JPH0355113B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有する
ことが知られている牛成長ホルモン放出因子（以
下、GRFと略す。）の27番目のアミノ酸であるメ
チオニンがイソロシンに変換した誘導体をカルボ
キシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、DHFRと略す。）の生産を可能とする新規組
換えプラスミドに関するものである。pGRFM44
−６は第２図に示されるDNA配列を有する。
pGRFM44−６およびpGRFM44−６を含有する
大腸菌は、発酵工業、医薬品工業等の分野に好適
である。

［従来の技術および問題点］ GRFは生長ホルモンの分泌を促すペプチドで
ある。牛のGRFは44個のアミノ酸からなり、そ
の配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−
アスパラギン酸−アラニン−イソロイシン−フエ
ニルアラニン−トレオニン−アスパラギン−セリ
ン−チロシン−アルギニン−リジン−バリン−ロ
イシン−グリシン−グルタミン−ロイシン−セリ
ン−アラニン−アルギニン−リジン−ロイシン−
ロイシン−グルタミン−アスパラギン酸−イソロ
イシン−メチオニン−アスパラギン酸−アルギニ
ン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタ
ミン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン
−グルタミン酸−グルタミン−グリシン−アラニ
ン−リジン−バリン−アルギニン−ロイシンであ
り、カルボキシ末端がアミド化されている。

GRFは、視床下部に存在するが、その含量は
少なく、牛500頭からせいぜい数ミリグラム程度
分離精製できればよい方であり、効率のよい生産
方法の開発が期待されている。

GRFのアミノ酸配列とその生理活性にとの関
係に関しては種々の研究成果が報告されている
（N.Ling，et al.Annu.Rev.Biochem.，vol.54，
p.403（1985））。GRFの27番目のアミノ酸である
メチオニンは生理活性発現には重要な役割を果し
ておらず、このアミノ酸をイソロイシンとかロイ
シンに交換しても問題がないことが明らかにされ
ている。（G.M.Clore、et al.、J.Mol.Biol.、
vol.191、p.553（1986））。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
伴つて興味深いポリペプチドを微生物をもちいて
生産することが可能になつた。ポリペプチドに対
応する遺伝子であるDNAを、例えば生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどし、そ
の後、これを発現ベクターと呼ばれる適当なプラ
スミドなどに組み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入
し、目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物か
ら目的ポリペプチドを分離精製することが行われ
ている。このような状況においては、目的ポリペ
プチド遺伝子を含み、且つ効率よく発現させる組
換えプラスミドを構築することが最も重要な課題
である。また、目的ポリペプチドが異なれば自ず
からその方法論が異なつており、この点が解決し
なければならない技術課題である。

すでに本発明者らは、GRFの１番目から29番
目までのアミノ酸配列を有するGRF誘導体を暗
号化するDNAを組み込んだ組換えプラスミド
pGRF28−29（特開昭62−115287）およびpGRF2
−15（特開平１−144978号公報）およびpSG1−12
（特許出願中）の構築に成功している。しかしな
がら、44個のアミノ酸よりなるGRFの誘導体を
組み込んだ組換えプラスミドについては知られて
いない。

［発明の目的］ 本発明者らは、44個の長さよりなるGRFの誘
導体の生産を可能とする組換えプラスミドの開発
を目的に行われた。

本発明者らは鋭意研究を行つた結果、GRFの
１番目から29番目までのアミノ酸配列を有する
GRF誘導体とDHFRとの融合タンパク質を大量
に発現する上記組換えプラスミドpSG1−12を利
用することを考案し、そのことに基づき本発明を
完成させた。

［発明の構成］ 第１図は、本発明の組換えプラスミド
pGRFM44−６がつくる組換えタンパク質である
DHFRと、44個のアミノ酸よりなるGRFの誘導
体（以下、GRFMと略す）との、融合タンパク
質（以下、DHFR−GRFと略す）のアミノ酸配
列およびそれを暗号化するDNA塩基配列を示し
ている。DHFR−GRFは、206アミノ酸よりなる
タンパク質である。このうちアミノ末端側から数
えて、１から159番目までの配列が、大腸菌の野
生型DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつ
た（Cys−152（wild type）→Clu−152）配列で
あり、163から206番目迄がGRFMの配列である。
GRFMは牛のGRFの27番目のアミノ酸であるメ
チオニンがイソロイシンに置換し、かつカルボキ
シ末端のアミノ酸であるロイシンがアミド化され
ていない配列を有するGRF誘導体である。160番
目から162番目がDHFRとGRFMとを結合するア
ミノ酸配列であるが、このうち162番目のアミノ
酸がメチオニンであり、ブロムシアンで処理する
ことによりGRFMを切り出すことを可能にして
いる。第２図は、本発明のpGRFM44−６の全塩
基配列を示している。図は、２本鎖DNAのうち
片方のDNA鎖配列だけを、5′末端から3′末端の
方向に記述している。また、pGRFM44−６は環
状DNAであるが記述の都合上、直鎖状で現して
いる。従つて、最初と最後のが隣あつて存在する
ことになる。pGRFM44−６は、4760塩基対の大
きさであり、宿主である大腸菌にトリメトプリム
およびアンピシリン耐性を付与することができ
る。pGRFM44−６は、大腸菌に導入されて安定
状態に保たれ、pGRFM44−６を含有する大腸菌
は、微工研にFERM BP−2152として寄託され
ている。

pGRFM44−６は、DHFR−GRFを暗号化す
る配列を含む。第２図において、57番目から674
番目迄の配列がDHFR−GRFを暗号化する配列
である。DHFR−GRFを暗号化する配列の上流
には、この遺伝子の発現を効率良く行わせる配列
が存在する。（特開昭63−46193号公報）。即ち、
43番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれ
るもので、効率の良い翻訳に、また、4718番目か
ら4746番目までが、コンセンサス転写プロモータ
ーであり、効率の良い転写に貢献する。このこと
から、pGRFM44−６は、大腸菌に導入された場
合、多量のDHFR−GRFを作る。作られた
DHFR−GRFは菌体内に多量に蓄積し、その量
は菌体タンパク質の15〜20％にいたる。また、蓄
積したDHFR−GRFはジヒドロ葉酸還元酵素活
性を示し、このことによつて、pGRFM44−６を
保持する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すよう
になる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 pGRFM44−６の作成 pGRFM44−６は、すでに本発明者らが作製し
ている組換えプラスミドpSG1−12と化学合成
DNAを用いることにより作製した。

pSG1−12は、DHFRと牛GRFの１番目から29
番目までのアミノ酸配列を有するGRF誘導体と
の融合タンパク質を大量に発現する組換えプラス
ミド（特開平２−138981号公報）であり、第２図
で示される配列の630番目から674番目までの45塩
基対の配列が欠落した構造をしている。

化学合成DNAとしては、GRFの29番目から44
番目までのアミノ酸配列を暗号化する配列に、
pSG1−12の制限酵素切断部位を利用できる様に
するために必要な配列を含ませるように以下に示
すように設計した。

1.5′−ATCATCAACCGTCAGCAGGGTG−
3′ 2.5′−
AATCTAACCAGGAACGTGGTGCTCGAGC
ＴＣＧＴＣＴＧＴＡＡＣ−3′ 3.5′−
TCGAGTTACAGACGAGCTCGAGCACCAC
ＧＴＴＣＣ−3′ 4.5′−
TTGGTTAGATTCACCCTGCTGACGGTTG
ＡＴＧＡＴ−3′ 設計した上記４本のDNAをホスホアミダイト
法に従つて化学合成した。（図２の618番目から
678番目までの配列に相当する）。

pSG1−12を制限酵素EcoRVとXhoを用いて
切断することによつて得られる２本のDNA断片
のうち長い方のDNA断片（図２の618番目から
678番目まで配列を除いた配列に相当する）と、
化学合成した４本のDNAの5′末端をリン酸化し
た後、アニールしたものとを混合し、T4−DNA
リガーゼを利用して結合した。このような操作
は、いずれも、“Molecular Cloning Ａ
Loboratory Manual”（T.Maniatis 、E.F.
Fritsch、J.Sambrook、eds.Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）、以下、文献１と呼
ぶ）に記載している方法に従つて行つた。得られ
た反応物を、形質転換法（transformation
method、上記文献１に記載）に従つて、大腸菌
に取り込ませた。この処理をした菌体を、50mg／
１のアンピシリンナトリウムおよび２mg／のト
リメトプリムを含む栄養寒天培地（培地11中に、
２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５
ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、15ｇ
の寒天を含む。）上に塗布し、37℃で24時間培養
することにより、100以上のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に20個選
び、1.5mlのYT＋Ap培地（培地11中に、５ｇの
NaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプト
ン、50mgのアンピシリンナトリウムを含む。）で、
37℃、１晩、菌体を培養した。培養液を、各々エ
ツペンドルフ遠心管にとり、12000回転／分で10
分間遠心分離し、菌体を沈澱として集めた。これ
に、0.1mlの電気泳動用サンプル調整液
（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウリル
硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、５
％の２−メトカプトエタノール、0.001％のブロ
ムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を懸
濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルをSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（U.K.Laemmli；
Nature、vol.227、p.680−685（1970））に従つて
分析した。分子量マーカーとしてラクトアルブミ
ン（分子量14200）、トリプシンインヒビター（分
子量20100）、トリプシノーゲン（分子量24000）、
カルボニツクアンヒドラーゼ（分子量29000）、グ
リセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（分子量36000）、卵アルブミン（分子量45000）、
および牛血清アルブミン（分子量66000）を含む
サンプルをポリアクリルアミド濃度の10から20％
濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、20個のコロ
ニーのうち、２個では分子量が大きくなつたタン
パク質（分子量約26000と推定される。）を新たに
大量に生産していることが明かとなつた。デンシ
トメーターで分析することにより、新たな現れた
タンパク質の量は菌体タンパク質の約20％である
ことが推定された。

分子量の大きい新たなタンパク質を生産するコ
ロニーのうちから適当に一つ選び、これをYT＋
Ap培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法
（T.Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol.121、p.354（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpGRFM44−６
と名づけた。得られたプラスミドを再び大腸菌に
導入したところ、pGRFM44−６とまつたく同じ
性質を有する形質転換株が、10⁵〜10⁶／μｇプラ
スミドDNAの頻度で得られた。このことは、
pGRFM44−６の性質が安定していることを示し
ている。また、pGRFM44−６が大腸菌菌体内で
安定に複製されることを示している。

pGRFM44−６は、pSG1−12のEcoRVとXhoI
部位との間の配列が合成DNA由来の配列と置き
換わつた配列をしているはずてある。pGRFM44
−６をEcoRIとSalIによる切断によつて得られる
約500ヌクレオチド長のDNAについて、M13フア
ージを用いたジデオキシ法（J.Messing；
Mehtods in Enzymol−ogy、vol.101、p.20
（1983））に従つて塩基配列を決定した。その結
果、第２図に示すpGRFM44−６の全塩基配列の
471番目から982番目の配列が明らかにされた。

また、pGRFM44−６のEcoR−SalI切断に
よつて得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst
、Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl、
およびClaを用いた制限酵素による切断実験の
結果、pSG1−12のEcoR−SalI切断によつて得
られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一である
ことが示された。

以上の結果から、pGRFM44−６の全塩基配列
が第２図に示した配列であることが明らかであ
る。

［発明の効果］ 上記のように、新規組換えプラスミド
pGRFM44−６は、DHFR−GRFを暗号化して
おり、かつpGRFM44−６を有する大腸菌は、
DHFR−GRFを大量に蓄積生産する。さらに、
生成したDHFR−GRFは、DHFRとGRFMとが
メチオニンを介して結合した構造をしており、ブ
ロムシアン処理により容易に両者の分離が可能で
ある。このような性質を有することから、本発明
の新規組換えプラスミドpGRFM44−６およびそ
れを有する大腸菌は、DHFR−GRFの生産、お
よびそれを利用したGRFMの生産に有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pGRFM44−６中に存在するDHFR
−GRFを暗号化する部分の塩基配列およびタン
パク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号
は、核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニ
ンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン
酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Cluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisは
ヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイ
シンを、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、
Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはト
リプトフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリ
ンを示している。図中番号は、１番目のアミノ酸
であるメチオニンを暗号化するATGコドンの
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。第
２図は、pGRFM44−６の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを、5′末端から3′末端の方向に記述している。
図中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、
Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを
示している。図中番号は、pGRFM44−６に２箇
所存在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制
限酵素Hind切断部位に近い方のCla切断認識
部位の、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を
１番として数えた番号を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
   大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
   耐性を与えることができ、下記の記１に示すアミ
   ノ酸配列を有する牛成長ホルモン放出因子の誘導
   体とジヒドロ葉酸還元酵素との融合タンパク質を
   暗号化し、下記の記２に示すDNA配列を有する
   新規組換えプラスミドpGRFM44−６。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
   大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
   耐性を与えることができ、下記の記１に示すアミ
   ノ酸配列を有する牛成長ホルモン放出因子の誘導
   体とジヒドロ葉酸還元酵素との融合タンパク質を
   暗号化し、下記の記２に示すDNA配列を有する
   新規組換えプラスミドpGRFM44−６を含有する
   大腸菌。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】