JPH0371113B2

JPH0371113B2 -

Info

Publication number: JPH0371113B2
Application number: JP30215687A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Iwakura; Tomokuni Kokubu; Kyotaka Furusawa; Shinichi Oohashi; Tsukasa Sakai; Yoshio Tanaka
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1987-11-30
Filing date: 1987-11-30
Publication date: 1991-11-12
Also published as: JPH01144978A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有する
ことが知られている牛成長ホルモン放出因子（以
下、GRFと略す。）のうち、一番目から29番目迄
のペプチドフラグメントをカルボキシ末端側に有
するジヒドロ葉酸還元酵素の生産を可能とする新
規組換えプラスミドに関するものである。

本発明の新規組換えプラスミドpGRF2−15は、
第１図に示されるDNA配列を有する。pGRF2−
15およびpGRF2−15を含有する大腸菌は、発酵
工業、医薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術および問題点本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に
伴つて興味深いポリペプチドを微生物をもちいて
生産することが可能となつた。ポリペプチドに対
応する遺伝子であるDNAを、例えば生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどし、そ
の後、これを発現ベクターと呼ばれる適当なプラ
スミドなどに組み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入
し、目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物か
ら目的ポリペプチドを分離精製することが行われ
ている。このような状況においては、目的ポリペ
プチド遺伝子を含み、且つ効率よく発現させる組
換えプラスミドを構築することが最も重要な課題
である。また、目的ポリペプチドが異なれば自ず
からその方法論が異なつており、この点が解決し
なければならない技術課題である。

GRFは成長ホルモンの分泌を促すペプチドで
ある。牛のGRFは44個のアミノ酸からなり、そ
の配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−
アスパラギン酸−アラニン−イソロイシン−フエ
ニルアラニン−トレオニン−アスパラギン−セリ
ン−チロシン−アルギニン−リジン−バリン−ロ
イシン−グリシン−グルタミン−ロイシン−セリ
ン−アラニン−アルギニン−リジン−ロイシン−
ロイシン−グルタミン−アスパラギン酸−イソロ
イシン−メチオニン−アスパラギン酸−アルギニ
ン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタ
ミン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン
−グルタミン酸−グルタミン−グリシン−アラニ
ン−リジン−バリン−アルギニン−ロイシンであ
り、カルボキシ末端がアミド化されている。
GRFは、視床下部に存在するが、その含量は少
なく、牛500頭からせいぜい数ミリグラム程度分
離精製できればよい方であり、効率のよい生産方
法の開発が期待されている。牛GRFとその構造
が極めてよく似たヒトGRFは、44個のアミノ酸
よりなるが、このうち一番目のチロシンから29番
目のアルギニンまでのペプチド部分（以下、
GRF1−29と示す。）だけでも、GRFの約４分の
１の活性を持つことが報告されている（N.Ling
et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，
vol.123，pp.854（1984））。

GRF1−29を暗号化するDNAを組み込んだ組
換えプラスミドについては、本発明者らが構築し
たpGRF29−28が公知である（特開昭62−
115287）。しかしながら、pGRF29−28を組み込
んだ大腸菌においては、目的ポリペプチドが発現
されるが、その量は、ラジオイムノアツセイの結
果大腸菌体１グラム当たり50ナノグラムと推定さ
れ（特開昭62−115287号公報）、非常に少なく、
実用に供するには問題があつた。

一般に、分子量１万以下のポリペプチドは、大
腸菌などの宿主中で生産させても菌体中のプロテ
アーゼなどによつて分解されるため安定に細胞内
に蓄積されない。これは、分子として小さいため
安定なコンホメーシヨンをとれないためであると
考えられている。従つて、遺伝子操作を利用して
GRF1−29などの短いポリペプチドを生産しよう
とした場合、融合遺伝子を作成し、融合タンパク
質として発現させることが必要であると考えられ
る。

発明の目的本発明の目的は、上記の問題点を解決するため
に、GRF1−29の大量生産を可能にする組換えプ
ラスミドを開発することにある。また、本発明
は、遺伝子操作の手法を用いてGRF1−29を大量
に生産する方法の開発の一環として行われたもの
である。

本発明者らは、既に本発明者らが(1)大腸菌の
DHFRを大量に発現する発現プラスミドを構築
していること（特開昭62−69990号公報）、(2)大腸
菌のDHFRのカルボキシ末端側の配列を変化さ
せても、枯草菌のDHFR同様酵素活性が失われ
ないこと、(3)大腸菌のDHFRのカルボキシ末端
側に異種ペプチドを融合させることを可能とする
プラスミドベクターpTP70−１を構築している
こと（特開昭63−46193号公報）(4)pTP70−１上
の改変DHFRは、大腸菌で効率良く発現するこ
と、を明らかにしている。

本発明者らがすでに明らかにしている上記の特
徴を利用し、鋭意研究を行つた結果、pTP70−
１を用いることにより、DHFR遺伝子の3′末端側
にGRF1−29遺伝子を結合し、組換えプラスミド
を作成し、これを大腸菌に導入し、発現させるこ
とにより、DHFRのカルボキシ末端側にGRF1−
29が結合した融合タンパク質が、大腸菌で安定に
発現・蓄積することを見いだし、その知見に従つ
て、pTP70−１にGRF1−29遺伝子を組み込んだ
組換えプラスミドpGRF2−15を作成し、本発明
を完成させた。

発明の構成第１図は、本発明の組換えプラスミドpGRF2
−15の全塩基配列を示している。本発明の
pGRF2−15は、4715塩基対の大きさであり、宿
主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。pGRF2−15
は、E.coli C600株に導入されて安定状態に保た
れ、pGRF2−15を含有するE.coli C600株は、微
工研にFERMBP−1578として寄託されている。

pGRF2−15は、pTP70−１のBamHI切断部位
に、GRF1−29を暗号化する配列を含む107塩基
対のDNAが挿入した構造である。第１図におい
て、533番目から639番目迄の配列が挿入された配
列であり、それ以外の配列がpTP70−１の配列
と全く同一である。第１図の57番目から635番目
の配列は、pTP70−１の改変DHFRのカルボキ
シ末端側にGRF1−29がイソロイシン−グルタミ
ン酸−グリシン−アルギニンよりなる４つのアミ
ノ酸よりなる配列を介して結合した融合タンパク
質（以下、DHFR−GRF1−29と記す。）を暗号
化する。第２図は、DHFR−GRF1−29を暗号化
する部分のDNA配列とそれから作られるタンパ
ク質のアミノ酸配列を示している。DHFR−
GRF1−29は、193アミノ酸よりなるタンパク質
であり、このうちアミノ末端側から数えて、１か
ら159番目までの配列が、大腸菌の野生型DHFR
に１箇所アミノ酸置換置換が起こつた（Cys−
152（wild type）→Glu−152）配列であり、161
から164番目のイソロイシン−グルタミン酸−グ
リシン−アルギニンの配列は、牛血液凝固因子
Xaの認識切断配列であり、最終的に牛血液凝固
因子Xaで処理することにより、GRF1−29ペプ
チドを切り出すことを可能とする配列である。
160番目の配列は、pTP70−１のDHFR由来のア
ミノ酸である。165から193番目迄がGRF1−29の
配列である。pTP70−１が作る改変DHFRは、
162個のアミノ酸よりなり、第２図のDHFR−
GRF1−29のアミノ酸配列のうち、アミノ末端側
から数えて、１から160番目までの配列に、Gln
−lleの２個のアミノ酸配列が結合した配列をし
ている。

DHFR−GRF1−29は、pTP70−１の改変
DHFRのカルボキシ末端側に、GRF1−29が融合
した構造をしているためにもかかわらず、
DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌が
DHFR−GRF1−29を多量につくると、DHFRの
阻害剤であり、抗細菌剤であるトリメトプリムに
対して、耐性を示すようになる。

DHFR−GRF1−29を暗号化する配列の上流に
は、pTP70−１の改変DHFR遺伝子の発現を効
率良く行わせる配列が存在する（特開昭63−
46193号公報）。即ち、43番目から50番目までの配
列がSD配列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳
に、また、4674番目から4701番目までが、コンセ
ンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写
に貢献する。また、pTP70−１は、抗菌剤であ
るアンピシリンに対して耐性を付与する遺伝子を
有しており、その遺伝子の発現は、pTP70−１
のBamHl部位に異種DNAが挿入されても影響を
受けない。このことから、pTP70−１のBamHl
部位に、GRF1−29を暗号化するDNA配列が挿
入した構造をしているpGRF2−15は、大腸菌に
導入された場合、多種のDHFR−GRF1−29を作
る。作られたDHFR−GRF1−29は、菌体内に可
溶性の状態で、菌体タンパク質の15〜20％にいた
るまで蓄積する。湿重量１グラムの大腸菌は約
150ミリグラムのタンパク質を含むことから、こ
の値は、pGRF2−15を有する大腸菌菌体の湿重
量１グラム中に22〜30ミリグラムののDHFR−
GRF1−29が蓄積することを意味する。また、
DHFR−GRF1−29タンパク質中、GRF1−29部
分が約15％であることから、GRF1−29換算で3.3
〜4.5ミリグラムのペプチドが蓄積していること
になる。pGRF29−28を組み込んだ菌体の場合
は、約50ナノグラムであつたことと比較すると、
約10万倍生産効率が向上している。pGRF29−28
を用いた場合は、GRF1−29ペプチドが直接菌体
内に発現したため、菌体中のタンパク質分解酵素
の働きにより速やかに分解され、有為な蓄積が認
められなかつたと推定される。一方、GRF1−29
ペプチドをDHFRのカルボキシ末端側に融合さ
せた形で発現させることにより、タンパク質分解
酵素による分解に対して抵抗性が付与され菌体内
に融合タンパク質が大量に蓄積したものと考えら
れる。このことは、融合タンパク質がDHFR酵
素活性を示すことからも示唆される。このことに
よつて、pGRF2−15を有する大腸菌はトリメト
プリム耐性を示すようになる。また、pGRF2−
15は、pTP70−１由来のアンピシリン耐性を付
与する遺伝子を有することから、pGRF2−15が
導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示
す。

このような特長を有するpGRF2−15は、実施
例に従つて作成することができるが、組換えプラ
スミドの作成方法によつて本発明が制限されるも
のではない。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 pGRF2−15の作成 GRF2−15を暗号化するDNAとしては、すで
に本発明者らが構築している、プラスミド
pGRF29−28（特開昭62−115287に記載。）のBclI
切断によつて得られる107塩基対のDNA断片（第
１図の533から639番目までの配列）を用いた。

dam^-株である大腸菌GM33にpGRF29−28を
形質導入し、pGRF29−28を含有するGM33株か
ら分離したpGRF29−28、約5μgをBclIで切断し
た後、DNAをフエノール処理するすることによ
り、共存する酵素タンパク質を変性除去し、その
後エタノールでDNAを沈澱させた。沈澱した
DNAを70％エタノールで洗つた後、エタノール
を除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。乾燥させた
DNAをアガロースゲル電気泳動用のサンプル用
緩衝液に溶解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、107塩基対のDNA断片を分離した（これを
DNA−１と呼ぶ。）。

GRF1−19を暗号化したDNAを組み込むベク
ターとしては、pTP70−１を用いた（特願昭61
−312836）。約1μgのpTP70−１を、BamHIで切
断した後、アルカリホスフアターゼ処理をした。
アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフエノ
ール処理することにより、共存する酵素タンパク
質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈
澱させた。沈澱したDNAを70％エタノールで洗
つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥
させた。BclIおよびBamHIによるDNAの切断、
アガロースゲル電気泳動、アガロースゲルからの
DNAの抽出、アルカリホスフアターゼ処理、フ
エノール処理、およびエタノール沈澱の各操作
は、いずれも、“Molecular Cloning Ａ
Loboratory Manual”（T.Maniatis，E.F.
Fritsch，J.Sambrook，eds.Cold Spring
Harbor Laboratory（1982），以下、文献１と呼
ぶ。）に記載している方法に従つて行つた。乾燥
させたDNAを50μlのリガーゼ用反応液（10mM
Tris−HCl，PH〓４，5mM MgCl₂，10mMジチ
オトレイトール，5mM ATP）溶解後、5μlの
DNA1を加え、これに１ユニツトのT4−DNAリ
ガーゼを加えて、15℃で、４時間DNAの連結反
応を行わせた。この反応物を、形質転換法
（transformation method，上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌に取り込ませた。この処理をし
た菌体を、50mg／１のアンピシリンナトリウムお
よび２mg／１のトリメトプリムを含む栄養寒天培
地（培地11中に、2gのグルコース、1gのリン酸
２カリウム、5gのイ−ストエキス、5gのポリペ
プトン、15gの寒天を含む。）上に塗布し、37℃
で24時間培養することにより、約50のコロニーを
得ることができた。これらのコロニーから適当に
20個選び、1.5mlのYT＋Ap培地（培地11中に、
5gのNaCl、5gのイーストエキス、8gnのトリプ
トン、50mgのアンピシリンナトリウムを含む。）
で、37℃、１晩、菌体を培養した。培養液を、
各々エツペンドルフ遠心管にとり、12000回転／
分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として集め
た。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調整液
（0.0625MのTris−HCl，PH6.8、２％のラウリル
硫酸ナトリウム（SDS），10％グリセリン、５％
の２−メルカプトエタノール−、0.001％のプロ
ムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を懸
濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルをSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（U.K.Lammli；
Nature，vol，227，p.680−685（1970）に従つて
分析した。標準サンプルとしてpTP70−１を含
有する大腸菌に同様な処理をしたもの、および分
子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子量
14200）、トリプシンインヒビター（分子量
20100）、トリプシノーゲン（分子量24000）、カル
ボニツクアンヒドラーゼ（分子量29000）、グリセ
ロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子
量36000）、卵アルブミン（分子量45000）、および
牛血清アルブミン（分子量66000）を含むサンプ
ルをポリアクリルアミド濃度の10から20％濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、20個のコロニーの
うち、２個ではpTP70−１のDHFRのバンドが
消失し、それより明らかに分子量が大きくなつた
タンパク質（分子量約24000）と推定される。）を
新たに生産していること、残りの18個のコロニー
は、pTP70−１のDHFRとほぼ同じ大きさのタ
ンパク質を生産すること、pTP70−１のDHFR
（分子量18379）は、この条件で分子量約21000の
タンパク質として泳動することが明らかになつ
た。また、このDHFR−GRF1−29のタンパク質
と考えられるタンパク質のバンドは全タンパク質
バンドの約20％程度であつた。分子量の大きい新
たなタンパク質を生産するコロニーのうちから適
当に一つ選び、これをYT＋Ap培地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法（T.Tanaka，B.
Weisblum；J.Bacteriology，vol.121，p.354
（1975）に従つて、プラスミドを調整した。得ら
れたプラスミドをpGRF2−15と名づけた。
pGRF2−15は、pTP70−１のBamHI部位に合成
DNAが挿入された構造をしているはずであるの
で、pGRF2−15をEcoRIとSalIによる切断によ
つて得られる約400ヌクレオチド長のDNAについ
て、M13フアージを用いたジデオキシ法（J.
Messing；Mehtods in Enzymology，vol.101，
p.20（1983））に従つて塩基配列を決定した。その
結果、第１図に示すpGRF2−15の全塩基配列の
471番目から937番目の配列が明らかにされた。

pTP70−１の塩基配列は、本発明者らによつ
て明らかにされている（特開昭63−46193号公
報）。pGRF2−15の配列は、pTP70−１のEcoRI
−SalIの配列に間にあるBamHI部位に、107ヌク
レオチドのDNA（GRF1−29を暗号化する配列）
が結合した配列であつた。

また、pGRF2−15のEcoRI−SalI切断によつ
て得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、PstI，
HindIII，HpaI，AatII，PvuII，BglII、および
ClaIを用いた制限酵素による切断実験の結果、
pTP70−１のEcoRI−SalI切断によつて得られる
約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であることが
示された。

以上の結果から、pGRF2−15の全塩基配列が
第１図に示した配列であることが明らかである。

発明の効果上記のように、新規組換えプラスミドpGRF2
−15は、DHFR−GRF1−29を暗号化しており、
かつpGRF2−15を有する大腸菌は、DHFR−
GRF1−29を大量に蓄積生産する。さらに、生成
したDHFR−GRF1−29は、DHFR酵素活性を示
し、精製を容易に行うことができると考えられ
る。このような性質を有することから、本発明の
新規組換えプラスミドpGRF2−15およびそれを
有する大腸菌は、DHFR−GRF1−29の生産、お
よびそれを利用したGRF1−29の生産に有益であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pGRF2−15の全塩基配列を示した
図であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列
だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニン
を、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミ
ンを示している。図中番号は、pGRF2−15に２
箇所存在する制限酵素ClaI切断認識部位のうち制
限酵素HindIII切断部位に近い方のClaI切断認識
部位の5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１
番として数えた番号を示している。第２図は、pGRF2−15中に存在するDHFR−
GRF1−29を暗号化する部分の塩基配列およびタ
ンパク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符
号は、核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデ
ニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔは
チミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン
酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisは
ヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイ
シンを、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、
Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはト
リプトフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリ
ンを示している。図中番号は、１番目のアミノ酸
であるメチオニンを暗号化するATGコドンの
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピリシン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子が大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の3′末端側の配列が改変されたことによりジ
ヒドロ葉酸還元酵素−牛成長ホルモン放出因子の
１番目から29番目までのペプチドフラグメントを
含む融合タンパク質を暗号化し、4715塩基対の大
きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
新規組換えプラスミドpGRF2−15。【表】【表】【表】【表】【表】２大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性及びアンピリシン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子が大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の3′末端側の配列が改変されたことによりジ
ヒドロ葉酸還元酵素−牛成長ホルモン放出因子の
１番目から29番目までのペプチドフラグメントを
含む融合タンパク質を暗号化し、4715塩基対の大
きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
新規組換えプラスミドpGRF2−15を含有するE.
coliC600株。【表】【表】【表】【表】【表】