JP2829368B2 - ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 - Google Patents
ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略
す。）と抗アレルギー性ペプチドであるアスパラギン酸
（Asp）−セリン（Ser）−アスパラギン酸（Asp）−グ
リシン（Gly）−リジン（Lys）の５個のアミノ酸配列よ
りなるペプチド（以下、DSDGKと略す。）を含む融合タ
ンパク質を大量に生産可能とする新規組換えプラスミ
ド、該プラスミドを含有する大腸菌、ジヒドロ葉酸還元
酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質
（以下、DHFR−DSDGKと略す。）、DHFR−DSDGKの製造法
及びDSDGKの製造法に関するものである。本発明は、発
酵工業、医薬品工業などの分野に有効に利用されるもの
である。
す。）と抗アレルギー性ペプチドであるアスパラギン酸
（Asp）−セリン（Ser）−アスパラギン酸（Asp）−グ
リシン（Gly）−リジン（Lys）の５個のアミノ酸配列よ
りなるペプチド（以下、DSDGKと略す。）を含む融合タ
ンパク質を大量に生産可能とする新規組換えプラスミ
ド、該プラスミドを含有する大腸菌、ジヒドロ葉酸還元
酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質
（以下、DHFR−DSDGKと略す。）、DHFR−DSDGKの製造法
及びDSDGKの製造法に関するものである。本発明は、発
酵工業、医薬品工業などの分野に有効に利用されるもの
である。
DSDGKは、抗アレルギー性ペプチドの一種であり、ケ
ミカルメディエーターに起因して発症するアレルギー性
鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及びその他のア
レルギー性疾患の予防薬及び治療薬としての利用が期待
される興味深い生理活性ペプチドである。
ミカルメディエーターに起因して発症するアレルギー性
鼻炎、アレルギー性皮膚炎、気管支喘息及びその他のア
レルギー性疾患の予防薬及び治療薬としての利用が期待
される興味深い生理活性ペプチドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技
術がある。DSDGKを暗号化する遺伝子を組み込んだプラ
スミド及びその大腸菌での発現に関しては、これまでの
ところ知られていない。
術がある。DSDGKを暗号化する遺伝子を組み込んだプラ
スミド及びその大腸菌での発現に関しては、これまでの
ところ知られていない。
一般に、分子量１万以下のポリペプチドは、大腸菌な
どの宿主中で産生させてもプロテアーゼなどによって分
解されるため安定に存在しない。これは、分子として小
さいため安定なコンフォメーションをとれないためであ
ると考えられている。従って、遺伝子操作技術を利用し
てDSDGKなどの短いポリペプチドを生産しようとした場
合、融合遺伝子を作成し、融合タンパクとして発現させ
ることが必要である。例えば、板倉らは、14個のアミノ
酸よりなるソマトスタチンの遺伝子操作を利用した合成
を報告している。彼らの方法は、ソマトスタチンを暗号
化する遺伝子を化学合成し、これをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子と融合し、多コピープラスミドに組み込み、組
換えプラスミドをE.coliに導入し、β−ガラクトシダー
ゼのカルボキシ末端側にソマトスタチンをメチオニンを
介して融合させた融合タンパクとして発現させている
（K.Itakura et al.,Science,vol.198,pp.1056（1977）
が、融合タンパクが不溶化すること、及び融合タンパク
に容易に測定可能な酵素活性がないこと、などから生成
物の単離・精製の上で障害が考えれている。
どの宿主中で産生させてもプロテアーゼなどによって分
解されるため安定に存在しない。これは、分子として小
さいため安定なコンフォメーションをとれないためであ
ると考えられている。従って、遺伝子操作技術を利用し
てDSDGKなどの短いポリペプチドを生産しようとした場
合、融合遺伝子を作成し、融合タンパクとして発現させ
ることが必要である。例えば、板倉らは、14個のアミノ
酸よりなるソマトスタチンの遺伝子操作を利用した合成
を報告している。彼らの方法は、ソマトスタチンを暗号
化する遺伝子を化学合成し、これをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子と融合し、多コピープラスミドに組み込み、組
換えプラスミドをE.coliに導入し、β−ガラクトシダー
ゼのカルボキシ末端側にソマトスタチンをメチオニンを
介して融合させた融合タンパクとして発現させている
（K.Itakura et al.,Science,vol.198,pp.1056（1977）
が、融合タンパクが不溶化すること、及び融合タンパク
に容易に測定可能な酵素活性がないこと、などから生成
物の単離・精製の上で障害が考えれている。
本発明の課題は、DSDGKを遺伝子操作技術により合成
することにあり、このために、DSDGKを暗号化する遺伝
子を組み込んだ有効なプラスミドを作成しようとするも
のであり、特に上記ソマトスタチンの例にならいDSDGK
とβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパクとして発現さ
せることには問題があることから、まず可溶性でかつ容
易に測定可能な酵素活性を有する融合タンパク質を発現
する遺伝子を有する組換えプラスミドを開発しようとす
るものである。このような組換えプラスミドを含有する
菌体を利用することによりDSDGKを含んだ融合タンパク
質の生産が可能となり、また容易に測定可能な酵素活性
を利用することにより、融合タンパクの精製が容易にな
る。
することにあり、このために、DSDGKを暗号化する遺伝
子を組み込んだ有効なプラスミドを作成しようとするも
のであり、特に上記ソマトスタチンの例にならいDSDGK
とβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパクとして発現さ
せることには問題があることから、まず可溶性でかつ容
易に測定可能な酵素活性を有する融合タンパク質を発現
する遺伝子を有する組換えプラスミドを開発しようとす
るものである。このような組換えプラスミドを含有する
菌体を利用することによりDSDGKを含んだ融合タンパク
質の生産が可能となり、また容易に測定可能な酵素活性
を利用することにより、融合タンパクの精製が容易にな
る。
本発明者らは、鋭意研究の結果、大腸菌のジヒドロ葉
酸還元酵素遺伝子を用いることにより、上記課題が解決
できることを見いだし、その知見に従ってDHFRとDSDGK
の融合タンパク質を暗号化する遺伝子を組み込んだ組換
えプラスミドを作成し、本発明を完成させた。
酸還元酵素遺伝子を用いることにより、上記課題が解決
できることを見いだし、その知見に従ってDHFRとDSDGK
の融合タンパク質を暗号化する遺伝子を組み込んだ組換
えプラスミドを作成し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、 （１）ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペ
プチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質をコードする塩
基配列を含む組換えプラスミド。
プチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質をコードする塩
基配列を含む組換えプラスミド。
（２）融合タンパク質の抗アレルギー性ペンタペチチド
部分がアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリ
シン−リジンのアミノ酸配列からなるものである上記
（１）記載の組換えプラスミド。
部分がアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリ
シン−リジンのアミノ酸配列からなるものである上記
（１）記載の組換えプラスミド。
（３）ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペ
プチド（DHFR−DSDGK）の融合タンパク質が下記のアミ
ノ酸配列を有するものである上記（１）記載の組換えプ
ラスミド。
プチド（DHFR−DSDGK）の融合タンパク質が下記のアミ
ノ酸配列を有するものである上記（１）記載の組換えプ
ラスミド。
（４）ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペ
プチド（DHFR−DSDGK）の融合タンパク質をコードする
塩基配列が下記の塩基配列である上記（１）記載の組換
えプラスミド。
プチド（DHFR−DSDGK）の融合タンパク質をコードする
塩基配列が下記の塩基配列である上記（１）記載の組換
えプラスミド。
（５）組換えプラスミドが、大腸菌において安定に複製
され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアン
ピシリン耐性を与え、かつ4204塩基対の大きさを有する
ものである上記（１）記載の組換えプラスミド。
され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及びアン
ピシリン耐性を与え、かつ4204塩基対の大きさを有する
ものである上記（１）記載の組換えプラスミド。
（６）組換えプラスミドが第１図の塩基配列を有する組
換えプラスミドpBBK2MAである上記（１）記載の組換え
プラスミド。
換えプラスミドpBBK2MAである上記（１）記載の組換え
プラスミド。
（７）上記（１）記載の組換えプラスミドにより形質転
換された大腸菌。
換された大腸菌。
（８）下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
素−抗アレルギー性ペンタペプチド（DHFR−DSDGK）融
合タンパク質。
素−抗アレルギー性ペンタペプチド（DHFR−DSDGK）融
合タンパク質。
（９）上記（７）記載の大腸菌を培養し、該培養菌体か
らジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチ
ド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質を採取することを特
徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタ
ペプチド融合タンパク質の製造方法。
らジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチ
ド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質を採取することを特
徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタ
ペプチド融合タンパク質の製造方法。
（10）ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペ
プチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質の採取工程が、
培養菌体の無細胞抽出液から、イオン交換カラム処理、
メソトリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラ
フィー、および陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
を順次用いて精製する工程を含むものである上記（９）
記載の製造方法。
プチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク質の採取工程が、
培養菌体の無細胞抽出液から、イオン交換カラム処理、
メソトリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラ
フィー、および陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
を順次用いて精製する工程を含むものである上記（９）
記載の製造方法。
（11）上記（８）記載のジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレ
ルギー性ペンタペプチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク
質にアルギニルエンドペプチダーゼを作用せしめること
を特徴とするアスパラジン酸−セリン−アスパラギン酸
−グリシン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレルギ
ー性ペンタペプチドの製造方法。
ルギー性ペンタペプチド（DHFR−DSDGK）融合タンパク
質にアルギニルエンドペプチダーゼを作用せしめること
を特徴とするアスパラジン酸−セリン−アスパラギン酸
−グリシン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレルギ
ー性ペンタペプチドの製造方法。
に関するものである。
以下に本発明の詳細を（１）新規組換えプラスミドの
作成（２）形質転換された大腸菌（３）DHFR−DSDGK融
合タンパク質の製造工程の順に（４）得られたDHFR−DS
DGK融合タンパク質（５）DSDGKの製造を説明する。
作成（２）形質転換された大腸菌（３）DHFR−DSDGK融
合タンパク質の製造工程の順に（４）得られたDHFR−DS
DGK融合タンパク質（５）DSDGKの製造を説明する。
（１）新規組換えプラスミドの作成 ｉ）DSDGKをコードするDNAの調製 の２本の25ヌクレオチドからなるDNAを化学合成し、こ
れを60℃でインキュベートすることによって両DNAをア
ニールし、下記の２本鎖DNAを得た。
れを60℃でインキュベートすることによって両DNAをア
ニールし、下記の２本鎖DNAを得た。
ii）DSDGKをコードするDNAのベクタープラスミドへの挿
入 DSDGKをコードするDNAを発現させるためのベクターと
しては、既に本発明者らが作製している組換えプラスミ
ドpLEK1（特願昭63−79681号に記載）を用いた。pLEK1
は、大腸菌に安定に保持され、pLEK1を含有する大腸菌
は、微工研にFERMBP−1818として寄託されている。pLEK
1は、pLEK1を含有する大腸菌から通常に行われるプラス
ミドの分離方法に従って分離精製し利用することができ
る。
入 DSDGKをコードするDNAを発現させるためのベクターと
しては、既に本発明者らが作製している組換えプラスミ
ドpLEK1（特願昭63−79681号に記載）を用いた。pLEK1
は、大腸菌に安定に保持され、pLEK1を含有する大腸菌
は、微工研にFERMBP−1818として寄託されている。pLEK
1は、pLEK1を含有する大腸菌から通常に行われるプラス
ミドの分離方法に従って分離精製し利用することができ
る。
精製したpLEK1をBamHIおよびMluＩで切断して得たDNA
断片を上記ｉ）の２本鎖DNAとT4−DNAリガーゼを用いて
連結し、新規プラスミドpBBK2MAを得る。
断片を上記ｉ）の２本鎖DNAとT4−DNAリガーゼを用いて
連結し、新規プラスミドpBBK2MAを得る。
iii）新規プラスミドpBBK2MAの塩基配列 第１図は本発明のpBBK2MAの全塩基配列を示してい
る。図は、２本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、プラスミド中に唯一存在する制限酵素ClaＩの切断
確認部位、５′−ATCGAT−３′、の最初の“A"を１番と
して数えて、５′末端から３′末端の方向に記述してい
る。本発明のpBBK2MAは、新規な組換えプラスミドであ
る。pBBK2MAは、4204塩基対の大きさであり、宿主であ
る大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付
与することができる。pBBK2MAは、4204塩基対より構成
され、pLEK1（4207塩基対よりなる）のBamH IおよびMlu
Ｉ切断によって得られる大きい方のDNA断片（4179塩基
対よりなる）とDSDGKをコードする配列を含む25塩基対
の化学合成DNAが結合した構造をしている。第１図にお
いて、533番目から557番目までの配列が化学合成DNA由
来の配列である。それ以外の配列がpLEK1由来の配列で
ある。ちなみに、pLEK1の全塩基配列は既に本発明者ら
によって明らかにされており（特願昭63−79681号に記
載）、第１図に示す塩基配列のうち533番目から557番目
までの配列が、以下に示す28塩基対のDNA配列に置き換
わった構造である。
る。図は、２本鎖環状DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、プラスミド中に唯一存在する制限酵素ClaＩの切断
確認部位、５′−ATCGAT−３′、の最初の“A"を１番と
して数えて、５′末端から３′末端の方向に記述してい
る。本発明のpBBK2MAは、新規な組換えプラスミドであ
る。pBBK2MAは、4204塩基対の大きさであり、宿主であ
る大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付
与することができる。pBBK2MAは、4204塩基対より構成
され、pLEK1（4207塩基対よりなる）のBamH IおよびMlu
Ｉ切断によって得られる大きい方のDNA断片（4179塩基
対よりなる）とDSDGKをコードする配列を含む25塩基対
の化学合成DNAが結合した構造をしている。第１図にお
いて、533番目から557番目までの配列が化学合成DNA由
来の配列である。それ以外の配列がpLEK1由来の配列で
ある。ちなみに、pLEK1の全塩基配列は既に本発明者ら
によって明らかにされており（特願昭63−79681号に記
載）、第１図に示す塩基配列のうち533番目から557番目
までの配列が、以下に示す28塩基対のDNA配列に置き換
わった構造である。
５′−GATCCGTATGTACGGTGGTTTCCTGTAA−３′ 化学合成したDNAの配列には、制限酵素M1uＩの認識切
断部位、５′−ACGCGT−３′（第１図の557番目から562
番目までの配列）、を含ませてある。pLEK1由来の部分
には、MluＩ部位が存在するので方向を定めて異種DNAの
導入を行い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に作成す
ることができる。
断部位、５′−ACGCGT−３′（第１図の557番目から562
番目までの配列）、を含ませてある。pLEK1由来の部分
には、MluＩ部位が存在するので方向を定めて異種DNAの
導入を行い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に作成す
ることができる。
第１図の57番目から554番目までの配列は、DHFRカル
ボキシ末端側にDSDGKがアルギニンを介して結合したDHF
R−DSDGKを暗号化している。
ボキシ末端側にDSDGKがアルギニンを介して結合したDHF
R−DSDGKを暗号化している。
DHFR−DSDGKを暗号化する配列の上流にはDHFR−DSDGK
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特開
昭63−267276号）。
遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特開
昭63−267276号）。
即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれ
るもので、効率のよい翻訳に、また、4162番目から4190
番目までが、コンセンサス転写プロモーターであり、効
率の良い転写に貢献する。このことから、pBBK2MAは、
大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−DSDGKを作る。
作られたDHFR−DSDGKは、菌体内に可溶性の状態で、菌
体タンパク質の約20％程度蓄積する。トリメトプリムは
このDHFRに対する阻害剤であり、DHFR−DSDGKが大量に
蓄積されることによって、pBBK2MAを有する大腸菌はト
リメトプリム耐性を示すようになる。また、pBBK2MA
は、pLEK1由来の、アンピシリンに対して耐性を付与す
る遺伝子を有している。このことから、pBBK2MAが導入
された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。pBBK2MA
は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれる。
るもので、効率のよい翻訳に、また、4162番目から4190
番目までが、コンセンサス転写プロモーターであり、効
率の良い転写に貢献する。このことから、pBBK2MAは、
大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−DSDGKを作る。
作られたDHFR−DSDGKは、菌体内に可溶性の状態で、菌
体タンパク質の約20％程度蓄積する。トリメトプリムは
このDHFRに対する阻害剤であり、DHFR−DSDGKが大量に
蓄積されることによって、pBBK2MAを有する大腸菌はト
リメトプリム耐性を示すようになる。また、pBBK2MA
は、pLEK1由来の、アンピシリンに対して耐性を付与す
る遺伝子を有している。このことから、pBBK2MAが導入
された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す。pBBK2MA
は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれる。
このような特長を有するpBBK2MAは、実施例１に従っ
て作成することができるが、組換えプラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。
て作成することができるが、組換えプラスミドの作成方
法によって本発明が制限されるものではない。
（２）形質転換された大腸菌 上記（１）で作成したpBBK2MAを常法に従い大腸菌に
取り込ませる。この形質転換された大腸菌は、トリメト
プリム及びアンピシリンに対して耐性を示す。pBBK2MA
を含有する大腸菌は、pBBK2MA上のDHFR−DSDGK遺伝子の
効率の良い発現の結果、DHFR−DSDGKを菌体内に可溶性
の状態で大量に蓄積する。pBBK2MAを含有する大腸菌をY
T＋Ap培地（培地１中に、5gのNaCl、8gのトリプト
ン、5gのイーストエキス、および100mgのアンピシリン
ナトリウムを含む液体培地）を用いて、37℃で定常期ま
で培養した場合、蓄積するDHFR−DSDGKは、菌体タンパ
ク質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩衝液など
の適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音
波破砕法で破砕し、これを遠心分離法により上清と沈殿
に分離した場合、ほとんど全てのDHFR−DSDGKは上清中
に回収される。pBBK2MAを含有する大腸菌（Escherichia
coli）HB101/pBBK2MAは、微工研に微工研条寄第2389号
（FERM BP−2389）として寄託されている。
取り込ませる。この形質転換された大腸菌は、トリメト
プリム及びアンピシリンに対して耐性を示す。pBBK2MA
を含有する大腸菌は、pBBK2MA上のDHFR−DSDGK遺伝子の
効率の良い発現の結果、DHFR−DSDGKを菌体内に可溶性
の状態で大量に蓄積する。pBBK2MAを含有する大腸菌をY
T＋Ap培地（培地１中に、5gのNaCl、8gのトリプト
ン、5gのイーストエキス、および100mgのアンピシリン
ナトリウムを含む液体培地）を用いて、37℃で定常期ま
で培養した場合、蓄積するDHFR−DSDGKは、菌体タンパ
ク質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩衝液など
の適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音
波破砕法で破砕し、これを遠心分離法により上清と沈殿
に分離した場合、ほとんど全てのDHFR−DSDGKは上清中
に回収される。pBBK2MAを含有する大腸菌（Escherichia
coli）HB101/pBBK2MAは、微工研に微工研条寄第2389号
（FERM BP−2389）として寄託されている。
（３）DHFR−DSDGK融合タンパク質の製造工程 本発明のDHFR−DSDGKの製造工程は、ｉ）菌体の培
養、ii）菌体の破砕、iii）DEAE−トヨパールカラム処
理、iv）メソトリキセート（MTX）結合アフィニティク
ロマトグラフィー、およびｖ）DEAE−トヨパールカラム
クロマトグラフィーの各工程により成り立っている。
養、ii）菌体の破砕、iii）DEAE−トヨパールカラム処
理、iv）メソトリキセート（MTX）結合アフィニティク
ロマトグラフィー、およびｖ）DEAE−トヨパールカラム
クロマトグラフィーの各工程により成り立っている。
ｉ）菌体の培養 pBBK2MAを含有する大腸菌の培養は、YT＋Ap培地（培
地１中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）で培養することができる。培地としては、この
他にST＋Ap培地（培地１中に、2gのグルコース、1gの
リン酸２ナトリウム、5gのポリペプトン、5gのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）など、菌体が成長する培地であれば、どの様な
培地でも用いることができるが、調べた限りでは、DHFR
−DSDGKの生産にはYT＋Ap培地が最適であった。
地１中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）で培養することができる。培地としては、この
他にST＋Ap培地（培地１中に、2gのグルコース、1gの
リン酸２ナトリウム、5gのポリペプトン、5gのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）など、菌体が成長する培地であれば、どの様な
培地でも用いることができるが、調べた限りでは、DHFR
−DSDGKの生産にはYT＋Ap培地が最適であった。
pBBK2MAを含有する大腸菌を、培地に接種し、37℃で
対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培養温
度により菌体中のDHFR−DSDGKの蓄積量が変動し、調べ
た限りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であった。
培養した菌体は、5,000回転／分の遠心分離により集め
る。培地１より湿重量２から4gの菌体が得られる。
対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培養温
度により菌体中のDHFR−DSDGKの蓄積量が変動し、調べ
た限りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であった。
培養した菌体は、5,000回転／分の遠心分離により集め
る。培地１より湿重量２から4gの菌体が得られる。
集菌およびこれ以降の操作は、特にこだわらない限り
低温（０から10℃の間、４℃が望ましい）で行う。
低温（０から10℃の間、４℃が望ましい）で行う。
ii）菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝液１
（0.1mMエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（EDTA）を
含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0）に懸濁し、フ
レンチプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕液を5,
000回転／分、10分間遠心分離し、上清を得る。さら
に、上清を、35,000回転／分、１時間超遠心分離し、上
清を得る（この上清を以下無細胞抽出液という。）。
（0.1mMエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（EDTA）を
含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0）に懸濁し、フ
レンチプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕液を5,
000回転／分、10分間遠心分離し、上清を得る。さら
に、上清を、35,000回転／分、１時間超遠心分離し、上
清を得る（この上清を以下無細胞抽出液という。）。
iii）DEAE−トヨパールカラム処理 この操作は、次の精製過程の前処理の目的で行う。無
細胞抽出液を、あらかじめ0.1MのKC1を含む緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムにかけ、0.1MのKC1
を含む緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出は、0.3Mの
KC1を含む緩衝液１を用いて行う。溶出液を一定量ずつ
フラクションコレクターを用いて分画する。分画した溶
出液についてDHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる画
分を集める。
細胞抽出液を、あらかじめ0.1MのKC1を含む緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムにかけ、0.1MのKC1
を含む緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出は、0.3Mの
KC1を含む緩衝液１を用いて行う。溶出液を一定量ずつ
フラクションコレクターを用いて分画する。分画した溶
出液についてDHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる画
分を集める。
iv）MTX結合アフィニティクロマトグラフィー 上記の操作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝
液１で平衡化したMTX結合Sepharoseアフィニティカラム
に吸着させる。吸着後、1MのKC1を含む緩衝液２（0.1mM
EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.5）で洗
う。洗いは、カラムからの溶出液の280nmの吸光度を測
定し、吸光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続け
る。酵素の溶出は、1MのKC1と3mMの葉酸を含む緩衝液２
を用いて行ない、溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得ら
れた酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析する。この
段階で、純度90％以上のDHFR−DSDGKが得られる。
液１で平衡化したMTX結合Sepharoseアフィニティカラム
に吸着させる。吸着後、1MのKC1を含む緩衝液２（0.1mM
EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.5）で洗
う。洗いは、カラムからの溶出液の280nmの吸光度を測
定し、吸光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続け
る。酵素の溶出は、1MのKC1と3mMの葉酸を含む緩衝液２
を用いて行ない、溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得ら
れた酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析する。この
段階で、純度90％以上のDHFR−DSDGKが得られる。
ｖ）DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフィー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化した
DEAE−トヨパールカラムに吸着させる。吸着後、0.1M K
C1を含む緩衝液１で洗う。洗いは、カラムからの溶出液
の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下になるま
で同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用
いて0.1Mから0.3MのKC1の直線濃度勾配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液について280nmの吸光度とDHFR
活性を測定する。酵素活性/280nmの吸光度の値が、一定
な画分を集める。
DEAE−トヨパールカラムに吸着させる。吸着後、0.1M K
C1を含む緩衝液１で洗う。洗いは、カラムからの溶出液
の280nmの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下になるま
で同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用
いて0.1Mから0.3MのKC1の直線濃度勾配を用いて行い、
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する。分画した溶出液について280nmの吸光度とDHFR
活性を測定する。酵素活性/280nmの吸光度の値が、一定
な画分を集める。
以上の操作により、DHFR−DSDGKの高度精製均一化
を、再現性良く行うことができる。
を、再現性良く行うことができる。
本発明に従うと、DHFR−DSDGKの精製は、培養を含め
て一週間以内に行うことができ、回収率20％以上で、均
一な酵素標品を得ることができる。
て一週間以内に行うことができ、回収率20％以上で、均
一な酵素標品を得ることができる。
DHFR酵素活性は、反応液（0.05mMのジヒドロ葉酸、0.
06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール、50mM
のリン酸緩衝液（pH7.0））を1mlのキュベットにとり、
これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定
することにより行う。酵素１ユニットは、上記反応条件
において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還
元するのに必要な酵素量として定義する。この測定は、
分光光度計を用いて容易に行うことができる。
06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール、50mM
のリン酸緩衝液（pH7.0））を1mlのキュベットにとり、
これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定
することにより行う。酵素１ユニットは、上記反応条件
において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還
元するのに必要な酵素量として定義する。この測定は、
分光光度計を用いて容易に行うことができる。
（４）得られたDHFR−DSDGK融合タンパク質 第２図は、DHFR−DSDGKを暗号化する部分のDNA配列と
それから作られるタンパク質のアミノ酸配列を示してい
る。DHFR−DSDGKは、166アミノ酸よりなる新規なタンパ
ク質である。アミノ末端側から数えて、１から160番目
までの配列が、pLEK1が作るDHFRのアミノ酸配列であ
り、162番目から166番目までのDSDGKの配列である。DSD
GKの配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であ
る。このことにより、DHFR−DSDGKをアルギニルエンド
ペプチダーゼ酵素処理することにより、DSDGKを切り出
すことができる。DHFR−DSDGKの分子量は、18,796であ
る。
それから作られるタンパク質のアミノ酸配列を示してい
る。DHFR−DSDGKは、166アミノ酸よりなる新規なタンパ
ク質である。アミノ末端側から数えて、１から160番目
までの配列が、pLEK1が作るDHFRのアミノ酸配列であ
り、162番目から166番目までのDSDGKの配列である。DSD
GKの配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であ
る。このことにより、DHFR−DSDGKをアルギニルエンド
ペプチダーゼ酵素処理することにより、DSDGKを切り出
すことができる。DHFR−DSDGKの分子量は、18,796であ
る。
なお、DHFR−DSDGKは、DHFRのカルボキシ末端側に、D
SDGKの結合した構造をしているにもかかわらず、DHFR酵
素活性を有する。このため、大腸菌がDHFR−DSDGKを多
量につくると、DHFRの阻害剤であり、抗細菌剤であるト
リメトプリムに対して、耐性を示すようになる。
SDGKの結合した構造をしているにもかかわらず、DHFR酵
素活性を有する。このため、大腸菌がDHFR−DSDGKを多
量につくると、DHFRの阻害剤であり、抗細菌剤であるト
リメトプリムに対して、耐性を示すようになる。
（５）DSDGKの製造 上記（４）のDHFR−DSDGK融合タンパク質におけるDSD
GK配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であり、
このDHFR−DSDGK融合タンパク質をアルギニルエンドペ
プチダーゼで酵素処理してDSDGKを得る。
GK配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）であり、
このDHFR−DSDGK融合タンパク質をアルギニルエンドペ
プチダーゼで酵素処理してDSDGKを得る。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
（実施例１） pBBK2MAの作成 DSDGKを暗号化するDNAとしては、 の２本の25ヌクレオチドからなるDNAをホスホアミダイ
ト法に従って化学合成機（アプライド・バイオシステム
社勢,380B）で化学合成し、オリゴヌクレオチド精製カ
ートリッジ（アプライド・バイオシステム社製）で精製
後、DNAを約0.02ml（約0.1μｇのDNAを含んでいる）ず
つ取り、これを60℃でインキュベートすることによって
両DNAをアニールさせ、下記の２本鎖DNAを得た。
ト法に従って化学合成機（アプライド・バイオシステム
社勢,380B）で化学合成し、オリゴヌクレオチド精製カ
ートリッジ（アプライド・バイオシステム社製）で精製
後、DNAを約0.02ml（約0.1μｇのDNAを含んでいる）ず
つ取り、これを60℃でインキュベートすることによって
両DNAをアニールさせ、下記の２本鎖DNAを得た。
精製した約１μｇのpLEK1を、BamHI（宝酒造社製）20
ユニットおよびM1uＩ（宝酒造社製）20ユニットで切断
した後、0.85％アガロースゲル電気泳動法により分離し
た。約4.2キロ塩基対のDNA断片を切出し、ゲルからDNA
を回収した（DNA2と呼ぶ）。BamHIおよびMluＩによるDN
Aの切断の操作は、“Molecular Cloning A Labolatory
Manual"（T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,eds.Col
d Spring Harbor Laboratory（1982）、以下、文献１と
呼ぶ。）に記載している方法に従って行った。DNA2を45
μのリガーゼ用反応液（10mM Tris−HCl pH7.4、5mM
MgCl2、10mMジチオトレイトール、5mM ATP）に溶解後、
５μのDNA1を加え、これに１ユニットのT4−DNAリガ
ーゼ（宝酒造社製）を加えて、室温で、２時間、DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法（tran
sformation method、上記文献１に記載）に従って、大
腸菌（E.coli HB101コンピテントセル 宝酒造社製）に
取り込ませた。この処理をした菌体を、100mg/のアン
ピシリンナトリウムおよび5mg/のトリメトプリムを含
む栄養寒天培地（培地１中に、2gのグルコース、1gの
リン酸２カリウム、5gのイーストエキス、5gのポリペプ
トン、および15gの寒天を含む。）上に塗布し、37℃で2
4時間培養することにより、３個のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーを、2mlのYT＋Ap培地（培
地１中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイースト
エキス、および100mgのアンピシリンナトリウムを含
む。）で、37℃、一晩、菌体を培養した。培養液をそれ
ぞれエッペンドルフ遠心管に取り、12,000回転／分で10
分間遠心分離し、菌体を沈殿として集めた。これに、0.
1mlの電気泳動用サンプル調製液（0.0709MのTris−HCl,
pH6.8、２％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、11％の
グリセリン、５％の２−メルカプトエタノール、及び0.
045％のブロムフェノールブルーを含む）を加え、菌体
を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かし
た。この処理をしたサンプルをSDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法（U.K.Laemmli;Nature,vol.227,p680（197
0）に従って分析した。標準サンプルとしてDHFR及び分
子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子量14,20
0）、トリプシンインヒビター（分子量20,100）、トリ
プシノーゲン（分子量24,000）、カーボニックアンヒド
ラーゼ（分子量29,000）、グリセロアルデヒド−３リン
酸デヒドロゲナーゼ（分子量36,000）、卵アルブミン
（分子量45,000）、及び牛血清アルブミン（分子量66,0
00）を含むサンプル（DALTON MARKVII−LTM,シグマ社
製）をポリアクリルアミド濃度の10から20％濃度勾配ゲ
ル（第一化学薬品社製）で泳動した。その結果、３個の
コロニー全ては、pLEK1のDHFR−ロイシンエンケファリ
ン融合タンパクのバンドが消失し、DHFRタンパクより約
500ダルトン大きいタンパク質が新たに作られているこ
とが明らかになった。この３個から適当に１個選び、こ
れをYT＋Ap培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法（T,
Tanaka,B.Weisblum;J.Bacteriology vol.121,p.354（19
75））に従って、プラスミドを調製した。得られたプラ
スミドをpBBK2MAと名づけた。pBBK2MAは、pLEK1のBamHI
とMluＩ部位の間の配列が合成DNAと置き換わった構造を
しているはずである。合成DNAには、制限酵素MluＩで切
断認識される配列、５′−ACGCGT−３′、が含まれてい
るので、MluＩでpBBK2MAの切断を試みたところ、確かに
切断された。また、pBBK2MAのEcoRI（宝酒造社製）（第
１図の471−476番目の配列）とSalＩ（宝酒造社製）
（第１図の563−568番目の配列）による切断によって得
られる約90ヌクレオチド長のDNAについて、M13ファージ
を用いたジデオキシ法（J.Messing;Methods in Enzymol
ogy,vol.101,p20（1983））に従って、EcoRIからSalＩ
の方向に塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す
pBBK2MAの全塩基配列の471番目から568番目までの配列
が確かめられた。
ユニットおよびM1uＩ（宝酒造社製）20ユニットで切断
した後、0.85％アガロースゲル電気泳動法により分離し
た。約4.2キロ塩基対のDNA断片を切出し、ゲルからDNA
を回収した（DNA2と呼ぶ）。BamHIおよびMluＩによるDN
Aの切断の操作は、“Molecular Cloning A Labolatory
Manual"（T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,eds.Col
d Spring Harbor Laboratory（1982）、以下、文献１と
呼ぶ。）に記載している方法に従って行った。DNA2を45
μのリガーゼ用反応液（10mM Tris−HCl pH7.4、5mM
MgCl2、10mMジチオトレイトール、5mM ATP）に溶解後、
５μのDNA1を加え、これに１ユニットのT4−DNAリガ
ーゼ（宝酒造社製）を加えて、室温で、２時間、DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法（tran
sformation method、上記文献１に記載）に従って、大
腸菌（E.coli HB101コンピテントセル 宝酒造社製）に
取り込ませた。この処理をした菌体を、100mg/のアン
ピシリンナトリウムおよび5mg/のトリメトプリムを含
む栄養寒天培地（培地１中に、2gのグルコース、1gの
リン酸２カリウム、5gのイーストエキス、5gのポリペプ
トン、および15gの寒天を含む。）上に塗布し、37℃で2
4時間培養することにより、３個のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーを、2mlのYT＋Ap培地（培
地１中に、5gのNaCl、8gのトリプトン、5gのイースト
エキス、および100mgのアンピシリンナトリウムを含
む。）で、37℃、一晩、菌体を培養した。培養液をそれ
ぞれエッペンドルフ遠心管に取り、12,000回転／分で10
分間遠心分離し、菌体を沈殿として集めた。これに、0.
1mlの電気泳動用サンプル調製液（0.0709MのTris−HCl,
pH6.8、２％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、11％の
グリセリン、５％の２−メルカプトエタノール、及び0.
045％のブロムフェノールブルーを含む）を加え、菌体
を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かし
た。この処理をしたサンプルをSDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法（U.K.Laemmli;Nature,vol.227,p680（197
0）に従って分析した。標準サンプルとしてDHFR及び分
子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子量14,20
0）、トリプシンインヒビター（分子量20,100）、トリ
プシノーゲン（分子量24,000）、カーボニックアンヒド
ラーゼ（分子量29,000）、グリセロアルデヒド−３リン
酸デヒドロゲナーゼ（分子量36,000）、卵アルブミン
（分子量45,000）、及び牛血清アルブミン（分子量66,0
00）を含むサンプル（DALTON MARKVII−LTM,シグマ社
製）をポリアクリルアミド濃度の10から20％濃度勾配ゲ
ル（第一化学薬品社製）で泳動した。その結果、３個の
コロニー全ては、pLEK1のDHFR−ロイシンエンケファリ
ン融合タンパクのバンドが消失し、DHFRタンパクより約
500ダルトン大きいタンパク質が新たに作られているこ
とが明らかになった。この３個から適当に１個選び、こ
れをYT＋Ap培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法（T,
Tanaka,B.Weisblum;J.Bacteriology vol.121,p.354（19
75））に従って、プラスミドを調製した。得られたプラ
スミドをpBBK2MAと名づけた。pBBK2MAは、pLEK1のBamHI
とMluＩ部位の間の配列が合成DNAと置き換わった構造を
しているはずである。合成DNAには、制限酵素MluＩで切
断認識される配列、５′−ACGCGT−３′、が含まれてい
るので、MluＩでpBBK2MAの切断を試みたところ、確かに
切断された。また、pBBK2MAのEcoRI（宝酒造社製）（第
１図の471−476番目の配列）とSalＩ（宝酒造社製）
（第１図の563−568番目の配列）による切断によって得
られる約90ヌクレオチド長のDNAについて、M13ファージ
を用いたジデオキシ法（J.Messing;Methods in Enzymol
ogy,vol.101,p20（1983））に従って、EcoRIからSalＩ
の方向に塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す
pBBK2MAの全塩基配列の471番目から568番目までの配列
が確かめられた。
また、pBBK2MAのBamHI−SalＩ切断によって得られる
約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoRI,PstI,HindIII,HpaI,Pv
uII,BglII,ClaＩ（以上は宝酒造社製）およびAatII（東
洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の結果、pL
EK1のBamHI−SalＩ切断によって得られる約4.2キロ塩基
対のと全く同一であることが示された。
約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoRI,PstI,HindIII,HpaI,Pv
uII,BglII,ClaＩ（以上は宝酒造社製）およびAatII（東
洋紡社製）を用いた制限酵素による切断実験の結果、pL
EK1のBamHI−SalＩ切断によって得られる約4.2キロ塩基
対のと全く同一であることが示された。
以上の結果から、pBBK2MAの全塩基配列が第１図に示
した配列であることが決められた。
した配列であることが決められた。
（実施例２） pBBK2MAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGK pBBK2MAを含有する大腸菌が作るDHFR−DSDGKのアミノ
酸配列は、DHFR−DSDGK遺伝子の配列から予想すること
ができる。第１図の57番目から554番目までの配列がDHF
R−DSDGKを暗号化していることから、トリプレット暗号
表を用いて、アミノ酸配合を推定した。その結果第２図
に示すアミノ酸配列が得られた。pBBK2MAを含有する大
腸菌から、DHFR−DSDGKを分離精製し、精製したタンパ
ク質を用いて、以下のように確認した。
酸配列は、DHFR−DSDGK遺伝子の配列から予想すること
ができる。第１図の57番目から554番目までの配列がDHF
R−DSDGKを暗号化していることから、トリプレット暗号
表を用いて、アミノ酸配合を推定した。その結果第２図
に示すアミノ酸配列が得られた。pBBK2MAを含有する大
腸菌から、DHFR−DSDGKを分離精製し、精製したタンパ
ク質を用いて、以下のように確認した。
DHFR−DSDGKの精製 A.用いた菌体量：湿重量13g B.酵素精製工程：下記表１に示す。（表におけるは無
細胞抽出液、はDEAE−トヨパールカラム（トヨパール
イオン交換体,DEAE−TOYOPEARL650東ソ−社製）処理、
はMTX結合Agarose（MTX−アガロース，シグマ社製）
アフィニティクロマトグラフィー、およびはDEAE−ト
ヨパールカラム（トヨパールイオン交換体,DEAE−TOYOP
EARL650東ソ−社製）クロマトグラフィーを表わし、酵
素精製はの無細胞抽出液を順次，，の精製工程
に付すことにより行った。） DHFR酵素活性は、反応液（0.05mMのジヒドロ葉酸、0.
06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール、50mM
のリン酸緩衝液（pH7.0））を、1mlのキュベットにと
り、これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を
測定することにより行った。酵素１ユニットは、上記反
応条件において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉
酸を還元するのに必要な酸素量として定義した。
細胞抽出液、はDEAE−トヨパールカラム（トヨパール
イオン交換体,DEAE−TOYOPEARL650東ソ−社製）処理、
はMTX結合Agarose（MTX−アガロース，シグマ社製）
アフィニティクロマトグラフィー、およびはDEAE−ト
ヨパールカラム（トヨパールイオン交換体,DEAE−TOYOP
EARL650東ソ−社製）クロマトグラフィーを表わし、酵
素精製はの無細胞抽出液を順次，，の精製工程
に付すことにより行った。） DHFR酵素活性は、反応液（0.05mMのジヒドロ葉酸、0.
06mMのNADPH、12mMの２−メルカプトエタノール、50mM
のリン酸緩衝液（pH7.0））を、1mlのキュベットにと
り、これに酵素液を加え、340nmの吸光度の時間変化を
測定することにより行った。酵素１ユニットは、上記反
応条件において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉
酸を還元するのに必要な酸素量として定義した。
得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上記実施
例に記載の方法）により分析したところ、約21,500の単
一なタンパク質バンドが示され、得られた酵素標品が均
一であることが示された。
例に記載の方法）により分析したところ、約21,500の単
一なタンパク質バンドが示され、得られた酵素標品が均
一であることが示された。
（実施例３） 精製したDHFR−DSDGK溶液（2.2mg/ml）5mlに1Mトリス
塩酸バッファー（pH8.0）1ml、1mg/mlアルギニルエンド
ペプチダーゼ（宝酒造社製）溶液1mlを加え、37℃で一
晩インキュベートした。反応後、遠心型凍結乾燥器で約
1mlになるまで濃縮した。この0.1mlを高速液体クロマト
グラフィー装置（日立655型）を用い逆相カラム（ウオ
ーターズNova Pak C18）で分離した。溶出は、0.1％ト
リフルオロ酢酸水溶液を用い、溶出時間２〜３分の分画
を回収した。カラムは、0.1％トリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリルを流して再生した。同一の条件で繰り返
し分離し、回収した分画を遠心型凍結乾燥器で乾燥し、
1mlの精製水を加えて溶解した。これを再び、高速液体
クロマトグラフィー装置を用い、ゲル濾過カラム（アサ
ヒパックGS−320H）で分離した。溶出は、0.05M酢酸ア
ンモニウムバッファーpH6.7を用い、0.1ml/minの流速で
行った。抗アレルギー性ペンタペプチドDSDGKは、約60
分の位置に溶出された。DSDGKの分画を集めるとペプチ
ド45μｇが回収された。
塩酸バッファー（pH8.0）1ml、1mg/mlアルギニルエンド
ペプチダーゼ（宝酒造社製）溶液1mlを加え、37℃で一
晩インキュベートした。反応後、遠心型凍結乾燥器で約
1mlになるまで濃縮した。この0.1mlを高速液体クロマト
グラフィー装置（日立655型）を用い逆相カラム（ウオ
ーターズNova Pak C18）で分離した。溶出は、0.1％ト
リフルオロ酢酸水溶液を用い、溶出時間２〜３分の分画
を回収した。カラムは、0.1％トリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリルを流して再生した。同一の条件で繰り返
し分離し、回収した分画を遠心型凍結乾燥器で乾燥し、
1mlの精製水を加えて溶解した。これを再び、高速液体
クロマトグラフィー装置を用い、ゲル濾過カラム（アサ
ヒパックGS−320H）で分離した。溶出は、0.05M酢酸ア
ンモニウムバッファーpH6.7を用い、0.1ml/minの流速で
行った。抗アレルギー性ペンタペプチドDSDGKは、約60
分の位置に溶出された。DSDGKの分画を集めるとペプチ
ド45μｇが回収された。
上記のように、本発明の新規組換えプラスミドpBBK2M
Aは、DHFR−DSDGKを暗号化しており、かつpBBK2MAを有
する大腸菌は、DHFR−DSDGKを可溶性の状態で大量に蓄
積生産する。さらに、生成したDHFR−DSDGKは、DHFR酵
素活性を保持しており、精製を容易に行うことができ
る。本発明の精製法に従うことにより、DHFR−DSDGKの
精製を迅速に効率よく行うことができる。また、このよ
うに得られたDHFR−DSDGKは次に適当な酵素あるいは化
学処理によってDHFRとDSDGKの間を切断したのち、高速
液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法など公
知の分離技術の組合せによって、DSDGKを単離精製する
ことができる。そして精製されたDSDGKはアレルギー性
疾患の治療薬として有用なものである。したがって、本
発明により、アレルギー性疾患の治療薬として有用なDS
DGKを遺伝子操作手段によって製造するための極めて有
利な手段が提供できた。
Aは、DHFR−DSDGKを暗号化しており、かつpBBK2MAを有
する大腸菌は、DHFR−DSDGKを可溶性の状態で大量に蓄
積生産する。さらに、生成したDHFR−DSDGKは、DHFR酵
素活性を保持しており、精製を容易に行うことができ
る。本発明の精製法に従うことにより、DHFR−DSDGKの
精製を迅速に効率よく行うことができる。また、このよ
うに得られたDHFR−DSDGKは次に適当な酵素あるいは化
学処理によってDHFRとDSDGKの間を切断したのち、高速
液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法など公
知の分離技術の組合せによって、DSDGKを単離精製する
ことができる。そして精製されたDSDGKはアレルギー性
疾患の治療薬として有用なものである。したがって、本
発明により、アレルギー性疾患の治療薬として有用なDS
DGKを遺伝子操作手段によって製造するための極めて有
利な手段が提供できた。
第１図は、pBBK2MAの全塩基配列を示した図であり、２
本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、５′末端から
３′末端の方向に記述している。図中符号は、核酸塩基
を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニ
ンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、pBBK2MA
に１箇所存在する制限酵素ClaＩ切断認識部位、５′−A
TCGAT−３′、の最初の“A"を１番として数えた番号を
示している。 第２図は、pBBK2MA中に存在するDHFR−DSDGKを暗号化す
る部分の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列を示す
図である。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表し、
Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔ
はチミンを、Glyはグリシンを、Alaはアラニンを、Val
はバリンを、Leuはロイシンを、Ileはイソロイシンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Cysはシステイン
を、Metはメチオニンを、Aspはアスパラギン酸を、Asn
はアスパラギンを、Gluはグルタミン酸を、Glnはグルタ
ミンを、Argはアルギニンを、Lysはリジンを、Hisはヒ
スチジンを、Pheはフェニルアラニンを、Tyrはチロシン
を、Trpはトリプトファンを、Proはプロリンを示してい
る。図中番号は、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸で
あるメチオニンを１番として数えた番号を示している。 第３図は、DHFR−DSDGKをアルギニルエンドペプチダー
ゼ処理し逆相カラムで回収した分画のゲル濾過カラムで
の高速液体クロマトグラムを示している。横軸は時間を
分単位で、縦軸は220nmの吸光度を任意単位で表してい
る。図中の矢印は抗アレルギー性ペンタペプチドDSDGK
の溶出された位置を示している。
本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、５′末端から
３′末端の方向に記述している。図中符号は、核酸塩基
を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニ
ンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、pBBK2MA
に１箇所存在する制限酵素ClaＩ切断認識部位、５′−A
TCGAT−３′、の最初の“A"を１番として数えた番号を
示している。 第２図は、pBBK2MA中に存在するDHFR−DSDGKを暗号化す
る部分の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列を示す
図である。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表し、
Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔ
はチミンを、Glyはグリシンを、Alaはアラニンを、Val
はバリンを、Leuはロイシンを、Ileはイソロイシンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Cysはシステイン
を、Metはメチオニンを、Aspはアスパラギン酸を、Asn
はアスパラギンを、Gluはグルタミン酸を、Glnはグルタ
ミンを、Argはアルギニンを、Lysはリジンを、Hisはヒ
スチジンを、Pheはフェニルアラニンを、Tyrはチロシン
を、Trpはトリプトファンを、Proはプロリンを示してい
る。図中番号は、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸で
あるメチオニンを１番として数えた番号を示している。 第３図は、DHFR−DSDGKをアルギニルエンドペプチダー
ゼ処理し逆相カラムで回収した分画のゲル濾過カラムで
の高速液体クロマトグラムを示している。横軸は時間を
分単位で、縦軸は220nmの吸光度を任意単位で表してい
る。図中の矢印は抗アレルギー性ペンタペプチドDSDGK
の溶出された位置を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 小原 和彦 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/62,1/21 C07K 7/06,19/00 C12P 21/02,21/06
Claims (10)
- 【請求項１】融合タンパク質の抗アレルギー性ペンタペ
プチド部分がアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸
−グリシン−リジンのアミノ酸配列からなるものである
ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド
融合タンパク質をコードする塩基配列を含む組換えプラ
スミド。 - 【請求項２】ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペ
ンタペプチドの融合タンパク質が下記のアミノ酸配列を
有するものである請求項（１）記載の組換えプラスミ
ド。 - 【請求項３】ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペ
ンタペプチドの融合タンパク質をコードする塩基配列が
下記の塩基配列である請求項（１）記載の組換えプラス
ミド。 - 【請求項４】組換えプラスミドが、大腸菌において安定
に複製され、宿主である大腸菌にトリメトプリム耐性及
びアンピシリン耐性を与え、かつ4204塩基対の大きさを
有するものである請求項（１）記載の組換えプラスミ
ド。 - 【請求項５】組換えプラスミドが、第１図の塩基配列を
有する組換えプラスミドpBBK2MAである請求項（１）記
載の組換えプラスミド。 - 【請求項６】請求項（１）記載の組換えプラスミドによ
り形質転換された大腸菌。 - 【請求項７】下記のアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸
還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク
質。 - 【請求項８】請求項（６）記載の大腸菌を培養し、該培
養菌体からジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペン
タペプチド融合タンパク質を採取することを特徴とする
ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペンタペプチド
融合タンパク質の製造方法。 - 【請求項９】ジヒドロ葉酸還元酵素−抗アレルギー性ペ
ンタペプチド融合タンパク質の採取工程が、培養菌体の
無細胞抽出液から、イオン交換カラム処理、メソトリキ
セート結合アフィニティカラムクロマトグラフィー、お
よび陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを順次用い
て精製する工程を含むものである請求項（８）に記載の
製造方法。 - 【請求項１０】請求項（７）記載のジヒドロ葉酸還元酵
素−抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質にア
ルギニルエンドペプチターゼを作用せしめることを特徴
とするアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸−グリ
シン−リジンのアミノ酸配列からなる抗アレルギー性ペ
ンタペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11744289A JP2829368B2 (ja) | 1989-05-12 | 1989-05-12 | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11744289A JP2829368B2 (ja) | 1989-05-12 | 1989-05-12 | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02299589A JPH02299589A (ja) | 1990-12-11 |
| JP2829368B2 true JP2829368B2 (ja) | 1998-11-25 |
Family
ID=14711751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11744289A Expired - Lifetime JP2829368B2 (ja) | 1989-05-12 | 1989-05-12 | ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド融合タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2829368B2 (ja) |
-
1989
- 1989-05-12 JP JP11744289A patent/JP2829368B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02299589A (ja) | 1990-12-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |