JPH0355110B2

JPH0355110B2 -

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Publication number: JPH0355110B2
Application number: JP25226588A
Authority: JP
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1988-10-06
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPH02100681A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、β−エンドルフインの遺伝子組換え
法による新規な製造方法およびそれに係わる組換
えプラスミド、形質転換株、融合タンパク質に関
する。 β−エンドルフインは、31個のアミノ酸より構
成されるモルヒネ様生理活性を有するペプチドで
あり、下記アミノ酸配列を有する。 β−エンドルフイン：Tyr−Gly−Gly−Phe−
Met−Thr−Ser−Glu−Lys−Ser−Gln−Thr−
Pro−Leu−Val−Thr−Leu−Phu−Lys−Asn−
Ala−lle−lle−Lys−Asn−Ala−Tyr−Lys−
Lys−Gly−Glu 本発明の新規組換えプラスミドpENDB15は、
第１図において示されるDNA配列を有する。本
発明は、発酵工業、医薬品工業等の分野に好適で
ある。［従来の技術］ β−エンドルフインは、モルヒネ様生理活性を
示すエンドルフイン類に属するペプチドであり、
ロイシンエンケフアリンの約2340倍、メチオニン
エンケフアリンの約1560倍の鎮痛活性を示す興味
深い生理活性ペプチドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。遺伝子操作を利用したβ−エン
ドルフインの製造方法としては、Nagahariらの
方法が公知である（K.Nagahari et al.、Agric.
Biol.Chem.、vol.51、p.845−851（1987））。彼ら
の方法は、大腸菌のアントラニル酸合成酵素のア
ミノ末端から約62％までの部分と融合させて、菌
体内に不溶化物として蓄積させる方法である。彼
らの方法に従えば、効率よくβ−エンドルフイン
を含む融合タンパク質を生産することができる
が、作られた融合タンパク質が不溶性となるた
め、融合タンパク質の可溶化とか目的融合タンパ
ク質の高度精製などに間いて問題が考えられる。既に、本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉
酸還元酵素（以下、DHFRと略す。）遺伝子に関
して、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現
用プラスミドベクターpTP70−１（特開昭63−
46193号公報）と、それを利用した融合遺伝子の
作製方法（特開平１−144992号公報）を開発して
いる。また、pTP70−１にメチオニンエンケフ
アリン（以下、MEKと略す。）を暗号化する化学
DNAを組み込んで、MEKの効率よい生産方法を
開発している（特開平１−252289号公報）。効率
のよいMEKの生産方法を開発する際に得られた
組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素BamH
とXho部位の間の配列を異種DNAと取り替え
るだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成
できる。また、pMEK2利用して融合遺伝子を作
成した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融
合タンパク質は、不溶化することなく、かつ大腸
菌菌体の蓄積量としては全菌体タンパク質の約20
％が期待される。しかしながら、β−エンドルフ
インの生産に上記発現ベクターを用いた例はな
い。［発明の目的］本発明の目的は、DHFRとの融合遺伝子を作
製し、β−エンドルフインとの融合タンパク質を
大腸菌で作らせ、融合タンパク質の性質を利用
し、融合タンパク質の分離精製を効率的に行い、
高度精製した融合タンパク質を利用したβ−エン
ドルフイン生産方法を開発することにある。本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、β−エンドルフインを暗号化する遺伝子
を設計・化学合成し、pMEK2に組み込むことに
より、β−エンドルフイン遺伝子とDHFR遺伝
子との融合遺伝子に作成し、融合遺伝子を大腸菌
で発現させることにより、DHFR−β−エンド
ルフイン融合タンパク質（以下、融合タンパク質
と略す。）を大量に生産できることを見いだし、
さらに、融合タンパク質を用いることにより効果
的にβ−エンドルフインを作成できることを明ら
かにし、本発明を完成させた。［発明の構成］本発明は、(1)融合タンパク質の大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpENDB15、(2)
pENDB15を含有する大腸菌菌体、(3)pENDB15
を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、(4)
pENDB15を含有する大腸菌からの融合タンパク
質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質を用
いたβ−エンドルフインの製造方法、の発明によ
り構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpENDB15 第１図は、本発明のpENDB15の全塩基配列
を示している。図は、２本鎖環状DNAのうち
片方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２
箇所存在する制限酵素Cla部位のうち制限酵
素Hind部位に近い方の切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番として
数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpENDB15は、新規な組換えプラ
スミドである、pENDB15は、4718塩基対の大
きさであり、宿主である大腸菌にトリメトプリ
ムおよびアンピシリン耐性を付与することがで
きる。pENDB15は、pMEK2（特開平１−
25289号公報に記載。）のBamHとXho部
位の間のMEKを暗号化する配列を含む26塩基
対の配列を、β−エンドルフインを暗号化する
配列を含む104塩基対の化学合成DNAと置き換
えた構造をしている。第１図において、533番
目から636番目迄の配列が化学合成DNA由来の
配列である。それ以外の配列がpMEK2由来の
配列である。第１図の57番目から632番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にβ−エンドルフ
インがアルギニンArgを介して結合した融合タ
ンパク質を暗号化している。融合タンパク質を暗号化する配列の上流に
は、遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存
在する（特開昭63−46193号公報）。即ち、43番
目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれる
もので、効率の良い翻訳に、また、4675番目か
ら4704番目までが、コンセンサス転写プロモー
ターであり、効率の良い転写に貢献する。この
ことから、pENDB15は、大腸菌に導入された
場合、多量の融合タンパク質を作らせることが
できる。作られた融合タンパク質は、菌体内に
可溶性の状態で、菌体タンパク質の約20％程度
蓄積する。このことによつて、pENDB15を含
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すよう
になる。また、pENDB15は、pMEK1由来の
アンピシリン耐性遺伝子を有している。このこ
とから、pENDB15が導入された大腸菌は、ア
ンピシリン耐性をも示す。pENDB15は、大腸
菌に導入され安定状態に保たれ、pENDB15を
含有する大腸菌は、微工研にFERM BP−
2029として寄託されている。このような特長を有するpENDB15は、実施
例１に従つて作成することができるが、組換え
プラスミドの作成方法によつて本発明が制限さ
れるものではない。 (2) pENDB15を含有する大腸菌 pENDB15を含有する大腸菌は、トリメトプ
リム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pENDB15を含有する大腸菌は、融合タンパク
質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合タンパ
ク質を菌体内に可溶性で大量に蓄積する。
pENDB15を含有する大腸菌をYT＋Ap培地
（培地１中に、５ｇのNaCl、８ｇのトリプト
ン、５ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピ
シリンナトリウムを含む液体培地）を用いて、
37℃で定常期まで培養した場合、蓄積する融合
タンパク質は、菌体タンパク質の約20％に達す
る。培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩
衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波
破砕法で破砕し、これを遠心分離法により上清
と沈澱に分離した場合、全ての融合タンパク質
は上清中に回収される。pENDB15を含有する
大腸菌は、微工研にFERM BP−2029として
寄託されている。 (3) 融合タンパク質第２図は、融合タンパク質を暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。融合
タンパク質は、192アミノ酸よりなる新規なタ
ンパク質である。アミノ末端側から数えて、１
から159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつた
（Cys−１５２（Wild type）→Glu−１５２）
配列であり、162番目から192番目までがβ−エ
ンドルフインの配列である。β−エンドルフイ
ンの配列の直前のアミノ酸はアルギニンArgで
ある。β−エンドルフインはアルギニンを含ま
ない。ことことから、融合タンパク質をアルギ
ニルエンドペプチダーゼ
（Arginylendopeptidase、市販品として入手可
能）で処理することにより特異的に切り出すこ
とができる。160と161番目のイソロイシンIle
−ロイシンLeuの配列は、pMEK2のBamH
部位にβ−エンドルフインを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わ
せるために生じた配列である（pMEK2のもの
となつたpTP70−１が作るDHFRは、162個の
アミノ酸よりなり、第２図の融合タンパク質の
アミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数え
て、１から160番目までの配列に、Gln−lleの
２個のアミノ酸配列が結合した配列をしてい
る。）。融合タンパク質およびβ−エンドルフイ
ンの分子量は、それぞれ21741および3464であ
る。融合タンパク質は、新規なタンパク質であ
る。融合タンパク質はDHFRのカルボキシ末
端側に、β−エンドルフインが融合した構造を
しているにもかかわらず、DHFR酵素活性を
有する。このため、大腸菌が融合タンパク質を
多量につくると、DHFRの阻害剤であり抗細
菌剤であるトリメトプリムに対して、耐性を示
すようになる。 (4) 融合タンパク質の分離精製本発明の融合タンパク質の分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。菌体の培養 pENDB15を含有する大腸菌の培養は、
YT＋Ap培地（培地１中、５ｇのNaCl、
８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスお
よび50mgのアンピシリンナトリウムを含む液
体培地。）で培養することができる。培地と
しては、この他にST＋Ap培地（培地１中
に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリ
ウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイースト
エキスおよび50mgのアンピシリンナトリムを
含む液体培地。）など、菌体が成長する培地
であれば、どの様な培地でも用いることがで
きるが、調べた限りでは、YT＋Yp培地が
最適であつた。 pENDB15を含有する大腸菌を、培地に接
種し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常
期まで培養する。培養した菌体は、5000回
転／分の遠心分離により集める。培地１よ
り湿重量２から５ｇの菌体が得られる。集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。菌体の破砕培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナ
トリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレンチ
プレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕液
を、35000回転、１時間超遠心分離し、上清
を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理無細胞抽出液を、あらかじめ50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１で平衡化したDEAEトヨパー
ルカラムにかけ、カラム容量の50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出
は、緩衝液１を用いて50ｍＭから0.3Mの
KClの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集
める。 MTX結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合アガ
ロース−アフイニテイカラムに吸着させる。
吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1ｍＭ
EDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム緩衝
液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムからの
溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸光度
が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続ける。
酵素の溶出は、1MのKClと3mMの葉酸を含
む緩衝液２を用いて行い、溶出液を一定量ず
つフラクシヨンコレクターを用いて分画す
る。分画した溶出液についてDHFR活性を
測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。
得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３回
透析する。この段階で純度95％以上の融合タ
ンパク質が得られる。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、50ｍMKClを含む緩衝液１
で洗う。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて50
ｍＭから0.3MのKClの直線濃度勾配を用い
て行い、溶出液を一定量ずつフラクシヨンコ
レクターを用いて分画する。分画した溶出液
について280nｍの吸光度とDHFR活性とを
測定する。酵素活性／280nｍの吸光度の値
が、一定な画分を集める。以上の操作により、融合タンパク質の高度
精製均一化を、再現性良く行うことができ
る。本発明に従うと、融合タンパク質の精製
は、培養を含めて一週間以内に行うことがで
き、回収率40％以上で、均一な酵素商品を得
ることができる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジ
ヒドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの
２−メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸
緩衝液（PH7.0））を、１mlのキユベツトとな
り、これに酵素液を加え、340nｍの吸光度
の時間変化を測定することにより行う。酵素
１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測
定は、分光光度計を用いて容易に行うことが
できる。 (5) 融合タンパク質を用いたβ−エンドルフイン
の製造精製した融合タンパク質からのβ−エンドル
フインの切断・分離は、アルギニルエンドペプ
チダーゼ（Arginylendopeptidase、市販品と
して入手可能）で処理することにより行う。精
製した融合タンパク質１重量に対して、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ0.01重量の割合で加
え、37℃で50ｍＭ Tris−HC1緩衝液、PH8.5
中、24時間処理する。反応的に等量の50％酢酸
を加える。この試料を、HPLC装置（島津LC
−4A、inertsil−ODSカラム）を用いて、0.1％
トリフルオロ酢酸中、15％から50％のアセトニ
トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶
出物は220nｍにおける吸光度の測定により検
出することができる。第３図は、アルギニルエ
ンドペプチダーゼ処理した融合タンパク質試料
の高速液体クロマトグラムを示している。試料
注入後約26分後のピークがβ−エンドルフイン
である。このピーク画分を分離する。分離した
溶出液をエバホレーターで乾燥後、少量の水を
加え凍結乾燥し溶媒を除き、β−エンドルフイ
ンを得ることができる。また、得られたペプチ
ドを酸加水分解後、アミノ酸分析することによ
りアミノ酸組成を確かめることができる。本発明の実施例においては、３の培地から
湿重量約10ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上、約122mgの融合タンパク質、約19.4mgのβ
−エンドルフインを含む。）から、約53mgの融
合タンパク質（収率、43％、計算上約8.4mgの
β−エンドルフインを含む。）を精製して得る
ことができ、このうち、20mgの融合タンパク質
をアルギニルエンドペプチダーゼ処理後、
HPLCで分離・精製することにより、約0.6mg
のβ−エンドルフインを得ることができた。［発明の効果］本発明の、新規プラスミドpENDB15を含有す
る大腸菌を用いることにより、融合タンパク質を
容易にかつ高収率で分離精製することが得られる
こと、また；タンパク質分解酵素で処理すること
により融合タンパク質から効率よくβ−エンドル
フインを切り出すことができることからモルヒネ
様生理活性を有することが知られているβ−エン
ドルフインの生産に有効である。本発明の方法
は、Nagahariらがすでに報告している方法に比
較して、融合タンパク質が可溶性であること、ま
たDHFR酵素活性を有していることなど優れた
特質を有しておりはるかに優れている。次に本発明の実施例を示す。実施例１ pENDB15の作成 β−エンドルフインを暗号化するDNAとして
は、 1.5′−
GATCCGCTACGGCGGTTTCATGACCTCA
Ｇ−3′ 2.5′−AAAAATCACAGACCCCGCTG−3′ 3.5′−
GTGACTCTGTTCAAAAACGCAATCATC−
3′ 4.5′−
AAAAACGCATACAAAAAAGGTGAATAA
Ｃ−3′ 5.5′−TCGAGTTATTCACCTTTTTTG−3′ 6.5′−TATGCGTTTTTGATGATTG−3′ 7.5′−
CGTTTTTGAACAGAGTCACCAGCGGGG−
3′ 8.5′−
TCTGTGATTTTTCTGAGGTCATGAAACC
ＧＣＣＧＴＡＧＣＧ−3′ の８本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて、各DNAの5′末端をリン酸化した。リン
酸化したDNAを約0.1ml（約0.01μｇのDNAを含
んでいる。）ずつ取り、これを60℃でインキユベ
ートすることによつて両DNAをアニールさせた
（これをDNA−１と呼ぶ）。約1μｇのpMEK2を、BamHおよびXholで切
断した後、アルカリホスフアターゼ処理をした。
アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフエノ
ール処理することにより、共存する酵素タンパク
質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈
澱させた。沈澱したDNAを70％エタノールで洗
つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥
させた。BamHおよびXhoによるDNAの切
断、アルカリホスフアターゼ処理、フエノール処
理、およびエタノール沈澱の各操作は、いずれ
も、“Molecular Cloning Ａ Loboratory
Manual”（T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.
Sambrook、eds.Cold Spring Harbor
Laboratory（1982）、以下、文献１と呼ぶ。）に記
載している方法に従つて行つた。乾燥させた
DNAを50μのリガーゼ用反応液（10ｍＭ
Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl₂、10ｍＭジ
チオトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶解後、
5μのDNA1を加え、これに１ユニツトのT4−
DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法
（trans−formation method、上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌HB101株に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天培地（培地１中に、２ｇのグルコー
ス、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエ
キス、５ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
６個のコロニーを得ることができた。これらのコ
ロニーを、1.5mlのYT＋Ap培地（培地１中に、
５ｇのNaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇのト
リプトン、50mgのアンピシリンナトリウムを含
む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。培養液
を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、12000回
転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として集
めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調整
液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウリ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、
５％の２−メルカプトエタノール、0.001％のブ
ロムフエノールプルーを含む。）を加え、菌体を
懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶
かした。この処理をしたサンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（U.K.Lammli；
Nature、vol.227、p.680（1970））に従つて分析し
た。標準サンプルとしてpMEK2を含有する大腸
菌に同様な処理をしたもの、および分子量マーカ
ーとしてラクトアルブミン（分子量14200）、トリ
プシンインヒビター（分子量20100）、トリプシノ
ーゲン（分子量24000）、カルボニツクアンヒドラ
ーゼ（分子量29000）、グリセロアルデヒド３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブ
ミン（分子量45000）、および牛血清アルブミン
（分子量66000）を含むサンプルをポリアクリルア
ミド濃度の10から20％濃度勾配ゲルで泳動した。
その結果、すべてのコロニーにおいて、pMEK2
のDHFR−MEK融合タンパク質のバンドが消失
し、それより明らかに分子量が大きくなつたタン
パク質（分子量約26000と推定される。）が認めら
れた。pMEK2のDHFR−MEK融合タンパク質
（分子量、18963）は、この条件で分子量約22000
のタンパク質として泳動する。得られた６個のコ
ロニーから適当に一株を選び、これをYT＋Ap
培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol.121、p.354（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpENDB15と名
づけた。pENDB15は、pMEK2のBamHと
Xhoとの間の配列が、化学合成したDNA配列
と起き変わつた構造をしているはずである。
pENDB15のEcoR（第１図の471−476番目の
配列）とSal（第１図の935−940番目の配列）
による切断によつて得られる約400ヌクレオチド
長のDNAについて、M13フアージを用いたジデ
オキシ法（J.Messing；Mehtods in
Enzymology、vol.101、p.20（1983））に従つて、
塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す配
列の471番目から約940番目迄の配列が確かめられ
た。塩基配列を検討することにより、pENDB15
が融合タンパク質を暗号化することが明らかとな
つた。 pMEK2の塩基配列は、本発明者らによつて明
らかにされている（特開平１−252288号公報）。
また、pENDB15のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Hpa、Aat．Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて得ら
れる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。以上の結果から、pENDB15の全塩基配列が第
１図に示した配列であることが決められた。実施例２ pENDB15を含有する大腸菌が作る融合タンパ
ク質 pENDB15を含有する大腸菌が作る融合タンパ
ク質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第１図の57番目から632番
目の配列が融合タンパク質を暗号化していること
から、トリプレツト暗号表を用いて、アミノ酸配
列を推定した。その結果第２図に示すアミノ酸配
列が得られた。 pENDB15を含有する大腸菌から、融合タンパ
ク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質を
調べた。融合タンパク質の精製Ａ用いた菌体量：質重量 10ｇＢ酵素精製表表における精製過程は無細胞抽出液、
DEAE−トヨパールカラム処理、メソトリキ
セート結合アフイニテイクロマトグラフイー、
およびDEAE−トヨパールカラムクロマトグ
ラフイーを表す。

【表】得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
分子量約26000の単一なタンパク質バンドが示さ
れ、得られた酵素標品が均一であることが示され
た。分離精製した融合タンパク質の性質精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、β
−エンドルフインに対する抗体と反応することが
示された。即ち、精製して得られたタンパク質は
免疫学的にβ−エンドルフインと同等の構造を含
んでいることが明らかとなつた。精製して照られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシペプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Gly−Glu（カルボキシ末端）であることが予想
された。また、精製して得られたタンパク質を酸
加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基
配列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結
果が得られた。実施例３精製分離した融合タンパク質からのβ−エンド
ルフインの分離実施例２で得られた２mlの精製均一化した融合
タンパク質の溶液（緩衝液１中、約20mg、約
1000nmoleの融合タンパク質を含む）に、0.2mg
のアルギニルエンドペプチダーゼを加え、37℃で
24時間反応させる。反応後、１mlの酢酸を加え
る。そのうちの、0.5ml（約167nmoleの融合タン
パク質を含むはず）をとり、高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−4A）を用いlnertsil−
ODS5μｍカラムで分離した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（15
％から50％）をかけることにより行つた。０から
２分までは、15％のアセニトリルを用い、２分か
ら32分までは、15％から50％のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。その結果、第３図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約26分後
のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバホ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチドを
酸加水分解後、その５分の１をアミノ酸分析に用
いた。その結果、アスパラギン酸、スレオニン、
セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、ア
ラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フエニルアラニン、およびリ
ジンがそれぞれ、11.4、16.3、11.0、18.2、5.8、
17.6、11.6、5.7、5.7、11.7、12.1、11.1、11.4お
よび26.5nmolずつ検出された。アミの酸組成は、
β−エンドルフインのそれと一致した。また、ア
ミノ酸分析に用いた標品は、約5.7nmole（約19.7μ
ｇ）のβ−エンドルフインを含んでいたことにな
る。この結果から、精製均一化した融合タンパク
質を用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
した標品をHPLCを用いて分離することにより収
率約19％でβ−エンドルフインを回収できること
が明らかとなつた。融合タンパク質の精製の収率
が約43％であり、融合タンパク質からのβ−エン
ドルフインの分離の収率が約19％であることか
ら、大腸菌がつくるβ−エンドルフインの単離収
率が約８％であると計算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pENDB15の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pENDB15に２箇所存在
する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限酵素
Hind切断部位に近い方のCla切断認識部位
の、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番
として数えた番号を示している。第２図は、
pENDB15中に存在する融合タンパク質を暗号化
する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およ
びアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシ
ンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Alaはア
ラニンを、Argはアルギニンを、Asnはアスパラ
ギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cysはシステ
インを、Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン
酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチジンを、
Ileはイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysは
リジンを、Metはメチオニンを、Pheはフエニル
アラニンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、
Thrはトレオニンを、Trpは、トリプトフアン
を、Tyrはチロシンを、Valはバリンを示してい
る。図中番号は、１番目のアミノ酸であるメチオ
ニンを暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番と
して数えた番号を示している。第３図は、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ処理した融合タンパク質
試料の高速液体クロマトグラムを示している。横
軸は試料注入後の時間を分単位で、横軸は、
220nｍの吸光度を任意単位で表現している。矢
印で示したピークがβ−エンドルフインの溶出ピ
ークである。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、4718塩基対の大きさを
有し、下記に示すDNA配列を有する新規組換え
プラスミドpENDB15。【表】【表】【表】【表】【表】２ pENDB15を含有する大腸菌。３ pENDB15を含有する大腸菌が生産し、下記
に示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
素−β−エンドルフイン融合タンパク質。【表】４ pENDB15を含有する大腸菌を培養し、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還
元酵素−β−エンドルフイン融合タンパク質を、
培養菌体の無細胞抽出液から、メソトリキセート
結合アフイニテイカラムクロマトグラフイー、お
よび陰イオン交換カラムクロマトグラフイーを用
いて精製することを特徴とするジヒドロ葉酸還元
酵素−β−エンドルフイン融合タンパク質の分離
精製方法。５ pENDB15を含有する大腸菌の生産するジヒ
ドロ葉酸還元酵素−β−エンドルフイン融合タン
パク質を分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元
酵素−β−エンドルフイン融合タンパク質をタン
パク質分解酵素で消化した後、β−エンドルフイ
ンを分離精製することを特徴とするβ−エンドル
フインの製造方法。