JPS6356277A - 新規バチルス・ブレビス及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なバチルス・ブレビス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）に関するものであ
る。

更に詳細には、遺伝子組換えにおける宿主菌としての新
規なバチルス・ブレビスに関するものである。

従来、一般に遺伝子組換えの微生物生産の宿主としては
、大腸菌が主に使用されているが、大腸菌では、組換え
遺伝子によって合成されるペプチドや蛋白質は細胞内に
とどまり培地中に分泌生産されないため、おのづとその
生産量は制限され。

また、細胞磨砕によりペプチド、蛋白質の抽出精製する
ための操作が煩雑になるなど多くの欠点が指摘されてい
る。

鵜高は、先に、遺伝子組換えにおける宿主菌として蛋白
質を菌体外に分泌する微生物を求めて研究した結果、蛋
白質を多量に分泌生産する微生物として、約１２００株
のなかからバチルス・ブレビス４株、新菌株バチルス・
プロテア−マンス（１’１ａｃｉｌｌｕｓ　ｐｒｏｔｅ
ｉｆｏｒｍａｎｓ）　１株の５株を分雛同定するに至っ
た。（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４０
（３）。

また、一方、分泌宿主−ベクターとして枯草菌も利用さ
れ、α−アミラーゼ、インターフェロンなど各種異種蛋
白質を培地中に？９積させることに成功しているが、菌
体内外の強いプロテアーゼにより生産量が制限されたり
、分解されたりして、良好な結果は得られていない。

先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフィルス（
１１ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）　ｎｖ−ｓの酎熱性α−アミラーゼ遺伝子をプ
ラスミドｐＵＢ１１０に組込んだｐＢＡＭｌｏｌ　を保
有するバチルス・ブレビス４７及び枯草菌を３７℃４８
時間培養した時、バチルス・ブレビス４７では約１５　
、０ＯＯＵ／ｎ＋Ｑ、枯草菌では３，０ＯＯＵ／ｍＱ程
度のα−アミラーゼをそれぞれ培地中に生産蓄積するの
を確認した。（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋　１６４ｅ
（３Ｌここに、全く同一のプラスミドを保有するバチル
ス・ブレビス４７（後述）と枯草菌とでは、耐熱性α−
アミラーゼの生産においてバチルス・ブレビス４７の方
が約５倍も生産効率のよいという事実から蛋白質生産菌
の有する蛋白質分泌能を用いることにより異種遺伝子産
物を効率良く分泌生産させうろことが判明した。

しかしながら、先に蛋白質を多量に菌体外に分泌生産す
る細菌として分離同定したバチルス・ブレビス４７．１
４４．４８１．８９９、バチルス・プロテイホーマンス
４４４の５株は、いずれも培地中に牛血清アルブミン（
以下ＢＳＡという。）を添加して生育させるとＢＳＡを
分解し、更にバチルス・ブレビス１４４゜４８１、８９
９．及びバチルス・プロテイホーマンス４４４の４株は
カゼイン分解活性も有していることが確認された。従っ
て、これら蛋白質を多量に菌体外に分泌生産する細菌を
宿主として組換え遺伝子によって異種遺伝子産物を分泌
生産させる時、効率良く分泌生産されたペプチド、蛋白
質が蛋白質分解酵素によって分解されると考えられた。

そこで１本発明者らは、蛋白質を著量分泌し、かつ、蛋
白質分解酵素を菌体外に全く生産しない菌株が見出され
れば、遺伝子組換えにおける宿主菌としてすぐれたもの
であるとの発想から、このような菌株を求めて鋭意選別
を行ったところ５各種試料から分離した約１００，００
０株のなかから、菌体外に著量の蛋白質を生産するが、
蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない株を２株単離する
ことに成功したのである。　ここに！ｌ’−離された２
株について、種の同定を行ったところ、いずれもバチル
ス・ブレビスに属すものと同定され、本発明を完成する
に到った。

本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産するが。

蛋白質分解酵素を菌体外に生産しないバチルス・ブレビ
スである。

また、本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産するが、
蛋白質分解酵素を菌体外に生産しないバチルス・ブレビ
スからなる遺伝子組換えにおける宿主菌である。

従来、バチルス・ブレビスにおいて、蛋白質を生産する
菌株は知られているが、周知の菌株はすべて蛋白質分解
酵素を菌体外に生産するものであって５本発明の、菌体
外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解酵素を菌体
外に生産しないバチルス・ブレビスは全く知られておら
ず、新規である。

本発明においては、蛋白質を５ｇ／Ｑ以上培地中に分泌
生産しかつＢＳＡ、カゼインのいずれの蛋白質をも分解
しない菌株を目標に選択分離された。

まず、土壌などの試料から分離された約１００，０００
株の菌株をＴ２寒天平板培地（１％グルコース、１％ペ
プトン、０．５％肉エキス、０．２％酵母エキス、１．
５％寒天末、ｐＨ７，０）に接種し、平板培地上でコロ
ニー周辺が５％過塩素酸に白濁する細菌を選択した。次
に、ここに分離した細菌株をＴ２液体培地（１５０ｍ１
２容三角フラスコ、培地量１０ＩＩ＋Ｑ）で振盪培養（
３０℃、４８時間）し、その培養濾液中に１．２ｇ／Ｑ
以上の蛋白質を生産する菌株を８０株得た。

菌体外蛋白質址のａｌｌ定においては、培養液に等量の
０　、２Ｎ　Ｎａ０ＩＩを加え攪拌後１０，０００ｒｐ
ｍ　Ｘ　５分遠心分離処理して菌体を除き、上清に等量
の１０％トリクロル酢酸を加えて１０分後３．ＯＯＯｒ
ｐｍ　Ｘ　１０分間遠心分離して沈殿を集め、ＩＮ　Ｎ
ａ１ｌ（で溶解した後Ｌｏｗｒｙ法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　１９３．２６５（１９５１））によって
定量し、蛋白質量は牛血清アルブミンとして換算した。

蛋白質高生産培地として第１表に示す培地を選んだ。

第１表　蛋白質高生産培地 これらの５種類の培地のすべての培地に、先に得られた
８０株の菌を振盪培養し、いずれかの培地で菌体外蛋白
質を５　ｇ／Ｑ以上生産する菌株を３１株選択した。

得られた３１株について１次に示す、８ＳＡの分解性の
測定及びミルクカゼインの分解性の測定を行った・ （ｆｌｓＡの分解性の測定） Ｔ２培地を１５０＋ｏＱ用三角フラスコに１０ｍｌ１分
注後オートクレーブ殺菌し、無菌濾過したＢＳＡ　（Ｓ
ｉｇｍａＡ４５Ｑ３）溶液を最終濃度３．２ｍｇ／ｓＱ
になるように添加し、１晩前培養した菌株を０．２ｔＱ
接種後３７℃で２００ｒｐｍにて振盪培養した。

培養２４時間、４８時間、７２時間後にサンプリングし
た培養濾液を１０．０００ｒｐｍ　５分間遠心分雌した
培養上清６２５　μＮに０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐ
１１６．８）１２５１２．１０％５Ｏ３２００μｇ、β
−メルカプトエタノール５０μＱを添加し攪拌後沸臆水
中で３分間熱処理後Ｏ，ＯＳ％ＢＰＢと７０％グリセロ
ールを含む０．０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ６，
８）の０．１ｍＭを加え５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）用の試料とした。スラ
ブ５Ｏ５−ＰＡＧＥは１０％のアクリルアミド濃度で行
なった。蛋白質の検出はクーマシブリリアントブルーに
よる染色により行った。培養２４時間、４８時間、７２
時間すべてにおいてＢＳＡを分解しなかった菌株を、Ｕ
ＳＡの分解性のない菌株とした。

（ミルクカゼインの分解性の測定） スキムミルク５ｇ、２ｇ、Ｉｇを各々５０＋ｏ　ｎ純水
に懸濁した液と寒天１ｇを純水５０ＩＩＱに溶かした液
を別々にオートクレーブで殺菌後両者を混合後シャーレ
に分注して、５％、２％、１％ミルク寒天平板培地を作
った。平板培地に菌株を植苗後３７℃にて３０間培養し
コロニーの周りが透明になるかどうかｌ１ｌｒ？した。

５％、２％、１％ミルク寒天平板培地のすべてに全く透
明用をつくらない菌株をミルクカゼインの分解性のない
菌株とした。

以上の測定の結果、８１０２株とＨ５０３株の２株をｆ
ｌｓＡ及びミルクカゼインをともに分解しないことから
。

蛋白質分解酵素を菌体外に生産しない菌株として選択し
た。また、８１０２株とＨ３Ｏ３株の第１表各培地での
菌体外蛋白質生産量の一例を示すと第２表のようであっ
た６ 第２表　８１０２株、８５０３株の菌体外蛋白質の生産
性生産蛋白質（ｇ／ｆｉ） ５ＹＫＣ５Ｙ　　　５ＫＧ　　、ＩＹ　　　ＩＫＨ１０
２８，１４，１５，３５，７６，９）１５０３　　　７
．６　　２．３　　１．６　　０．９　　０．６旧０２
株と１１５０３株を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ（第８版）及び、ＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔｅ（Ａ　
１ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｎ　１（ａｂｉｔａｔｓ、　ｌ
５ｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）によって同定したところ
、両菌株とも、まず、好気性、ダラム染色陽性、桿菌、
胞子を形成する点においてバチルス屈に属するものと認
められ、次に、カタラーゼ陽性、ｖ−ｐ反応陰性、６５
℃での生育不能、澱粉の分解陰性、嫌気条件下での生育
不能、グルコースから酸の生成（培地、ＩＱ中プロテオ
ースペプトン７ｇ、食塩５ｇ、グルコース５ｇ、ブロム
クレゾールパープル０．００８ｇ）陽性、７％食塩存在
下で生育不能、の点↓こおいて、両菌株はバチルス・ブ
レビスに属するものと同定された。ただし、バチルス・
ブレビスはカゼインを分解する、とされているが１両画
株にはカゼインを分解する能力はない。

かくて、両菌株はバチルス・ブレビス１１１０２、バチ
ルス・ブレビス１１５０３と命名された。

バチルス・ブレビス旧０２はＦＥＲＭ　ＢＰ−１０８７
とじて微工研に寄託され、バチルス・ブレビスＨ３Ｏ３
はＦＥＲＭ　ＢＰ−１０８８として微工研に寄託されて
いる。

次に、バチルス・ブレビス旧０２及びバチルス・ブレビ
ス１１５０３の菌学的性質を示す。

（Ａ）形態的性質 （Ｂ）各培地における生育状態 （Ｃ）生理学的性質 本発明の、菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質
分解酵素を菌体外に生産しないバチルス・ブレビスとし
てはバチルス・ブレビス旧０２及びノくチルス・プレビ
ス１１５０３をもって代表菌株とすることができる。

本発明の新規バチルス・ブレビスを培養することにより
著量生産した蛋白質の性質次第では、それ自体食糧蛋白
質やゲル化剤、膨化剤等の食品加工素材または、ガラス
様素材１紙、人工皮革等の表面加工等の工業素材として
の利用等産業上の有用性が非常に高い。

本発明の新規バチルス・ブレビスは、遺伝子組換えによ
る生産物を効率よく菌体外に分泌することができ、そし
て、遺伝子組換えによる生産物を分解することがないの
で、遺伝子組換えにおける宿主菌としてきわめてすぐれ
たものである。

この系を利用して、医薬品、良質の食糧蛋白質やゲル化
剤、膨化剤等の食品素材、または、ガラス様素材、紙、
人工皮革等の表面加工等の工業用素材などの生産手段と
することは産業上非常に有用なものである。

以上の様に１本発明の有用性は産業上極めて意義深いも
のである。

次に、本発明の新規バチルス・ブレビスの利用例につい
て説明する。

利用例 （好熱菌α−アミラーゼ遺伝子の大腸菌へのクローニン
グ） 好熱菌バチルス・ステアロサーモフィラスＤＹ−５の染
色体ＤＮＡを制限酵素１１ｉｎｄＩＩＩで部分的に加水
分解し、一方大腸菌のプラスミドベクターであるｐＨｌ
３２２はｌｌ１ｎｄＩＩＩで完全加水分解後、アルカリ
性ホスファターゼ処理を行った。両ＤＮＡを混合しＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌を形質転換し、アンピ
シリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質転換株より
α−アミラーゼ生産株を以下のようにして選択した。形
質転換株を濾紙上にうつし、コロニー側を上にして下側
からコロニーを溶菌し、次いで濾紙を１％の可溶性デン
プンを含むプレート上にコロニー側を下側にしてのせ、
１夜３７℃で保温後、ヨードデンプン反応によりコロニ
ーの回りに透明なゾーンを作る株を選択した。しかし活
性が強い場合には形質転換株を１％可溶性デンプンを含
む培地上にレプリカして、直接ヨードデンプン反応によ
りハローを観察することができる。

約６　、０００個の形質転換株より４個のα−アミラー
ゼ生産株（Ｈ１１００〜１ＩＩ４００）を分離すること
ができた。

これらの株の保有するプラスミドを解析した結果、Ｐ旧
１００は６．４にｂと２．５Ｋｂのバチルス・ステアロ
サーモフィラスＤＮＡ由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含み
、ｐＨＩ２００〜ｐＨＩ４００は同一の６．４Ｋｂの現
ユｄＩＩＩ　ＤＮＡ断片を有していた。その制限酵素地
図を第１図に示す。ｐＨｌ３００は６．４Ｋｂとまだ長
いＤＮＡ断片を保有しているのでプラスミドの小型化を
行い３．２ＫｂのＤＮＡ断片を含むｐＨｌ３０１を得た
。

（好熱菌α−アミラーゼ遺伝子のサブクローニング） 枯草菌や蛋白質生産菌のようなグラム陽性菌中でα−ア
ミラーゼ遺伝子を発現させるためにはプラスミドｐＵＢ
１１０のようなグラム陽性菌中で複製可能なプラスミド
上にα−アミラーゼ遺伝子を移し変える必要があり、第
２図に示した手順でサブクローニングを行った。ｐＵＢ
１１０上には１ｌｉｎｄＩＩＩｌ１ｎｄＩＩＩないので
、まずＰＵＢＩＩＯとｐＨｌ３２２の複合プラスミドを
作製した後、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｇｌｌＩで完全加水
分解しアルカリ性ホスファターゼ処理を行った。一方α
−アミラーゼ遺伝子を含むｐ＋１Ｉ３０１はまずｌ１ｉ
ｎｄＩＩＩで完全加水分解後、Ｉ３ａｍＨＩで部分的に
加水分解した。両ＤＮＡを混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼで連結し、α−アミラーゼを生産しない枯草菌（Ｂ。

５ｕｂＬｊｌｊｓ　ｌＡ２８９）をプロトプラスト法で
形質転換し、カナマイシン耐性でα−アミラーゼを生産
する株を選択した。枯草菌のα−アミラーゼ生産株は最
初に計画した通りｐＨｌ３０１上のα−アミラーゼ遺伝
子を完全に含むプラスミドρ［ｌＡＭｌｏｌ　を保有し
ていた。

ついで、ｐＢＡＭｌｏｌを用いてα−アミラーゼを生産
しない本発明菌株バチルス・ブレビス旧０２、及び蛋白
質分解酵素を有しα−アミラーゼを生産しないバチルス
・ブレビス４７．８９９をＴｒｉｓ−ＰＥＧ’ｄ’＋　
（Ｊ　。

［３ａｃｔｅｒｉｏ１．、１５６．１１３０〜１１３４
（１９８３））で形質転換し、ネオマイシン耐性でα−
アミラーゼ生産株を選択し、ｐＢＡＭｌｏｌ　を保有す
る形質転換株を分離した。

（各種宿主で生産されるα−アミラーゼの性質）ｐ１３
ＡＭ１０１を保有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓｌＡ２８！１）、蛋白質生産菌バチルス・
ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）旧０２．
４７及び８９９の生産するα−アミラーゼの性質を好熱
菌バチルス・ステアロサーモフィラスＤＹ−，）の生産
するα−アミラーゼと比較した結果、すべての場合、耐
熱性、好熱性ともに好熱菌のα−アミラーゼと同様で、
α−アミラーゼは８０℃付近まで安定で至適温度は７０
″〜８０℃に１ｇ２？Ｊされた。またα−アミラーゼの
分子量もいずれの場合も約６万でほぼ同一であった。

（各種宿主におけるα−アミラーゼの生産性）ｐＢＡＭ
ｌｏｌを保有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓＩＡ２８９）　、蛋白質生産菌バチルス・ブレ
ビス８１０２゜４７及び８９９を３７℃で振盪培養し、
経時的にサンプリングした培養液を１０，０ＯＯｒｐ■
Ｘ５分間遠心分離し、得た培養上清のα−アミラーゼ活
性を測定した。

α−アミラーゼの測定は不敏の方法に従い４０℃で測定
した。

５Ｙ＋ネオマイシン６０μｇ／ｍｌに４８時間培養した
時、枯草菌は５００／ｍｆｌ、蛋白質分解活性のない蛋
白質生産菌バチルス・ブレビス旧０２は約３０，０ＯＯ
Ｕ／ｍｕ、蛋白質分解活性を有するバチルス・ブレビス
４７は約１．３０００／ｎ１２．バチルス・ブレビス８
９９はｌ　、　６００υ／ａＱのα−アミラーゼを培養
液中に蓄積した。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ、ｂ、ａは、それぞれｐ）ｌｉｌｏＯ，ｐＨｌ
３０１゜ｐＨｌ３００の制限酵素地図を示す図で、太い
線はＢ。 Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡを
、細い線はｐＢＲ３２２ＤＮＡを示す。Ａｐはβ−ラク
タマーゼ遺伝子の位置を示す。 第２図はα−アミラーゼ遺伝子のｐＵＢ１１０上へのサ
ブクローニングを示す図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　　２　　間

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解
   酵素を菌体外に生産しないバチルス・ブレビス。
2. （２）菌体外に著量の蛋白質を生産するが、蛋白質分解
   酵素を菌体外に生産しないバチルス・ブレビスからなる
   遺伝子組換えにおける宿主菌。