JPH0231682A - ヒトｅｇｆの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒ１−ＥＧＦ（ヒト上皮細胞増殖因子；ｈｕ
ｍａｎ　　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆ
ａｃｔｏｒ）製造のための組み換えＤＮＡ技術に関する
。より具体的には、ヒトＥＧＦ遺伝子を含有するＤＮＡ
、該ＤＮＡをおよびそれらを用いたヒトＥＧＦの製造法
に関する。

従来の技術 ヒトＥＧＦは５３個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸
配列は既に明らかにされている（Ｇｒｅｇｏｒｙ。

Ｈｏ、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５７　、　
３２５（１９７５））。本物質は胃酸分泌抑制や上皮細
胞増殖作用を有することから、胃潰瘍、火傷等の治療薬
として期待されており、遺伝子操作による組み換え型ヒ
トＥＧＦの量産化が望まれている。

今日まで多くの組み換えＤＮＡの研究は大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）を用いてなされており、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
は、発現された遺伝子産物が菌体内に１積されるため、
目的とする遺伝子産物を純粋な形で取得するまでの過程
で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液からの精
製に多大な時間と労力とを要するだけではなく、目的と
する物質を完全な形で純粋に得ることが容易ではない。

一方、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌は古くから種
々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されており
、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ領域をクローニングし
、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連結し、
これをバチルス属菌に導入すれば、目的とする蛋白質を
遺伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能になる
と考えられる。バチルス属菌においては、分泌される蛋
白質はアミノ末端側におよそ２０〜３０アミノ酸残基か
らなるシグナルペプチドを持つ前駆体として合成された
のち、この部分がシグナルペプチダーゼによって切断さ
れて、成熟した蛋白質になると考えられており、すでに
バチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のσ−ア
ミラーゼ遺伝子（１、Ｐａ１ｖａら、ジーン（Ｇｅｎｅ
）。

２２．２２９（１９８３））、バチルス・リケニ７オル
ミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ）のベニシリナーゼ遺伝子（Ｓ、　Ｃｈａｎｇら、モ
レキュラー・クロニング・アンド・ジーン・レギュレー
ション・イア−バチライ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　　ａｎｄ　　ＧｅｎｅＲｅｇｕｌａｔｉｏ
ｎ　　ｉｎ　　Ｂａｃｉｌｌｉ）、　Ａｃａｄｅａ＋ｉ
ｃ　　Ｐｒｅｓｓ。

６５９Ｌ　１９８２年１．バチルス・サチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ遺
伝子〔Ｈ，Ｙａｍａｚａｋｉら、ジャーナル・オフ・バ
クテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）上５６
，３２７（１９８３）〕がクローン化され、これらのシ
グナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告され
ている。

上記した異種蛋白質の分泌生産には、主にバチルス・サ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）が宿
主として用いられているが、この微生物は菌体外プロテ
アーゼを多量に生産するため、組み換えＤＮＡ技術を用
いて分泌された異種蛋白質は分解を受け、その蓄積量は
著しく減少する。

これに対し、鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼをほとんど
生産しない菌株が多いことを見い出し、そのｌ菌株バチ
ルス・ブレビス４７ＣＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４；特開
昭６０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８３
号公報参照〕の主要菌体外蛋白質（Ｈ，Ｙａｍａｚａｋ
ｉら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　６９　
＋１２３９（１９８７）、塚越規弘１日本農芸化学会誌
、旦土、６８（１９８７）および特開昭６２−２０１５
８３号公報にそれぞれ“ｏｕｔｅｒ　　ｗａｌｌｐｒｏ
ｔｅｉｎ　　ａｎｄ　　ｍ１ｄｄｌｅ　　ｗａｌｌ　　
ｐｒｏｔｅｉｎ”％“菌体外主要蛋白質”および“細胞
表層蛋白質″として記載されている。〕遺伝子のプロモ
ーターおよび該主要菌体外蛋白質の一種であるＭＷ蛋白
質（ｍｉｄｄｌｅ　　ｗａｌｌ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）の
シグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌ベクタ
ーを作製し、本菌株を宿主としてα−アミラーゼ〔特開
昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ，Ｙａｍａｇａｔａら
、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１旦９．ｌ　２３９（１９Ｊ３
７））やブタペプシノーゲン〔鵜高重三１日本農芸化学
会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８、塚
越規弘９日本農芸化学会誌、６１．６８（１９８７））
の分泌生産に成功している。

また、高木らはバチルス・ブレビスのプロテアーゼを生
産しない菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（なお、こ
の菌株は本明細書におけるバチルス・ブレビスＨ１０２
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）と同一菌株である。）
を分離し、これを宿主として耐熱性ａ−アミラーゼの高
分泌生産に成功している［日本農芸化学会昭和６２年度
大会講演要旨集ｒ　ｐ２７　］。

ヒトＥＧＦについては、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　（
Ｈ。

Ｏｈｇａ　ｉ　、バイオ・インダストリー（Ｂｉｏ　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｙ）。

３．８７５（１９８６））、サツカロミセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）　（ＡｎｔｈｏｎｙＪ、　Ｂｒａｋｅら、プロ
シーディング・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８１　＋４６
４２（１９８４））を宿主として用いる分泌生産が報告
されている。

発明が解決しようとする課題 前記のとおり、バチルス・ブレビスを宿主として用いる
異種蛋白質の分泌生産あるいは大腸菌。

サツカロミセス・セレビシェを宿主として用いるヒトＥ
ＧＦの分泌生産について、それぞれ単独で種々試みられ
ているが、本発明はバチルス・ブレビスを宿主として用
いるヒトＥＧＦの新規製造法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは、ヒトＥＧＦを効率よく生産させる方法を
提供すべく鋭意研究を重ねたところ、バチルス・ブレビ
スを宿主として用いてヒトＥＧＦ遺伝子を発現させるこ
とにより、培養物中に著量のヒトＥＧＦが生産され、し
かもヒトＥＧＦ遺伝子が安定に保持されることを見い出
し、これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成した。

すなわち本発明は、 （１）　　バチルス・ブレビス由来のプロモーター領域
を含有するＤＮＡの３′末端にヒトＥＧＦをコードする
ＤＮＡを結合させたＤＮＡ。

（２）プロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末端に
ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを保
持するバチルス・ブレビスおよび（３）上記（２）に記
載のバチルス・ブレビスを培地に培養し、培養物中にヒ
トＥＧＦを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とするヒトＥＧＦの製造法である。

ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡとしては、ヒトＥＧＦを
コードするものであればいずれでもよく、例えば公知の
ヒ１−ＥＧＦのアミノ酸配列に基づき、公知の方法で化
学合成されたものが挙げられ、その具体例としては、特
開昭６１−８８８８１号公報、特開昭６２−４０２９０
号公報、径由ら、武田研究所報、±５．１３６（１９８
６）などに記載の方法に従って合成されたＤＮＡ（１）
が挙げられる。

ＤＮＡ（Ｉ）： ＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴ
ＣＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡ
ＣＧＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡ
ＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡ
ＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＡ
ＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡ
ＣＴＧＣＡ プロモーターとしては、バチルス・ブレビスで機能する
ものであればいずれでもよいが、バチルス・ブレビス由
来のプロモーターが好ましく、例えばバチルス・ブレビ
ス４７あるいはバチルス・ブレビスＨ１０２の主要菌体
外蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。該プ
ロモーターは１種または２種以上含有されていてもよい
。

プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモータ
ー以外に、ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有している
ことが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子の一
部を有していてもよい。

本発明において、ヒトＥＧＦはバチルス・ブレビスの菌
体内、菌体外のいずれに蓄積されてもよいが、ヒトＥＧ
Ｆの抽出、精製を容易にし、また生産量を増大させるた
めには、菌体外にヒトＥＧＦを蓄積させることが望まし
く、この場合、プロモーター領域を含有するＤＮＡには
、該ＤＮＡの３′末端側にシグナルペプチドをコードす
る領域が含まれる。

シグナルペプチドとしては、ヒトＥＧＦをバチルス・ブ
レビスの菌体外に分泌発現させるものであればいずれで
もよく、例えばバチルス・ブレビス４７あるいはバチル
ス−プレビスＨ１０２の主要菌体外蛋白質のシグナルペ
プチドなどが挙げられるが、なかでもバチルス・ブレビ
ス４７のＭＷ蛋白質（ｍｉｄｄｌｅ　　ｗａｌｌ　　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドが好ましい。

上記したプロモーター領域およびシグナルペプチドをコ
ードする領域を含有するＤＮＡとしては、例えば第１図
に示す５７５ｂｐ　Ａｌｕｌ　−Ｆｎｕ４　Ｈ１断片が
挙げられ、該断片は化学的に合成することも可能であり
、またバチルス・ブレビス４７−５（ｐＨＹ５００−Ｅ
ＧＦ）（ＩＦＯｌ　４６９９゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６
６３）あるいはバチルス・ブレビス（ｐＮＵ２００−Ｅ
ＧＦ３１ＸＩＦＯ１４７２９、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１７
７２）から調製することも可能である。

遺伝子の発現に用いる発現ベクターとしては、バチルス
・ブレビスで機能するものであればいずれでもよく、例
えば後述の参考例１で得られるプラスミドｐＨＹ５００
．後述の参考例２で得られるプラスミドｐＮｕ２００［
鵜高重三１日本農芸化学会誌、■上、６６９（１９８７
）］などが挙げられる。

上記のＤＮＡを用いて作製したヒトＥＧＦ発現プラスミ
ドとしては、バチルス・ブレビスで機能するものであれ
ばいずれでもよく、具体的には後述の実施例１で得られ
るプラスミドｐＨＹ５００−ＥＧＦ、後述の実施例２で
得られるプラスミドｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１などが挙
げられる。

これらのプラスミドを構築する方法としては、例えばモ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ
アル、コールド・スフリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＸ　
ｌ　９８２　）に記載の方法などが挙げられ、一方、プ
ラスミドの構築に用いる宿主としては、大腸ｍ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｂｒｅｖｉｓ）に属する微生物であればい
ずれでもよく、例えば大腸菌ＨＢＩＯＩ、大腸菌ＤＨ１
，バチルス・サチルスＲＭ１４１（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８．　ｌ　Ｏ５４（１９
８４））、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
７２２４）。

バチルス・ブレビス４４７−５（ＦＥＲＢＰ−１６６４
，１Ｆ０　１４６９８）などが挙げられる。

遺伝子の発現に用いる宿主としては、バチルス・ブレビ
スであればいずれでもよく、具体的にはバチルス・ブレ
ビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４）。

バチルス・ブレビス４４７−５（ＦＥＲＢＰ１６６４、
ＩＦＯ１４６９８）、バチルス・ブレビスＨ１０２（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。なお、
バチルス・ブレビスＨＩＯ２はバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１（日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、
ｐ２７、鵜高重三９日本農芸化学会誌、６１，６６９（
１９８７）１と同一菌株である。

バチルス・ブレビスを形質転換する方法は公知の方法で
よく、例えばＴａｋａｈａｓｈ　ｉ　らの方法〔Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　５６．　　ｌ　ｌ　３
０（１９８３））あるいはｃｈａｎｇとＣｏｈｅｎの方
法〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティク
ス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）、上６８．ｌ１ｌ（１９７９）３などが
挙げられる。

得られる形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体
が生育して目的とする蛋白質を産生しうるものであれば
いかなるものでもよい。

該培地に含有される炭素源としては、例えばグルコース
、シュークロース、グリセロール、でん粉、デキストリ
ン、糖蜜、尿素、有機酸などが用いられる。該培地に含
有される窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉
エキス、酵母エキス。

カザミノ酸、グリシンなどのアミノ酸類、ＮＺ−アミン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム。

リン酸−カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム
、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じて培地に
加えられる。また、糖と無機窒素源を主とする合成培地
を用いて培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用い
る場合には、その生育に必要な栄養物質を培地に添加す
ればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン
類、核酸塩基類などが挙げられる。

また、培養に際して必要があれば、培地に抗生物１ｔ（
Ｌ　ヘニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリンなど）が加え
られる。さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラー
ド油など）を培地に加えてもよい。

培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、さらに好まし
くは６．５〜７．５である。

培養温度は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４
℃〜３７°Ｃであり、培養時間は通常１６〜１６６時間
、さらに好ましくは２４〜９６時間である。

培養終了後、それ自体公知の方法、例えば遠心分離、ろ
過などで菌体と上溝とを分離する。菌体内に産生された
ヒトＥＧＦは、当分野における通常の方法、例えば超音
波破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法、摩砕
などの機械的破砕法、細胞壁溶解酵素による破砕法など
により菌体を破砕し、さらに必要ならば、トリトン−Ｘ
１００゜デオキシコーレートなどの界面活性剤を加える
ことによって抽出される。このようにして得られた培養
上清、あるいは抽出液中に含まれるヒトＥＧＦは通常の
蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲルろ過、イ
オン交換クロマトグラフィーハイドロキシアパタイト、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）
などにしたがって精製され、目的とするヒトＥＧＦを得
ることができる。

上記で得られるヒトＥＧＦは、ラジオイムノアッセイ〔
アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社（英国）販売〕、フ
ィブロブラスト・リセプター・アッセイ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　７２
．　　ｌ　３７１（１９７５）］、あるいはＨＰＬＣを
用いて定量することができる。またＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３
−Ａ３１細胞に対する増殖促進活性〔ジャーナル・オフ
・セルラー・フィジオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、）。

８６．５９３（１９７５））あるいはＨ２Ｏ−１細胞に
対する増殖阻害活性〔ジャーナル・オフ・セル−バイオ
ロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）、　９３．　
１（１９８２））からヒトＥＧＦを定量することもでき
る。

ｍ里 本発明のヒトＥＧＦの製造法によれば、ヒトＥＧＦをよ
り効率よく量産化することができ、しかもヒトＥＧＦ遺
伝子が形質転換体内で安定に保持されるので、治療薬と
してのヒトＥＧＦの生産、さらにヒトＥＧＦの生体内で
の役割や細胞増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の
解明に役立つものである。

また、ヒトＥＧＦを菌体外に産生させることも可能であ
るため、目的とするヒトＥＧＦをより容易に採取するこ
とができる。

衷菖男 以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるべきものでは
ない。

なお、参考例１で開示するバチルス・ブレビス４７−５
は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に昭和６３年１月１
２日から受託番号ＩＦ０　１４６９８として、また、通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に
昭和６３年１月２０日から受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１６６４として寄託されている。一方、実施例１に開示
するバチルス・ブレビス４７−５（ｐＨＹ５００−ＥＧ
Ｆ）はＩＦＯに昭和６３年１月１２日から受託番号ＩＦ
Ｏ１４６９９として、また、ＦＲＩに昭和６３年１月２
０日から受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６６３として寄
託されている。

なお、実施例２で開示するバチルス・ブレビスＨＩ　Ｏ
２（日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ、
２７、鵜高重三２日本農芸化学会誌。

６１．６６９（１９８７）に記載のバチルス・ブレビス
　ＨＰＤ３１と同一菌株）は、通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に昭和６１年６月２４日
から受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７として寄託さ
れている。一方、実施例２に開示するバチルス・ブレビ
ス４７−５（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ）は、財団法人発酵
研究所（Ｉ　ＦＯ）に昭和６３年２月１９日から受託番
号ＩＦ０１４７２８として、またＦＲＩに昭和６３年２
月２９日から受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１７７１とし
て寄託されている。

実施例２で開示するヒトＥＧＦ発現プラスミドｐＮＵ２
００−ＥＧＦ３１を用いてＴａｋａｈａｓｈｉらの方法
［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５６．１１３０（１９
８３）］によってバチルス・ブレビス４４７−５（ＦＥ
ＲＢＰ−１６６４，１Ｆ０　１４６９８）の形質転換を
行って得られたバチルス・ブレビス４７−５（ｐＮＵ２
００−ＥＧＦ３１）は、ＩＦＯに昭和６３年２月１９日
から受託番号ＩＦＯ１４７２９として、またＦＲＩに昭
和６３年２月２９日から受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１
７７２として寄託されている。

本明細書および図面において、アミノ酸、その他に関し
略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ
　（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　）による略号ある
いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を第１表に挙げる。また、アミノ酸などに関し光学
異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示
すものとする。

ＮＡ ＤＳ ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ Ｉｓ ｅｒ ｈｒ ｅｔ 第１表 ：デオキシリポ核酸 ：アデニン ：チミン ：グアニン ：シトシン ：ドデシル硫酸ナトリウム ニゲリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ：イソロイシン ：セリン ：スレオニン ：メチオニン Ｇｌｕ　　：グルタミン酸 Ａｓｐ　　：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：リジン Ａｒｇ　　：アルギニン Ｈｉｓ　　：ヒスチジン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｔｙｒ　　：チロシン Ｔｒｐ　　ニトリブトファン Ｐｒｏニブロリン Ａｓｎ　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　：グルタミン 参考例１ プラスミドｐＨＹ５００の構築 プラスミドｐＴＴ　５（６、１ｋｂ）〔Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、。

１５８．１０５４（１９８４））を制限酵素ＨｉｎｄＩ
［Ｉで切断し、ヌクレアーゼＢａ１３１で全体の約ｌ／
６程度まで両端を削ったのち、Ｋｌｅｎｏｗ　７ラグメ
ント（Ｌａｒｇｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｅ、ｃｏｌｉ　
　ＤＮＡ　　Ｐｏｌｙｍｅ−ｒａｓｅ）で処理して両末
端を平滑化し、大腸菌アルカリ性７オスフアターゼで処
理した。一方、プラスミドｐＨ１３０１（７、ｌ　ｋｂ
ＸＴｓｕｋａｇｏｓｈｉ　ら。

Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　　１９３．５８
（１９８４））からバチルス・ステアロサーモフィルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）由来の断片を含むＢａｍＨＩ断片を単離し、これ
を上記のｐＴＴ５由来のＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結し、その反応液を用いてＣｈａｎｇとＣｏｈｅ
ｎの方法（Ｍｏ１．　Ｇａｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、上６８．ｌ　ｌ　ｌ（１９７９））によ
るバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ＲＭ　ｌ　４１の形質転換を行った。得られ
たカナマイシン耐性の形質転換体からプラスミドを単離
し、これをｐＴＴ−Ａ＋ｍ１（７，２ｋｂ）と命名した
。

得られたプラスミドｐＴＴ−Ａｍｌを制限酵素Ｈｐａｌ
で完全切断および制限酵素ＥｃｏＲＩで部分切断し、Ｋ
　ｌｅｎｏｗフラグメントで両末端を平滑化したのちＨ
ｉｎｄ０１リンカ−を付与し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで閉
環してプラスミドｐＴＴ−Ａｍ２（６゜７　ｋｂ）を得
た。

プラスミドｐＴＴ−Ａｎ＋２を制限酵素ＢｇｌｌｌとＣ
１ａＩで切断して小さい断片を除去し、代わりにプラス
ミドｐＢＡＭ　Ｉ　Ｏｌ　（６，８ｋｂ）　ＣＴｓｕｋ
ａｇｏｓｈｉら、　Ｊ、　ＢａＣｔｅｒｉｏｌ、、上６
４．１１８２（１９８５）〕のＢｇｌＩ［−ＣＩａＩ断
片を挿入することによりプラスミドｐＴＴ−Ａｍ３（７
，４ｋｂ）を得た。

上記のプラスミドｐＴＴ−Ａｎ＋３を制限酵素Ｐｖｕ■
で切断し、ヌクレアーゼＢａ１３１で削り、Ｋｌｅｎｏ
ｖ　ｙラグメントで両末端を平滑化したのちＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカ−を付与した。次にこのＤＮＡを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩ［で切断したのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連
結し、プラスミドｐＴＴ−Ａｎ＋３００（５，７ｋｂ）
を得た。

プラスミドｐＴＴ−Ａａ＋３００をＥｃｏＲＩで切断し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結してカナマイシン耐性のプ
ラスミドｐＦＫｌ（２，６ｋｂ）を得た。プラスミドｐ
ＨＹ　４８１　（３、７ｋｂ）　ＣＹａｍａｇａｔａら
、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・ミクロ
バイオロジー（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、）。

４９．１０７６（１９８５）、特開昭６０−１８８０７
３号公報（ｃｆ、ＦＥＲＭ　　Ｐ−７５３１））を制限
酵素ＨｐａＩ［で切断して小断片を除去し、代わりに上
記のｐＦＫｌの大きいＴａｑｌ断片を挿入して、エリス
ロマイシンとカナマイシンに両射性のプラスミドｐＦＫ
２（５，２ｋｂ）を得た。

プラスミドｐＦＫ２をハイドロキシアミンで処理して変
異を誘起し、バチルス・ブレビス４４７−５（ＦＥＲＢ
Ｐ−１６６４，１ＦＯ１４６９８）に形質転換した。得
られたエリスロマイシンおよびカナマイシン両耐性の形
質転換体の中からプラスミドのコピー数が増大した株を
選び、その菌株から単離したプラスミドを　ｐＦ　Ｋ　
２　ｃｏｐＴ（５，２ｋｂ）と命名した。

上記のプラスミドｐＦ　Ｋ　’ｌ　ｃｏｐＴからＨｐａ
Ｉ［の小断片を除去し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで両
末端を平滑化したのちＢａ＋ｎＨＩリンカ−と８ｇｌｌ
ｌリンカ−の混合物（１：ｌ）を連結させた。

一方、プラスミドｐＣＷＰ　ｌ（７，５ｋｂ）ＣＹａｍ
ａｇａｔａら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１
６９　、　１２３９（１９８７）、塚越規弘９日本農芸
化学会誌、旦土。

６８（１９８７）、特開昭６２−２０１５８３号公報〕
より、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭＰ−７２２４
）の主要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーターおよびバチ
ルス・ブレビス４７のＭＷ蛋白質のシグナルペプチドと
成熟蛋白のＮ末端側の一部をコードする領域を含む６０
０ｂｐＡｌｕｌ断片（第１図参照）を単離し、上記のｐ
Ｆ　Ｋ　２　ｃｏｐＴ由来のＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、その反応液を用いてＴａｋａｈａｓｈ
ｉらの方法（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　５６．　　ｌ　ｌ　３
０（１９８３））によってバチルス・ブレビス４７−５
の形質転換を行った。得られたエリスロマイシンのみに
耐性の形質転換体からプラスミドを単離し、これをｐＨ
Ｙ５００（５，２ｋｂ）と命名した。

参考例２ 発現ベクターｐＮＵ２００の構築 プラスミドｐ　ＣＷＰ　ｌ（７，５ｋ　ｂ）　［Ｙａａ
ｉａｇａｔａら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、上旦
旦、１２３９（１９８７）、塚越規弘１日本農芸化学会
誌、見土、６８（１９８７）、特開昭６２−２０１５８
３号公報〕より、バチルス・ブレビス４７の主要菌体外
蛋白質遺伝子のプロモーターおよびＭＷ蛋白質のシグナ
ルペプチドと成熟蛋白のＮ末端側の一部をコードする領
域を含む６００ｂｐ　Ａｇｕ　Ｉ断片を単離した。次に
本断片に７４ＤＮＡリガーゼでＢａｇｅＨ１リンカ−を
結合させたのち、ＢａｍＨＩで処理して６００ｂｐ　Ｂ
ａｍＨＩ断片を得た。

一方、プラスミドｐＨＴ−１（５，６ｋｂ）［特開昭６
０−５８０７４号公報、（ｃｆ、ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２
２６）］をＢａｍＨＩとＢｇｌｌＩで切断し、その大き
い断片と上記の６００ｂｐ　Ｂａａ＋ＨＩ断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結させた反応液を用いてバチルス・
ブレビス４７（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２２４）の形質転換
を行った。エリスロマイシン耐性の形質転換体の中から
プラスミドを単離し、これをｐＮＵｌｏｏ（４゜５ｋｂ
）［塚越規弘１日本農芸化学、会誌。

６１．６８（１９８７）］と命名した。プラスミド＋１
）ＮＵｌｏｏを制限酵素ＥｃｏＲＩで部分分解したのち
、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｌａｒｇｅ　　Ｆｒａｇ
ｍｅｎｔＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏ１ｙｎ＋ｅｒａ
ｓｅ）で処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで閉環することに
より、ＥｃｏＲＩ部位の１＠所が除去された分泌ベクタ
ーｐＮＵ２００（４，５ｋｂ）［鵜高重三１日本農芸化
学会誌、６１゜６６９（１９＆７）１を得た。

実施例１ 参考例１で得られた発現ベクターｐＨＹ５００より、主
要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーターからＭＷ蛋白質の
シグナルペプチドをコードする領域までを含む３５０ｂ
ｐＦｎｕ４）１１断片（第１図参照）を単離し１．Ｋｌ
ｅｎｏｗフラグメント（ＬａｒｇｅＦｒａｇａ＋ｅｎｔ
　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）
で処理してその両末端を平滑化したのち、制限酵素Ｈｐ
ａｌで切断し、シグナルペプチドの６番目のＡｓｎ以後
からそのＣ末端付近までをコードする５４ｂｐのＤＮＡ
断片を単離した。

特開昭６２−４０２９０号公報［谷内ら、武田研究所報
、４５．１３６（１９８６）参照１に記載の方法に従っ
て、ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡ断片を含むプラスミ
ドｐＴＢ３６１を構築し、プラスミドｐＴＢ３６１より
ヒトＥＧＦをコードする４　１０　ｂｐ　Ｈｉｎｆｌ断
片を単離した。得られた該断片をＫｌｅｎｏｗフラグメ
ント（Ｌａｒｇｅ　　Ｆｒａｇ＋ａｅｎｔＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＤＮＡ　Ｐｏ１ｙａ＋ｅｒａｓｅ）で処理して両末
端を平滑化し、これにＥｃｏＲＩリンカ−（ＣＧＧＡＡ
ＴＴＣＣＧ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、制
限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｖａＨＩで処理し、１７０　ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｂａ１ＨＩ断片を得た。プラスミド
ｐＢＲ３２２から３７７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨ
Ｉ断片を除去し、これに上記のｌ　７０ｂｐ　ＥｃｏＲ
１−ＢａｍＨＩ断片を挿入してプラスミド△ＮｐＴＢ３
６１を得た。

プラスミド△ＮｐＴＢ３６１のヒトＥＧＦのＮ末端付近
をコードする領域に存在するＥｃｏＲ１部位を切断した
のちＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、得られたＤ
ＮＡ断片の５′末端に、シグナルペプチドの６番目のＡ
ｓｎ以後からそのＣ末端付近までをコードする５４ｂｐ
のＤＮＡ断片（前出）を連結させ、シグナルペプチドと
ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡが正しくつながったプラ
スミドΔＮｐＴ８３６１Ｆを得た。この△ＮｐＴＢ３６
１Ｆより、シグナルペプチドの中間付近以後からヒトＥ
ＧＦのＣ末端までをコードする２　０７ｂｐ　ＡｐａＬ
ｌ−ＢａｍＨＩ断片を単離した。

一方、発現ベクターｐＨＹ５００を制限酵素ＡｐａＬＩ
とＢａａ＋ＨＩで切断し、これに上記の２０７　ｂｐ　
ＡｐａＬ　Ｉ　−ＢａｒｎＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結し、その反応液を用いてＴａｋａｈａｓｈｉら
の方法〔Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　５６　
、　　ｌ　ｌ　３０（１９８３））によってバチルス・
ブレビス４４７−５（ＦＥＲＢＰ−１６６４，ＩＦｏ　
　１４６９８）の形質転換を行った。得られたエリスロ
マイシン耐性の形質転換体からプラスミドを単離し、こ
れをｐＨＹ５００−ＥＧＦと命名した。該プラスミドで
は当初の計画とは異なり、プラスミドｐＨＹ５００のＡ
ｐａＬ１部位に２０７ｂｐ　ＡｐａＬ　Ｔ−ＢａｍＨＩ
断片が互いに逆向きに２個挿入されていた（第２図）。

形質転換体の中から安定株〔バチルス・ブレビス４４７
−５（ｐＨＹ５００−ＥＧＦ）（ＦＥＲＢＰ−１６６３
，ＩＦＯ１４６９９）〕を分離し、これを実施例３の培
養に用いた。

実施例２ 参考例１で得られたブセスミドｐＨＹ５００より、主要
菌体外蛋白質遺伝子のプロモーターからＭＷ蛋白質のシ
グナルペプチドをコードする領域までを含む３５０ｂｐ
Ｆｎｕ４　ＨＩ断片（第１図参照）を単離し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ　７ラグメント（Ｌａｒｇｅ　ＦｒａｇｍｅｎｔＥ
、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　　Ｐｏ１ｙ＋１ｅｒａｓｅ）で
処理してその両末端を平滑化したのち、制限酵素Ｈｐａ
ｌで切断し、シグナルペプチドの６番目のＡｓｎ以後か
らそのＣ末端付近までをコードする５４ｂｐのＤＮＡ断
片を単離した。

特開昭６２−４０２９０号公報［径由ら、武田研究所報
、４５，１３６（１９８６）参照１に記載の方法に従っ
て、ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡ断片を含むグラスミ
ドｐＴＢ３６１を構築し、プラスミドｐＴＢ３６１より
ヒトＥＧＦをコードする４１０ｂｐＨｉｎ口断片を単離
した。得られた該断片をＫｌｅｎｏｗ　７ラグメント（
Ｌａｒｇｅ　　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）：、　Ｃ０１ｉ　Ｄ
ＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）で処理して両末端を平滑
化し、これにＥｃｏＲＩリンカ−（ＣＧＧＡＡＴＴＣＣ
Ｇ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理し、１７０ｂｐ　ＥｃｏＲ
Ｉ　−ＢａｍＨ１断片を得た。プラスミドｐＢＲ３２２
から３７７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｂａａ＋ＨＩ断片を除去
し、これに上記のｌ　７　Ｑｂｐ　ＥｃｏＲ１Ｂａ■Ｈ
１断片を挿入してプラスミドΔＮｐＴＢ３６１を得た。

プラスミド△ＮｐＴＢ３６１のヒトＥＧＦのＮ末端付近
をコードする領域に存在するＥｃｏＲ１部位を切断した
のちＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、得られたＤ
ＮＡ断片の５′末端に、シグナルペプチドの６番目のＡ
ｓｎ以後からそのＣ末端付近までをコードする５４ｂｐ
のＤＮＡ断片（前出）を連結させ、シグナルペプチドと
ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡが正しくつながったプラ
スミド△ＮｐＴＢ３６１Ｆを得た。この△ＮｐＴＢ３６
１Ｆより、シグナルペプチドの中間付近以後からヒトＥ
ＧＦのＣ末端までをコードする２　０７ｂｐ　ＡｐａＬ
　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を単離した（第２図−１）。

参考例２で得られた発現ベクターｐＮＵ２００をＡｐａ
Ｌ　ＩとＢａｍＨＩで切断し、これにプラスミドΔＮｐ
ＴＢ３６１Ｆより単離した２０７ｂｐＡｐａＬ　Ｉ　−
ＢａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、その反
応液を用いてＴａｋａｈａｓｈｉらの方法Ｈ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　５６．　　ｌ　ｌ　３
０（１９８３）］によ・）てバチルス・ブレビス４４７
−５（ＦＥＲＢＰ−１６６４，ＩＦｏ　　１４６９８）
の形質転換を行った。得られたエリスロマイシン耐性の
形質転換体よりプラスミドを単離し、これをｐＮＵ２０
０−ＥＧＦと命名し、プラスミドｐＮＵ２００ＥＧＦを
保持する形質転換体をバチルス・ブレビス４７−５（ｐ
ＮＵ４７−５（ｐＮＵ２００−ＥＧＦＸＦＥＲ，ＩＦｏ
　　１４７２８）と命名した。プラスミドｐＮＵ２００
−ＥＧＦでは当初の計画とは異なり、ｐＮＵ２００のＡ
ｐａＬ　ＩとＢａｍＨ■の間に２０７ｂｐ　ＡｐａＬＩ
−ＢａｍＨＩ断片が同方向に２個挿入されており、その
間にｐＮＵ２００の６８　ｂｐ　ＡｐａＬ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩ断片が逆向きに残存していた（第２図−２）。

上記で得られたヒトＥＧＦ発現グラスミドｐＮＵ２００
−ＥＧＦを用いてバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１０８７；日本農芸化学会昭和６２年度大
会講演要旨集、ｐ２７、鵜高重三０日本農芸化学会誌、
６１，６６９（１９８７）に記載のバチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１と同一菌株）の形質転換を行った。得られた
形質転換体からプラスミドを単離し、その構造を調べた
ところ、ｐＮＵ２００−ＥＧＦに余分に挿入されていた
ＤＮＡ断片が欠落していた。このプラスミドをｐＮＵ２
００−ＥＧＦ３１と命名しく第２図−２）、プラスミド
ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１を保持する形質転換体をバチ
ルス・ブレビスＨ１０２（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１）
と命名した。

なお、上記プラスミドｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１を用い
てＴａｋａｈａｓｈｉらの方法［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、。

１旦６，１１３０（１９８３）］によってバチルス・ブ
レビス４４７−５（ＦＥＲＢＰ−１６６４゜１ＦＯ１４
６９８）の形質転換を行って得られたバチルス・ブレビ
ス４４７−５（ｐＮＵ２００ＥＧＦ３１ＸＦＥＲＢＰ−
１７７２，１ＦＯ１４７２９）から、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　
　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載のア
ルカリ抽出法によって単離したプラスミドｐＮＵ２００
−ＥＧＦ３１を用いてＴａｋａｈａｓｈ　ｉらの方法［
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１５６．１１３０（１９８３）］によってバチルス・ブ
レビスＨ１０２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０８７）の形質
転換を行うと、上記と同一のバチルス・ブレビスＨ１０
２（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１）が得られｔ二。

実施例３ 形質転換体の培養およびヒトＥＧＦの生産（１）実施例
１で得られｔ；形質転換体バチルス・ブレビス４７−５
（ｐＨＹ５００−ＥＧＦ）およびその対照となるバチル
スΦプレビス４７−５（ｐＨＹ５００）をグルコース１
％、酵母エキス０゜４％、ポリペプトン２％、肉エキス
０．５％。

ＭｇＣＱｘ　５　ｉＭ　、ウラシル１００μｇ／顧およ
びエリスロマイシンｌＯμｇ／−からなる培地（ｐＨ７
。

０）で３０℃、２日間振とう培養した。

上記の培養液を遠心分離し、その上清のヒトＥＧＦ濃度
を逆層の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、Ｈ
３Ｃ−１細胞に対する増殖阻害活性（Ｊ、　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、、　９３．　１（１９８２））およびＢＡ
ＬＢ／Ｃ３Ｔ３−Ａ３１細胞に対する増殖促進活性ＣＪ
、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　８６　、５９３
（１９７５））から求めた。なお、ヒトＥＧＦ標準品と
しては湧永製薬（株）から購入したものを用いた。第２
表にその結果を示す。

第２表　形質転換体によるヒトＥＧＦの分泌生産形質転
換体　　　　　　　ＨＰＬＣ増殖阻害バチルス・ブレビ
ス　　　　　　０　　　＜０．５４７−５（ｐＨＹ５０
０） 増殖促進 ＜０．０１ バチルス・ブレビス ４７−５（ｐＨＹ５００−ＥＧＦ） 次に上記の培養上清を Ｌａｅｍｍｌ　ｉの方法 ＣＮａｔｕｒｅ、　２２７　、６８０（１９７０））に
準じて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けたのち、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法〔アナリティカル・
バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）
、１土２，１９５（１９８１））に準じて抗ヒトＥＧＦ
抗血清（湧水製薬製）を用いてウェスタンブロッティン
グを行った。その結果、バチルス・ブレビス４７−５（
ｐＨＹ５００−ＥＧＦ）の培養上清にはヒトＥＧＦが認
められ、その分子量は標準品のそれと一致した。

（ｉ）　　実施例２で得られた形質転換体バチルス・ブ
レビスＨ１０２（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１）およびそ
の対照となるバチルス・ブレビスＨ１０２をプロテオー
ス・ペプトン３％、酵母エキス０゜２％、ＣａＣＯ２−
２Ｈ２００，０１％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，０１％
、Ｆｅ５０．−７Ｈ，ＯＯ，００１％、ＭｎＳＯ４−４
Ｈ，ｏ　ｏ、ｏＯ１％、Ｚｎ５Ｏａ・７Ｈ，ＯＯ，００
０１％、グルコース５％、グリシン０．３％およびｌＯ
ｐｇ／−エリスロマイシンからなる培地（ｐＨ７，２）
で３３℃、３日間振とう培養した。一方、バチルス・ブ
レビスＨ１０２（ｐＮＬ＋２００−ＥＧＦ３１）を上記
の培地のグリシン０．３％の代りにＴｗｅｅｎ　４０　
０．０３％を含む培地で３３°Ｃ１４日間振とう培養し
た。

上記の培養液を遠心分離し、その上清のヒトＥＧＦ濃度
を逆層高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および
Ｈ５Ｃ−１細胞に対する増殖阻害活性［Ｊ、　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏｌ、、　９３　、　　ｌ　（１９８２）］か
ら求めた。なお、ヒトＥＧＦ標準品としては湧水製薬（
株）から購入したものを用いた。第３表にその結果を示
す。

第３表　形質転換体によるヒ１−ＥＧＦの分泌生産日数
　ＨＰＬＣ増殖阻害 バチルス・ブレビスＨ１０２４０＜０．５バチルス・ブ
レビスＨ１０２ （ｉｉ）　　実施例２で得られた形質転換体バチルス・
ブレビスＨ１０２（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１）をグロ
テオース・ペプトン３％、酵母エキス０．２％、グルコ
ース３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ！ＯＯ，０１％、ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２００，００１％。

Ｍｎ５Ｏ，・４ＨｚＯ０−００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２００，０００１％およびグリシン０．３％を含有する
５’　ＹＣ培地（ｐＨ７，２）で３０°Ｃ１６日間振と
う培養した。

上記の培養液を遠心分離し、その上清をＬａｅｍｏ＋ｌ
ｉの方法ＣＮａｔｕｒｅ、２２７，６８０（１９７０）
）に準じて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけたのち、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法〔アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）、１土１゜１９５（１９８１））に準じて抗ヒトＥ
ＧＦ抗血清（湧水製菓製）を用いてウェスタンブロッテ
ィングを行った。その結果、培養上清のヒ１−ＥＧＦ濃
度は２４０　ｍｇ／Ｑであった。

実施例４ ヒトＥＧＦの精製 実施例３−（ｉ）で得られたバチルス・ブレビスＨ１０
２（ｐＮＵ２００−ＥＧＦ３１）の培養上清５＋１１２
を０１．カートリッジ（ＳＥＰ−ＰＡＫウォーターズ社
製）で前処理したのち、逆層ＨＰＬＣ（ウォーターズ社
製）、イオン交換ＨＰＬＣ（東ソー社製）および逆層Ｈ
ＰＬＣ（ウォーターズ社製）の順に精製してヒトＥＧＦ
の精製標品７８μｇを得た。

実施例５ ヒトＥＧＦ精製標品の性質 実施例４で得られたヒ）ＥＧＦ精製標品の諸性質は以下
のとおりであった。

逆層ＨＰＬＣで調べた結果、得られたＥＧＦ精製標品は
ほぼ単一であり（第３図）、その保持時間はヒトＥＧＦ
標準品（湧水製薬（株）製）のそれと−致した。

０．１％ＳＤＳを含む１８％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べた結果、還元条件下
、非還元条件下のいずれの場合も、精製標品は標準品と
同じ挙動を示した（第４図）。

ヒトＥＧＦ精製標品をガラス製加水分解用試験管にとり
減圧下で乾燥後、４％チオグリコール酸を含む５．７Ｎ
塩酸を加えて減圧下に封管したのち、１１０°Ｃ１２４
時間加水分解した。加水分解後、塩酸を減圧下で除去し
、残渣を０．０２８塩酸に溶解してアミノ酸分析を実施
した。

その結果を第４表に示す。

第４表　アミノ酸組成 アミノ酸分析値　　実験値１） Ａｓｘ　３）０．０８２８（μｍｏｌ）　　　６．７３
Ｓｅｒ　　　　Ｏ，０３１９２，５９ Ｇｌｘ　　　　Ｏ，０６１７５，０２ Ｐｒｏ　　　　Ｏ，００９５０，７７ Ｇｌｙ　　　　Ｏ，０５０９４，１４ Ａｌａ　　　　Ｏ，０２７２２，２１ ゜ｙｓ　　　　　　２）　　　　　　　　２）Ｖａｌ　
　　　　Ｏ，０３５８２，９１Ｍｅｔ　　　　Ｏ，０１
２３１，００ １１ｅ　　　　Ｏ，０２６３２，１４ Ｌｅｕ　　　　Ｏ，０６２０５，０４ Ｔｙｒ　　　　Ｏ，０５８０４，７２ Ｌｙｓ　　　　Ｏ，０２５０２，０３ Ｈｉｓ　　　　Ｏ，０２３８１，９３ Ａｒｇ　　　　Ｏ，０３３０２，６８ 理論値 １）　Ｍｅｔを１として計算した。

２）　Ｃｙｓは検出されなかった。

３）　ＡｓｘはＡｓｐおよびＡｓｎを示す。

４）　ＧｌｘはＧｌｎおよびＧｌｕを示す。

パルス・リキッド（Ｐｕｌｓｅ　１ｉｑｕｉｄ　）自動
エドマン分解（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７７Ａ型）
によってＮ末端アミノ酸配列を調べた結果、精製標品の
配列は文献［Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、
　２５７　、３２５（１９７５）］のそれと一致した（
第５表）。

第５表　Ｎ末端アミノ酸配列 精製標品　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　
　Ｘ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ文　　献　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒヒドラジン分解［Ｎａｒｉｔａら、ジャーナ
ル・オフ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ
、）＋　　５９　。

１７０（１９６６）］で調べた精製標品のＣ末端アミノ
酸はアルギニン（オルニチンとして同定）であり、文献
［Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、　２５７　
、３２５（１９７５）］のそれと一致した。

Ｈ３Ｃ−１細胞に対する増殖阻害［Ｂａｒｎｅｓ　、　
Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　９３　、　　ｌ　（１９８
２）］　を調べたところ、ヒトＥＧＦ精製標品は標準品
と同程度の活性を示した。

【図面の簡単な説明】 第１図は、参考例１に示したバチルス・ブレビス４７の
主要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーターおよびバチルス
・ブレビス４７のＭＷ蛋白質のシグナルペプチドと成熟
蛋白のＮ末端側の一部をコードする領域を含有するＤＮ
Ａの塩基配列とアミノ酸配列を示す。（Ｐはプロモータ
ーを示し、↑はシグナルペプチダーゼで切断される部位
を示す。）第２図は、実施例１および２に示したヒトＥ
ＧＦ発現プラスミドｐＨＹ５００−ＥＧＦおよびｐＮＵ
２００−ＥＧＦ３１の構築図を示す。 （口＝＝コ　はプロモーターおよびシグナルペプチドを
コードする領域を含有するＤＮＡを示し、　−Ｉ■Ｉは
ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡを示し、−は工ＩＪ　７
．　Ｏ？インン耐性を示し、（）はユニークサイトでな
いことを示す。） 第３図は、実施例５で得られた逆層高速液体クロマトグ
ラフィーの結果を示す。（横軸は保持時間（分）を、↓
はＥＧＦが溶出した時間（分）を示す。） 第４図は、実施例５で得られた５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。 （１は分子量マーカー（還元条件下）、２はヒトＥＧＦ
精製標品（還元条件下）、３はヒトＥＧＦ精製標品（非
還元条件下）、４はヒトＥＧＦ標準品（還元条件下）、
５はと）ＥＧＦ標準品（非還元条件下）を示し、縦軸は
分子量を示す。） 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘 第 図 集 Ｍｒ　ｘｌｏ’−３

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス・ブレビス由来のプロモーター領域を含
   有するＤＮＡの３′末端にヒトＥＧＦをコードするＤＮ
   Ａを結合させたＤＮＡ。
2. （２）プロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末端に
   ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを保
   持するバチルス・ブレビス。
3. （３）請求項２記載のバチルス・ブレビスを培地に培養
   し、培養物中にヒトＥＧＦを生成、蓄積せしめ、これを
   採取することを特徴とするヒトＥＧＦの製造法。