JPS6030512B2 - 制限エンドヌクレア−ゼの調製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は制限エンドヌクレアーゼの調製法に関する。

詳しくはサーマス・サーモフイラス１１１菌体から制限
エンドヌクレアーゼを調製する方法の改良に関する。デ
オキシリボ核酸のヌクレオチド配列を特異的に識別して
切断する制限エンドヌクレアーゼが、種々の微生物から
単機され、現在数十種が知られており、これらに酵素は
、デオキシリボ核酸の１次構造の研究や遺伝子工学など
の試薬として使用されている。

本発明者の四宮貴久、佐藤尚武等は、さきに、サーマス
・サーモフイラス１１１菌体から、従来の制限エンドヌ
クレアーゼとは繁る認識部位を有する新規な制限エンド
ヌクレアーゼを発見し、これを単離し、その作用および
基質特異性等の諸性質を解明した。〔ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、第８巻、第１号、４３−５
６頁（１９８０年）；侍閥昭５５一４５３２ぴ号公報〕
本発明は比較的大量の上記制限エンドヌクレアーゼを工
業的に有利に単離調製する方法について種々検討した結
果達成されたものであって、その要旨は、サーマス・サ
ーモフイラス１１１菌体から三重鎖デオキシリボ核醗を
下記の矢印の位置で切断する（式中Ａはアデノシン、Ｇ
はグアノシン、Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ｎは前記
Ａ，Ｔ，ＧおよびＣのうちいずれか一つをそれぞれ示し
、上下の鎖は相補的である）制限エンドヌクレアーゼを
単離調製するに際し、菌体を緩衝液中で破砕し、不落物
を除去し、制限エンドヌクレアーゼを含有する緩衝液を
セルロースフオスフエートのカラムクロマトグラフイー
、ヘパリンー架橋アガロースゲルのカラムクロマトグラ
フイーおよびハイドロキシルアパタイトのカラムクロマ
トグラフイーにより精製することを特徴とする制限エン
ドヌクレアーゼの調製法に存する。

本発明を詳細に説明するに、本発明の処理の対象とする
サーマス・サーモフイラス１１１（ｍｅｒｍ雌ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓｌｌｌ）は、ジヤーナル・オブ・バィ
ロロジー（Ｊｏｍ雌ｌｏｆＶｉｍｌｏｇｙ）第１５蓋、
１４４９〜１４５３頁（１９７３王）に記載されている
細菌で、サーマス属に属するサーマス・サーモフィラス
の一菌株で次の菌学的性質を有する。

形 態：長さ３山ｍ×中０．５仏ｍ、胞子形成せず、
グラム陰性、培養状態ほとんど単細胞 コロニー：凸、円形、黄色、径１．５側 生育温度：８０００以下、至適温度７５ｑＯＤＮＡ ：
Ｇ十Ｃ＝６８．０％べプトン・イーストエキス塔地で生
育状態：濁。

べプトンとイーストエキスの濃度がそれぞれ２％，１％
で生育、それぞれ４％，２％以上では生育せず。それぞ
れ０．６，０．３％が至薄。炭素数（０．５％）：よく
生育＝グルコース、ガラクトース、マルトース、澱粉、
アミノ酸混合物 生育＝ラクトース、アルブミン 不可＝サツカロース、マンニツト 栄養要求性：ビタミン混合物（ビオチン、Ｐ−アミノ安
息香酸、ビタミンＢ２，バントテン酸、ビタミンＢ２、
ビ タミンＢ，、ビタミンＢ６、リポ 酸、ニコチンアミド、葵酸）要 求。

食 塩：２％以下生育 ４％以上生育不能 生化学的性質：０．０２％アジド：生育可Ｎ０３の還元
：マイナス インドールの生産：マイナス グルコース：酸生産、ガス生成せ ず。

そしてその菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。

（受託番号、徴工研菌寄第４６５５号）一方、本発明方
法により上記菌体から単離調製する制限エンドヌクレア
ーゼ（以下「本酵素」と略記する）は、６６０で１時間
処理してもその活性は失なわれず、その酵素活性に対す
るる最適温度は６０〜７ぴ○であり、つぎの理化学的性
質を有する。

‘１｝ 作用および基質特異性 ｛ィ｝ 二重鎖デオキシリボ核酸を下記の矢印の位置で
切断する。

（式中Ａはアデノシン、Ｇはグア／シン、Ｃはシチジン
、Ｔはチミジン、Ｎは前記Ａ，Ｔ，ＧおよびＣのうちい
ずれか一つをそれぞれ示し、上下の鎖は相補的である。

）‘ｏ｝ ラムダ・フアージのデオキシリボ核酸を全長
の２３．５％と７４．３％の２個所で切断する。

（即ち、全長の２３．５％，２５．７％および５０．８
％の３個の断片に切断する。）なお、本酵素は当初ＯＸ
１７岬ＦＤＮＡ陣に対して酵素活性を示さないものと理
解されていたが、その後、活性測定時にマンガンを含む
媒体に用いた場合に、本酵素の◇×１７４ＲＦＤＮＡに
対する活性が強く発現することが明らかになり、ぐＸ１
７４ＲＦＤＮＡを基質として、本酵素による切断点配列
を、Ｓａｎ群ｒ等のｃｈａｉｎｔｅ皿ｉＭｔｏｒ法〔Ｐ
ｒＭｅｅｄｉ増ｓ ｏｆ仇ｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙｏｆｓｃｉｅｎｃｅｓ 第７４巻、私磯〜５４６
刀頁（１９７７）に記載〕により調べた結果、本酵素の
認識配列５′−ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ−３′ における６個の特異的塩基（Ｇ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，Ｃ）
のうちのいずれか一つがＮで置換された配列を認識し、
矢印の位置で切断することが伴明した。

即ち、上記の像件下では本酵素の特異性がゆるやかにな
ることが示された。駐白 ◇Ｘ１７岬ＦＤＮＡ： バクテリオフアージ◇Ｘ１７傘ｍ３を大腸菌の宿主中で
増殖し、その増殖型（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ的ｒｍ，
略してＲＦ）のＤＮＡを釘ｔｍ燈ｎと戊肌ａｒｄｔ の
方 法 〔 Ｂｉ比ｈｅｍｉｃａ ｅｔＢｉｏｐｈ侭
ｉｃａ Ａｃｔａ，第滋４巻、２１〜２８頁（１９７０
）〕により抽出したもの。

‘２１ 分子量 本酵素タンパク質のセフアデックスＧ−１００（Ｐｈａ
皿ａｃｉａ社商標）力ラム上のゲル炉過による分子量は
約７６，０００ＳＤＳ（ドデシル硫酸ソーダ）ーボリア
クリルアミドゲル電気泳動では約３９，０００の単一の
バンドが見出され、本酵素タンパク質は分子量約３９，
０００の同一のサブユニット２個からなることが判明し
た。

従来、サーマス・サーモフィラス１１１菌体から本酵素
を単離精製するには、例えば前記のＮ比ｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ、第８巻、第１号、４５〜４６頁
に記載のように、菌体を緩衝液中で破砕し、遠心分離し
た上蒲を、【１｝硫安沈澱分画、【２１ＤＥＡＥ（ジエ
チルアミノエチル）−セルロースのカラムクロマトグラ
フィー、‘３｝硫安分画、■へパリン−架橋ァガロース
のカラムクロマトグラフィー、ついで‘５ー等電点電気
泳動処理の諸精製操作を、逐次実施している。

このように、従釆の調製法は多段階の操作を要し、かつ
上記操作中、ＤＥＡＥ−セルロースのカラム処理の場合
、比較的多量のＤＥＡＥーセルロース試薬を要し経済的
に有利でない。

また、等露点電気泳動処理も大量の精製処理には不適当
である。しかも従前の方法によっては本酵素はタンパク
質的に均一な際品として得られるまでには到っておらず
、収率も必ずしも良好とはいい難い。本発明は、上記従
来法の欠点がなく、大量の本酵素を、比較的簡単な操作
によって、純粋にかつ収率よく調製する方法を提供する
ものである。

本発明を一層具体的に説明すると、本発明は、菌体から
の本考案の抽出処理と３種のカラムクロマトグラフイー
による精製処理とからなる。〔抽出処理〕抽出処理は、
サーマス・サーモフイラス１ １ １菌体を適当な抽出
用の緩衝液に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕し
、遠心分離して上情を採取することによって行う。

なお、菌体を緩衝液に懸濁する際に、細胞壁分解酵素、
例えばリンチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を加えて比較的
低温度で短時間保持した後に、破砕、遠心処理を実施す
れば抽出効率を高め「本酵素の収率向上に役立つので、
本酵素を工業的に調製する場合とくに有利である。緩衝
液としては、抽出効率の良好な緩衝液例えばトリス塩酸
（餌＝８．０）に少量のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）および２一メルカプトェタノール等を添加したも
のが使用される。〔カラムクロマトグラフイー処理〕 本発明におけるカラムクロマトグラフィー処理に用いら
れる充填材は、種々のタンパク質、核酸等の分離精製に
用いられる数多くの周知の分離用試薬の一つであり、各
種の製品が市販されている。

即ち、セルロースフオスフエートはセルロースにリン酸
基を導入した陽イオン交換体で、タンパク質などの生体
成分の分離精製用に使用されている。また、ヘパリンー
架橋ァガロースゲルは、ムコ多糖類の一種であるへパリ
ン（ｈｅｐａｒｉｎ）を架橋アガロースゲル（担体）に
共有結合させたもので、広範囲のタンパク費のアフィニ
ティクロマトグラフイー用特異的吸着体である。さらに
ハイドロキシルアパタイトはリン酸カルシウム吸着剤で
タンパク質、核酸、ウイルスなどの分離に使用されてい
る。これらの試薬を用いたカラムクロマトグラフイーに
よる精製は、常法に従って、あらかじめ適当な緩衝液で
平衝化したカラムに本酵素を含む抽出液を流通して吸着
させ、ついで適当な抽出液を用いて溶出し、本酵素を単
離することにより実施される。

なお、上記３種のカラムクロマトグラフイーによる処理
の順序としては、まずセルロースフオスフェートのカラ
ムによる処理、ついでへバリンー架橋アガロースゲルの
カラムによる処理、最後にハイドロキシルアパタイトの
カラムによる処理を行うのが好ましいが、場合によって
は、セルロースフオスフェートのカラム処理とへパリン
ー架橋ァガロースゲルのカラム処理の順序を変えること
もできる。また上記のカラムクロマトグラフィーによる
処理の前にあらかじめ、抽出液を硫安沈澱法による分画
および透析処理を行えば、各カラムクロマトグラフィー
処理における充填材の使用量を節減することができる。
本発明においては、大量の本酵素を単離精製するにあた
り、多数の周知の精製手段の中から上記３種の充填材を
使用したカラムクロマトグラフイーを選択するという、
比較的簡単な手段を適用することにより、後記実施例に
示すように、本酵素を均一なタンパク質として、従来の
２倍程度の収率で単機調製することができる。

つぎに本発明を実施例について説明するが、本発明は以
下の実施例に限られるものではない。実施例 １ 〔抽 出〕 サーマス・サーモフイラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ比ｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）１１１（工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。

受託番号徴工研菌寄第４６５５号）を、Ｊｏｕｒａｌｏ
ｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，第１５巻、１４４９〜１４５３頁
（１９７８王）に記載されている条件で７５℃で培養し
、後期対数増殖期で集菌し、一２０ｑｏで保存した。上
記疎結菌体８００夕を０．２Ｍの食塩を含む１６００の
‘の緩衝液Ａ〔２仇ｈＡのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、
ｌｍＭのＥＤＴＡおよび８ｈＭの２ーメルカプトエタノ
ールからなる〕中で解凍し、これに３２０の９のＩＪソ
チームを加え４℃で３０分間インキユベーシヨンした後
、得られた菌体の懸濁液に７５夕の固体食塩を加えて起
音波破砕した。

ついで３００００夕で３時間遠心処理した上清を分取し
、残澄をＩＭの食塩を含む１６００の‘の緩衝液Ａに再
懸濁し、再び超音波破砕ついで遠心して上情を分取し、
２つの上蒲を合し、蒸留水と稀釈して０．３Ｍの食塩と
同じ電気伝導度とした。〔精 製〕 上記に得た抽出液を、あらかじめ緩衝液Ｂ〔２仇Ｍのリ
ン酸カリ緩衝液（舟７．５），ｌｍＭのＥＤＴＡおよび
則Ｍの２−メルカプトエタノ−ルからなる〕で平衡化し
たセルロースフオスフェート〔ホワットマンＰ−１１（
Ｗｈａｔｍａｎ社商標）〕のカラム（直径３．６弧、高
さ５０弧）に流通し、本酵素を吸着させた。

０．乳けの食塩を含む緩衝液ＢＩＯＯＯ泌でカラムを洗
浄し、ついで緩衝液Ｂ中０．９Ｍ→１．２Ｍの食塩線状
濃度勾配液５０００の【で展開し、１画分２５の‘宛集
めた。

カラムからの溶出液を調べたところ分画番号５５〜１７
５の画分に本酵素の活性が認められた。この画分を集め
、０．９Ｍの食塩の電気伝導度となるように蒸留水で稀
釈した。この溶液を、あらかじめ緩衝液Ａで平衡化して
へパリン−架橋アガロースゲル〔ヘパリンーセファロー
ス砥（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社商標）〕のカラム（直径２
．２凧、高さ３５弧）に流通して本酵素を吸着させた。

０．３Ｍの食塩を含む緩衝液Ａ３００の【でカラムを洗
浄し、ついで緩衝液Ａ中０．９Ｍ→１．２Ｍの食塩線状
濃度勾配液１６００の‘で溶出し、１画分８の‘宛集め
た。

分画番号８０〜９０の画分に本酵素の活性が認められた
。この画分を６倍量（容量）の蒸留水で稀釈した溶液を
、あらかじめｌｍＭのリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７．５）
を含む０．１Ｍの食塩液で平衡化したハイドロキシルア
パタィト（生化学工業社販売）のカラム（直径１．２仇
、高さ４５肌）に流通して本酵素を吸着させた。

カラムを上記リン酸カリ緩衝液を含む０．１Ｍの食塩液
１００の【で洗浄し、ついで０．１Ｍの食塩の存在下ｌ
ｍＭ→ＩＭのリン酸カリ緩衝液（斑７．５）線状濃度勾
配液２００の【で展開し、１画分１泌宛集めた。分画番
号８５から１７５までの間の１劫画分ごとの各画分につ
いてＳＤＳを含む１０％アクリルアミドゲル鷺気泳動に
よりタンパク質を分析して、単一のバンドを与える１６
５〜１９０の画分を集め、３倍容量の蒸留水で稀釈して
セルロースフオスフヱートの小さいカラム（直径１．２
弧、高さ５仇）に吸着させる。０．８Ｍの食塩を含む緩
衝液Ａでカラムを洗浄した後、本酵素をカラムからＩＭ
の食塩を含む小量の緩衝液Ａ中に採取した。

かくして得られた本酵素の濃厚液はＩＭの食塩および５
０％のグリセリンを含む緩衝液Ａに対して透析し、一２
０℃で保存したｏ上述の方法により調製した本酵素の全
量は、山ｗび等の方法（Ｊｏｕｍａｌ、ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ、ＣｈｅｍｉｓＶｙ，第１９９萱、２６５
〜２７１頁）によれば夕ンパク質として１０級であった
。

また、活性単位は８×１び単位であった。これは前記Ｎ
町ｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、第８巻、第１
号、４５〜４６頁記載の収量（菌体１２０９から６×１
『単位の本酵素を得ている。これを本実施例の菌体８０
０夕からの本酵素の収量に換算すると４×１ぴ単位とな
る。）の２倍に相当する。このように本発明の方法によ
れば、本酵素を均一なタンパク質として、しかも従釆法
の２倍の収率で調製することができる。実施例 ２ 〔抽 出〕 実施例１におけるサーマス・サーモフィラス１１ １の
凍結菌体１０００夕を２０００泌の緩衝液Ｃ〔５肌Ｍの
トリス塩酸（ＰＨ７．５），１４ｍＭの酢酸マグネシウ
ム、ｌｍＭのＥＤＴＡ，１４仇ｈＭの塩化カリおよび５
仇ｈＭの２一メルカプトエタノールからなる〕中で解凍
し、超音波破砕処理し、ついで１００００夕で６０分間
遠心処理して上情を分取する。

〔精 製〕上記で得た抽出液に１７６夕／その粉末硫安
を添加溶解して３０％飽和液とし１時間放置後、１００
００夕で３粉ご間遠Ｄ処理して沈澱物を除去する。

上蒲に１斑夕／その粉末硫安を添加熔解して６０％飽和
液とし１時間放置後、１００００夕で３０分間遠心した
沈澱物を採取する。この沈澱物を可及的少量の、０．１
８Ｍの食塩を含む緩衝液Ｄ〔１仇ｈＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．５）および１仇ｈＭの２−メルカプトエタノール
からなる〕に溶解して緩衝液Ｄに対して透析し、蒸留水
で２倍に稀釈する。

稀釈液を、あらかじめ緩衝液Ｄで平衡化したへパリソー
架橋アガロースゲル（ヘパリンーセファロース蟹）のカ
ラム（直径２肌、高さ３０弧）に流通して本酵素を吸着
させた。０．１９Ｍの食塩を含む緩衝液Ｄでカラムを洗
浄後、緩衝液○中０．１９Ｍ→１．２Ｍの食塩線状濃度
勾配液で溶出して本酵素の活性画分を集めた。

この画分を緩衝液Ｅ〔１仇ｈＭのリン酸カリ（ｐＨ７．
４）および１肌Ｍの２一メルカブトエタノールからなる
〕に対して透析した後、あらかじめ緩衝液Ｅで平衡化し
たセルロースフオスフェート（ホワットマンＰ−１１）
のカラム（直径１．４弧、高さ１５の）に流通し本酵素
を吸着させた。

０．１８Ｍの食塩を含む緩衝液Ｅでカラムを洗浄後、緩
衝液Ｅ中０．１９Ｍ→１．２Ｍの食塩線状濃度勾配液で
溶出して本酵素の活性画分を集めた。

この画分を緩衝液Ｆ〔１価Ｍのリン酸カリ（ＰＨ７．０
）および１仇ｍＭの２ーメルカプトエタノール〕に対し
透析した後、あらかじめ緩衝液Ｆで平衡化したハイドロ
キシルアパタイトのカラム（直径０．秋次、高さ８肌）
に流通して本酵素を吸着させた。

緩衝液Ｆでカラムを洗浄後、緩衝液Ｆ中１仇Ｍ→０．８
Ｍのリン酸カリ線状濃度勾配液で溶出して本酵素の活性
画分を集めた。この画分を緩衝液Ｇ（１仇ｈＭのトリス
塩酸、（ｐＨ７．５），５０％グリセリン、０．１Ｍの
食塩、ｌｍＭのＥＤＴＡおよびｌｍＭの２一メルカプト
エタノールからなる〕に対して透析し、一２０ｑｏで保
存した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サーマス・サーモフイラス１１１菌体から二重鎖デ
   オキシリボ核酸を下記の矢印の位置で切断する▲数式、
   化学式、表等があります▼ （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｃはシチジン
   、Ｔはチミジン、Ｎは前記Ａ，Ｔ，ＧおよびＣのうちい
   ずれか一つをそれぞれ示し、上下の鎖は相補的である）
   制限エンドヌクレアーゼを単離調製するに際し、菌体
   を緩衝液中で破砕し、不溶物を除去し、制限エンドヌク
   レアーゼを含有する緩衝液をセルロースフオスフエート
   のカラムクロマトグラフイー、ヘパリン−架橋アガロー
   スゲルのカラムクロマトグラフイーおよびハイドロキシ
   ルアパタイトのカラムクロマトグラフイーにより精製す
   ることを特徴とする制限エンドヌクレアーゼの調製法。