡単な操作によって、純粋にかつ収率よく調製す
る方法を提供するものである。

本発明全一層具体的に説明するに、本発明は、菌体から
の本酵素の抽出処理と３ａのカラムクロマトグラフィー
による精製処理とからなる。

〔抽出処理〕

抽出処理は、サーマス・サーモフィラスｌｌｌ菌体を適
当な抽出用の緩衝液に懸濁し、超音波処理によって菌体
全破砕し、遠心分離して上清全採取することによって行
う。なお、菌体全緩衝液に懸濁する際に１細胞壁分解酵
素、例えばリンチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ　）　　ｋ加
えて比較的低温度で短時間保持した後に、破砕、遠心処
理全実施すれば抽出効率を高め、本酵素の収率向上に役
立つので、本酵素全工業的に調製する場合とくに有利で
ある。緩衝液としては、抽出効率の良好な緩衝液例えば
トリス塩酸（ＰＨ二と、ｏ　）に少量のＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸）およびコーメルカプトエタノール
等を添加したものが使用される。

〔カラムクロマトグラフィー処理〕

本発明におけるカラムクロマトグラフィー処理に用いら
れる充填剤は、種々のタンパク質、核酸等の分離精製に
用いられる数多くの各 周知の分離用試楽の一つであシ、多種の製品カ市販され
ている。即ち、セルロースフォスフェートはセルロース
にリン酸基を導入した陽イオン交換体で、タンパク質な
ど生体成分の分離精製用に使用されている。また、ヘパ
リン−架橋アガロースゲルは、ムコ多糖類の一種テ、り
るヘパリン（ｂＪｐａｒｉｎ　）　ｆ架橋アガロースゲ
ル（担体）に共有結合させたもので、広範囲のタンパク
質のアフイニテイクロマトクラフイー用特異的吸着体で
ある。さらにハイ’ｒ″ロキシルアパタイトはリン酸カ
ルシウム吸看剤でタンパク質、核酸、ウィルスなどの分
離に使用されている。

これらの試薬を用いたカラムクロマトグラフィーによる
精製は、常法に従って、あらかじめ適当な緩衝液で平衝
化したカラムに本酵素を含む抽出液を流通して吸着させ
、ついで適当な溶出液テ用いて溶出し、本酵素全単離す
ることによシ実施される。なお、上記３種のカラムクロ
マトグラフィーによる処理の順序としては、まずセルロ
ースフォスフェートのカラムによる処理、ついでヘハリ
ンー架橋アガロースゲルのカラムによる処理、最後にハ
イトロキシルアパタイトのカラムによる処理を行うのが
好ましいが、場合によっては、セルロースフォスフェー
トのカラム処理とヘパリン−架橋アガロースゲルのカラ
ム処理の順序を変えることもできる。また上記のカラム
クロマトグラフィーによる処理の前にあらかじめ、抽出
ｇを硫安沈澱法による分画および透析処理を行えば、各
カラムクロマトグラフィー処理における充填剤の使用量
全節減すするにあたシ、多数の周知の精良手段の中から
上記３種類の充填剤を使用したカラムクロマトグラフィ
ー？選択するという、比較的簡単な手段全適用すること
によシ、後記実施例にボすように１本酵素全均一なタン
パク質として、従来のλ倍程度の収率で単離調製するこ
とができる。つぎに本発明全芙施例について説明するが
、本発明は以下の実施例に限られるものではない。

実施例／ 〔抽　出〕 サーマスｅサーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕ日第１ｊ巻、
／４’４’り〜ｌ弘ｊ３頁（ｌり７！年。

に記載されている条件で７ＩＣで培養し、後期対数増殖
期で集菌し、−２０Ｃで保存した。

上記凍結菌体ざ００９　ｆ　０．２　Ｍの食塩を含む／
６００−の緩衝ｇ、Ａ（、ｚ　ｏ　７　のトリス塩酸（
ｐＨＬｏ　）、／ｍＭのＥＤＴＡおよび、ｔｍＭの２−
メルカプトエタノールからなる〕中で解凍し、これにｊ
　２０　Ｍ９のリソチームを加え≠Ｃで３０分間インキ
ュベーションした後、得られた菌体の懸濁液に７よｇの
固体食塩を加えて超音波破砕した。ついで３ｏｏ００１
で３時間遠心処理して上清全分取し、残渣全／Ｍの食塩
を含む１１００ｍ１の緩衝液Ａに再懸濁し、再び超音波
破砕ついで遠心して上清を分取し、２つの上清を合し、
蒸留水で稀釈して０゜３Ｍの食塩と同じ電気伝導度とし
た。

〔Ｎ　製〕

上記に得た抽出液を、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化した
セルロース７オスフエート〔ホワットマンＰ　−／　／
　（’ｆｈａｔｍａｎ社商標）〕のカラム（直径ｊｊｃ
ｍ、高さ！　Ｏｃｍ　）に流通し１本酵素全吸着烙せた
。０．３Ｍの食塩を含む緩衝液Ｂ７０００−でカラムを
洗浄し、ついで緩衝液Ｂ中Ｏ６３Ｍ→八へＭの食塩線状
濃度勾配液！　０００　Ｑｌで展開し、１画分２ｊｄ宛
集めた。

カラムからの溶出液を調べたところ分画番号ｊ、５′〜
１７！の両分に本酵素の活性が認められた。この両分を
染め、０．３Ｍの食塩の電気伝導度となるように蒸留水
で稀釈した。

この溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したヘパリン
−架橋アガロースゲル〔ヘハリンーセファロース４ｔＢ
　（ＰｈａｒｍａＣ１ａ社商標）〕のカラム（直径ｘ、
−２ｃｍ、にさｊ　！　ｃｍ　）に流通して本酵素を吸
着させた。０．３Ｍの食塩全台む緩衝液Ａ３００−でカ
ラムを洗浄し、ついで緩衝液Ａ中０．３Ｍ→／９．２Ｍ
の食塩線状濃度勾配液１ｔ００ｍｌで溶出し、１両分ｇ
ｄ宛集めた。分画番号ｇｏ〜りＯの画分に本酵素の活性
が認められた。

この両分子１倍量（容量）の蒸留水で稀釈した溶／ｇ、
′ｆｉ：、あらかじめ／　ｍＭのリン酸カリ緩衝液（Ｐ
Ｈ７，ｓ　）　　を含む０．／　Ｍの食塩液で平衡化し
たハイドロキンルアバタイト（生化学工業社販売）のカ
ラム（＠径／、２ｃｍ、高さ４’　ｊ　ｃｍ　）に流通
して本酵素を吸着させた。カラム全上記リン酸カリ緩衝
ｇを含む０．／　Ｍの食塩液１００ｍ１で洗浄し、つい
で０．Ｉ　Ｍの食塩の存在下／　ｍＭ→／Ｍのリン酸カ
リ緩衝液（ＰＨ７，オ）線状濃度勾配液、２００ゴで展
開し、１画分／　ｍｌ宛集めた。分画番号ｇ！から１７
！１での間のｌ！画分ごとの各両分について５ＤＳｉ含
む１０％アクリルアミドゲル電気泳動によ）タンパク質
を分析して、単一のバンドを与える１ｔ−ｔ〜／りＱの
画分を集め、３倍答量の蒸留水で稀釈してセルロースフ
ォスフェートの小さいカラム（直径／・２錦、高さｓｃ
ｍ）に吸着させる。ｏ、ｒＭの食塩ヶ含む緩衝液Ａでカ
ラムを洗浄した後、本酵素全カラムから／Ｍの食塩全台
む小量の緩ンを含む緩衝液Ａに対して透析し、−２０’
ｌ：：で保存した。

上述の方法によシ調製した本酵素の全量は、Ｌｏｗｒｙ
等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

第１り３巻、２６！〜２７／頁）によればタンパク質と
してｉｏｓｇであった。また、活性単位はど×１０６単
位であった。これは前記ＮｕＣ１ｅｉＣＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、第２巻、第１号、ｐｔ　〜＋ｇ頁記載
の収量（菌体１２０９からＡ　Ｘ　／　０５単位の本酵
素を得ている。これを本実施例の菌体♂ｏｏｇからの本
酵素の収量に換算するとび×ｌθ６°単位となる。）の
２倍に相当する。このように本発明の方法によれば１本
酵素を均一なタンパク質として、しかも従来法の２倍の
収率で調製することができる。

実施例２ 〔抽　出〕 実施例／におけるサーマス・サーモフィラス／／／の凍
結函体１０００９を、２０００ｄの緩衝液ｃ　（ｒ　ｏ
　ｍＭのトリス塩酸（ｐｍ７．ｔ　）、１４ｔｍＭの酢
酸マグネシウム、／　ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、／　ｌｌ
０ｍＭの塩化カリおよび！　ＯｍＭのコーメルカブトエ
タノールからなる〕中で解凍し、超音波破砕処理し、つ
いで１ｏｏｏｏｐで６０分間遠心処理して上滑上分取す
る。

〔精　製〕

上記で得た抽出液に／７ｔｌｉ／ｌの粉末硫安を添加溶
解して３０％飽和液とし１時間放置後、１００００１７
で３０分間遠心処理して沈澱物を除去スル。上清に１９
♂ｆｌ／ｌの粉末硫安を添加溶解して６０％飽和液とし
１時間放置後、１０００にＪで３Ｑ分間遠心し沈澱物を
採取する。

この沈殿物全可及的少量の、０，１６Ｍの食塩を含む緩
衝ｉＤ　Ｃ／　ＯｍＭのトリス塩酸（’ｐＨ７、ｊ）お
よび／　ＯｍＭの２−メルカプトエタノールからなる〕
に溶解して緩衝ｉＤに対して透析し、蒸留水で２倍に稀
釈する。稀釈・ｇ、を、あらかじめ緩衝ｉＤで平衡化し
たヘパリン−架橋アガロースゲル（ヘハリンーセファロ
ースｇＢ）のカラム（直径＝傷、高さ３０ｃｒｎ）に流
通して本酵素を吸着させた。０．１６Ｍの食塩を含む緩
衝液りでカラム全洗浄後、緩衝液Ｄｒ：ｐＯ，／！Ｍ→
１．２　Ｍの食塩線状濃度勾配液で浴出して本酵素の活
性画分金集めた。

この両分を緩衝液ＥＣ／θｍＭのリン酸カリ（ＰＨ７，
弘）および１０ｍＭのコーメルカブトエタノールからな
る〕に対して透析した後、あらかじめ緩″ｆｉｉ液Ｅで
平衡化したセルロースフォスフェート（ホワットマンＰ
−／／）のカラム（直径１．≠−１高さｉ　ｓｃｍ）に
流通し本酵素を吸着させた。０．１３Ｍの食塩を含む緩
衝液Ｅでカラムを洗浄後、緩衝液Ｅ中０．／　ｊ　Ｍ−
）／、、２　Ｍの食塩線状濃度勾配液で浴出して本酵素
の活性画分を集めた。

この画分全緩衝液ｙ〔ｉｏｍＭのリン酸カリ（ＰＨ７，
０）および１０ｍＭの２−メルカプトエタノール〕に対
し透析した後、あらかじめ緩？ｊＦ［Ｆで平衡化したハ
イトロキシルアパタイトのカラム（直径Ｏ０りｃｒｎ、
高さ？副）に流通して本酵素全吸着させた。緩衝液Ｆで
カラムを洗浄後、緩衝ｉＦ中／　ＯｍＭ　−＋０．１　
Ｍのリン酸カリ線状ａ度勾配液で溶出して本酵素の活性
画分を集めた。

この画分を緩衝液ａ　（ｔ　ｏ　ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ７Ｊ）、１０％グリセリン、０．７Ｍの食塩、／　ｍ
ＭのＥＤＴＡおよび／　ｍＭの！−メルカプトエタノー
ルからなる〕に対して透析し、−，２０Ｃで保存した。

上述の方法で調製した本酵素の活性単位は７、Ｊ　Ｘ　
／　０６　　単位（歯体１０００９から）であり、また
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のタ
ンパク質バンドを示す。

５２１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　サーマス・サーモフィラスｌｌｌ菌体から二
   重鎖デオキシリボ核酸を下記の矢印の位置で切断する ↓ Ｊ’−（）ＡＯＮＮＮＧＴＯ−ｊ’ ３’−０ＴＧＮＮぎ０ＡＧ−ｊ’ （式中人はアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｃはシチジン
   、Ｔはチミジン、Ｎは前記Ａ、Ｔ。 ＧおよびＣのうちいずれか一つをそれぞれ示し、上下の
   鎖は相補的である） 制限エンドヌクレアーゼを単離調製するに際し、菌体を
   緩衝液中で破砕し、不溶物を除去し、制限エンドヌクレ
   アーゼを含有する緩衝液ヲセルロースフオスフエートの
   カラムクロマトグラフィー、ヘパリン−架橋アガロース
   ゲルのカラムクロマトグラフィーおよびノ１イドロキシ
   ルアパタイトのカラムクロマトグラフィーによシ精製す
   ることを特徴とする制限エンドヌクレアーゼの調製法