DE3786616T2 - Bacillus brevis-Stämme und ihre Verwendung. - Google Patents
Bacillus brevis-Stämme und ihre Verwendung.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft Bacillus brevis Stämme, ihre Anwendung bei einem Verfahren zur Herstellung von Exopeptiden und Exoproteinen und die Anwendung als Wirte in der Gentechnologie.
- Im allgemeinen wurde in der Gentechnologie Escherichia coli als Wirt verwendet. Jedoch hat die Verwendung von E. coli viele Nachteile, wie beispielsweise, daß die durch rekombinierte Gene hergestellten Peptide oder Proteine nicht in die Medien sezerniert werden, sondern in den
- Zellen verbleiben, so daß ihre Herstellung auf natürliche Weise eingeschränkt wird und daß darum die Extraktion und
- Reinigung der Peptide oder Proteine komplizierte Verfahren, wie Zellzerkleinerung und Affinitätschromatographie, einschließt.
- Udaka et al. führten Studien durch, um Mikroorganismen zu finden, die in der Lage sind, in der Gentechnologie Proteine aus den Wirtzellen zu sezernieren, und isolierten und identifizierten schließlich fünf Stämme, die einschließen vier Stämme, die zu B. brevis gehören, und einen, der zu Bacillus proteiformans gehört, wobei jeder unter den etwa 1 200 Stämmen (cf. Argic. Biol. Chem., 40 (3), 523-528 (1976)) große Mengen Proteine sezerniert.
- Ferner wird B. subtilis verwendet als sezernierender Wirt und um eine Akkumulation verschiedener, heterologer Proteine, einschließlich α-Amylase und Interferon, zu erhalten. Aus der WO 86/01825 sind bestimmte Bacillus subtilis-Stämme mit verringerten, extrazellulären Proteasespiegeln bekannt. Genauer gesagt werden solche Bacillus subtilis-Stämme, die verringerte Spiegel extrazellulärer Protease aufweisen, hergestellt durch Ersatz der nativen chromosomalen DNA-Sequenz, welche die Gene umfaßt für eine extrazelluläre Protease, wie Subtilisan, mit einer teilweise homologen DNA-Sequenz, welche ein darin inseriertes, inaktivierendes DNA-Segement aufweist. Die Stämme sind als Wirte zur Expression und Sekretion heterologer Polypeptide oder Proteine nützlich. Jedoch ergeben diese Versuche nicht notwendigerweise zufriedenstellende Ergebnisse, da die Proteasen, die innerhalb oder außerhalb der Zellen vorhanden sind, in der Regel die Menge der Produkte begrenzen oder dieselben sogar abbauen.
- Bereits früher fanden Udaka et al., daß B. brevis 47, der pBAM101 enthielt, der erhalten wurde durch Einbau eines wärmestabilen α-Amylasegens von Bacillus stearothermophilus DY-5 in das Plasmid pUB110, und B. subtilis, welcher pBAM101 enthält, etwa 15 000 U/ml und 3 000 U/m α-Amylase im Medium produzierten, wenn sie bei 37ºC 48 Stunden lang (cf. J. Bacteriol., 164 (3), 1182-1187 (1985)) gezüchtet wurden.
- Somit wurde bewiesen, daß ein heterologes Genprodukt wirksam produziert werden kann, indem die proteinsezernierende Fähigkeit eines Protein-produzierenden Bakteriums, B. brevis 47, da B. brevis 47, das unten ausführlich beschrieben wird, etwa fünfmal so viel wärmestabile α-Amylase produzieren kann wie B. subtilis, das dasselbe Plasmid wie jener aufweist.
- Alle die oben genannten fünf Stämme, die jeweils als Bacterium isoliert worden sind, welches in der Lage ist, eine große Menge von Proteinen aus den Zellen zu sezernieren, d. h. B. brevis 47, 144, 481 und 899 und B. proteiformans 444, zersetzen jedoch in der Regel Rinderserumalbumin, das im folgenden als BSA abgekürzt wird, wenn sie in einem Medium gezüchtet werden, welches BSA enthält. Darüber hinaus wurde bewiesen, daß B. brevis 144, 481 und 899 und B. proteiformans 444 weiterhin in der Lage sind, Casein zu zersetzen. Diese Tatsachen legen nahe, daß Peptide und Proteine, die von diesen Bakterien wirksam produziert werden, die jeweils als Wirt eingesetzt werden, welcher in der Lage ist, bei der Produktion eines heterologen Genprodukts eine große Menge an Protein aus den Zellen zu sezernieren, wobei ein rekombiniertes Gen verwendet wird, mit Protease abgebaut werden können.
- Somit ist es Aufgabe der Erfindung, einen mikrobiellen Stamm zu finden, der in der Lage ist, eine große Menge Protein, jedoch keine Protease aus den Zellen zu sezernieren.
- Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch den Bacillis brevis-Stamm H102 (FERM BP-1087) und H503 (FERM BP-1088), die jeweils in der Lage sind, Exoprotein zu produzieren, jedoch nicht in der Lage sind, eine Exoprotease zu produzieren, die Rinderserumalbumin abbaut, und ferner nicht in der Lage sind, eine Exoprotease zu produzieren, die Casein abbaut.
- Ein besonderes Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Exopeptids oder Exoproteins mittels rekombinanter DNA nach Anspruch 2 umfaßt die Verwendung des Bacillis brevis- Stammes H102 (FERM BP-1087) oder des Bacillus brevis- Stammes H503 (FERM BP-1088).
- Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 3 ist der Wirt in der Gentechnologie, der der Bacillis brevis-Stamm H102 (FERM BP-1087) oder der Bacillus brevis-Stamm H503 (FERM BP-1088) ist.
- Genauer gesagt wurde gefunden, daß das Material in der Gentechnologie als ausgezeichneter Wirt verwendet werden kann. Während ein solcher Stamm, wie oben beschrieben, unter etwa 100 000 Stämmen, die aus verschiedenen Proben isoliert worden waren, gesucht wurde, ist es bei der Erfindung gelungen, zwei Stämme zu isolieren, die eine große Menge Protein, jedoch keine Protease aus den Zellen produzieren. Beide der zwei Stämme gehören zu B. brevis.
- Während einige B. brevis-Stämme bekannt sind, die Protein produzieren, produzieren diese bekannten Stämme aus den Zellen auch Proteasen. Die erfinderischen B. brevis-Stämme sind neu, da sie eine große Menge Protein, aber keine Protease aus den Zellen produzieren.
- Die Fig. 1-a, b und c zeigen die Restriktionsenzymkarten von pHI100, pHI301 bzw. pHI300, worin eine dicke Linie eine DNA darstellt, welche aus B. stearothermophilus stammt, während eine dünne Linie die DNA von pBR322 darstellt. Ap zeigt den Locus eines β-Lactamasegens. Fig. 2 zeigt die Subklonierung eines α-Amylasegens auf pUB110.
- Erfindungsgemäß wird die Auswahl von Stämmen durchgeführt, um jene zu isolieren, die 5 g/l oder mehr Protein in die Medien sezernieren und weder BSA noch Casein abbauen.
- Zunächst wurden etwa 100 000 Stämme, welche aus verschiedenen Proben isoliert worden waren, wie aus Erdböden, auf T2-Agarplatten als Medium (pH 7,0) überimpft, welches 1% Glucose, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,2% Hefeextrakt und 1,5% Agarpulver enthielt. Dann wurden 5% Perchlorsäure zu der Kultur gegeben und die Stämme, die um die Kolonien eine Trübung zeigten, wurden ausgewählt. Die isolierten Stämme wurden in 10 ml-Portionen aus flüssigem T2-Medium in einem 150 ml-Erlenmeyerkolben unter Schütteln bei 30ºC 48 Stunden lang gezüchtet. Somit wurden 80 Stämme erhalten, wobei jeder 1,2 g/l oder mehr Protein in das Kulturfiltrat produzierte.
- Das extrazelluläre Protein wurde bestimmt, indem 0,2 n NaOH in das Medium gegeben wurde, das resultierende Gemisch gerührt und bei 10 000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert wurde, um so die Zellen zu entfernen, indem dieselbe Menge 10% Trichloressigsäure zudem Überstand gegeben wurde, das resultierende Gemisch nach 10 Minuten bei 3 000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert wurde, um so den Niederschlag zu sammeln, indem der erhaltene Niederschlag in 1 n NaOH aufgelöst wurde und das Protein nach dem Verfahren von Lowry (cf. J. Biol. Chem. 193: 265, (1951)) bestimmt wurde. Die Menge des Proteins wurde bestimmt, bezogen auf BSA.
- Tabelle 1 zeigt Medien, die zur wirksamen Produktion des Proteins ausgewählt werden. Tabelle 1 Medien zur wirksamen Produktion von Protein Zusammensetzung/Medium Glucose Polypepton Hefeextrakt
- 80 Stämme, wie oben erwähnt, wurden jeweils auf fünf dieser Medien überimpft und dann unter Schütteln gezüchtet. Somit wurden 31 Stämme ausgewählt, die 5 g/l oder mehr etxtrazelluläres Protein in einem oder mehreren dieser Medien produzierten.
- Die Fähigkeiten dieser 31 Stämme, BSA und Milchcasein abzubauen, wurde folgendermaßen bestimmt.
- Bestimmung der Fähigkeit, BSA abzubauen:
- 10 ml-Portionen T2-Medium wurden in 150 ml Erlenmeyerkolben pipettiert und in einem Autoklaven sterilisiert. Dann wurde eine aseptisch filtrierte BSA-Lösung (Sigma A44503) zu dem Medium in jeder Flasche gegeben, um eine Endkonzentration von 3,2 mg/ml zu ergeben. Das Medium wurde mit 0,2 ml eines über Nacht gezüchteten Stammes angeimpft. Dann wurde der Stamm darin unter Schütteln bei 200 UPm bei 37ºC gezüchtet.
- Filtratproben, die 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Beginn der Züchtung gesammelt wurden, wurden bei 10 000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert. Zu 625 ul eines jeden so erhaltenen Überstandes wurden 125 ul 0,5 M Tris- HCl (pH 6,8), 200 uml 10%SDS und 50 ul β-Mercaptoethanol gegeben. Das Gemisch wurde gerührt. Nach einer Behandlung des Gemisches mit Hitze in kochendem Wasser 3 Minuten lang wurden 0,1 ml 0,625 M Tris-HCl (pH 6,8) hinzugegeben, welche 0,05% BPB und 70% Glycerin enthielt, um eine Probe für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zu ergeben. Die SDS-PAGE-Schicht wurde bei einer Acrylamidkonzentration von 10% durchgeführt. Das Protein wurde durch Anfärben mit Coomassiebrilliantblau detektiert. Somit wurden Stämme, die BSA in einer der 24, 48 und 72stündigen Kultur nicht abbauten, als nicht fähig angesehen, BSA abzubauen.
- Bestimmung der Fähigkeit, Milchcasein abzubauen:
- 5 g, 2 g und 1 g Magermilch wurden jeweils in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert. Getrennt davon wurden 1 g-Portionen Agar jeweils in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Nach dem getrennten Sterilisieren in einem Autoclaven wurden die Suspensionen mit den Lösungen vermischt und auf Petrischalen pipettiert, um 5%, 2% und 1% Milchagarmedien zu ergeben. Jeder Stamm wurde auf diese Platten überimpft und darauf bei 37ºc drei Tage lang gezüchtet, um zu beobachten, ob die Umgebung jeder Kolonie klar werden würde oder nicht. Somit wurden Stämme, die keinen klaren Hof um ihre Kolonien in irgendeinem der Milchagarmedien von 5%, 2% und 1% zeigten, als nicht fähig betrachtet, Milchcasein abzubauen.
- Folglich wurden die Stämme H102 und H503, bei denen sich erwies, daß sie weder BSA noch Milchcasein bei den oben erwähnten Tests abbauten, als solche Stämme ausgewählt, die keine Protease aus den Zellen produzierten. Tabelle 2 zeigt Beispiele der Produktion von Protein durch die Stämme H102 und H530 in die in Tabelle 1 gezeigten Medien. Tabelle 2 Extrazelluläre Proteinproduktionen der Stämme H102 und H503 Produziertes Protein (g/l)
- Die Stämme H102 und H503 wurden identifiziert gemäß den Verfahren, die beschrieben sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8.Ausgabe) und der Prokaryot (A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria). Als Ergebnis werden beide Stämme als zu der Gattung Bacillus gehörig betrachtet, das sie aerob, grampositiv und stäbchenförmig sind und Sporulation zeigen. Des weiteren werden beide Stämme als zu B. brevis gehörig identifiziert, da sie sich gegenüber der Catalase positiv und gegenüber der VP-Reaktion negativ verhalten, bei 65ºC nicht wachsen können, irgendwelche Stärken nicht abbauen, unter anaeroben Bedingungen nicht wachsen können, Säure aus Glucose in einem Medium bilden, welches 7 g/l Proteasepepton 5 g/l NaCl, 5 gl/l Glucose und 0,008 g/l Bromcresolblau enthält und in Gegenwart von 7% NaCl nicht wachsen können. Obwohl angenommen wird, daß B. brevis Casein abbaut, zeigten diese zwei Stämme nicht die Fähigkeit zum Abbau desselben.
- Demgemäß werden die zwei Stämme als B. brevis H102 und B. brevis H503 bezeichnet. Sie wurden als FERM BP-1087 bzw. FERM BP 1088 bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology Japan hinterliegt.
- Jetzt werden die mikrobiologischen Eigenschaften von B. brevis H102 und H503 erläutert. (A) Morphologische Eigenschaften B. brevis H102 Zellgröße (u) Zellform Bacillus Polymorphismus nein Motilität ja (peritrichal) Sporulation Sporenform oval Sporulationsteile Mitte - Enden Sporengröße (u) Sporangiumform geschwollen Gram-Anfärbung Säureschnelligkeit nein (B) Wachstum in verschiendenen Medien H102 Nährmedium auf Agarplatte (30ºC, 2 Tage) Wachstum etwas schlecht gut Oberfläche glatt Farbe blaß gelblich braun Glanz glänzend, durchscheinend etwas glänzend, trübe Form kreisförmig Auswölbung flach-konvex Rand voll Agarnährlösung als Schrägmedium mittel glatt - etwas rauh leicht bräunlich grau Filarie Flüssiges Nährmedium Trübung nein deutlich Wachstum auf flüssiger Oberfläche vereinzelt filmartig Niederschlag Spur mittel Gelatinestichkultur Wachstum Oberfläche Verflüssigung nein Lackmusmilch Abnahme alkalisch Agglutination und Verflüssigung nicht verflüssigt (C) Physiologische Eigenschaften a H102 Reduktion von Nitrat Denitrifizierung MR-Test VP-Test, Bildung von Acetoin Indolbildung Schwefelwasserstoffbildung Hydrolyse von Stärke Verwendung von Zitronensäure Koser Christensen Verwendung einer anorganischen Stickstoffquelle Nitrat Ammoniumsalz Farbstoffbildung (King's Medium) fluoreszierend, gelblichgrün Urease Oxidase Catalase Wachstums pH-Wert (pH-Optimum) Maximale Wachstumstemperatur Optimaltemperatur Verhalten gegen Sauerstoff aerob O-F Test (Hugh-Leifson Verfahren) nicht abgebaut oxidiert Abbau von Casein Abbau von DNA Beständigkeit gegenüber NaCl: Säurebildung aus Glucose Bildung von Säure und Gas aus einer Kohlenstoffquelle (-:keine) H102 Säure Gas L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke
- Typische Beispiele für erfindungsgemäße B. brevis-Stämme, die eine große Menge Protein, jedoch keine Protease aus den Zellen produzieren, schließen ein B. brevis H 102 und H503.
- Die Proteine, die der se in einer großen Menge von den neuen, erfindungsgemäßen B. brevis-Stämmen produziert werden, sind in der Technik sehr nützlich, beispielsweise als Lebensmittelmaterialien, wie eßbare Proteine, ein Geliermittel oder Blähmittel, oder als industrielle Materialien, wie Oberflächenbehandlungsmittel für glasartiges Material, Papier oder künstliches Leder.
- Die neuen, erfindungsgemäßen B. brevis-Stämme können Produkte, die gentechnologisch erhalten worden sind, wirksam aus den Zellen sezernieren und bauen die genannten Produkte nicht ab. Somit sind sie in der Gentechnologie ausgezeichnete Wirte.
- In der Technik ist es sehr nützlich, den oben erwähnten Mechanismus auf verschiedenen Gebieten anzuwenden, wie beispielsweise bei Pharmazeutika, Lebensmittelmaterialien einschließlich ausgezeichneter, eßbarer Protein, einem Geliermittel und Blähmittel oder bei industriellen Materialien einschließlich Oberflächenbehandlungsmitteln, glasartigem Material, Papier oder künstlichem Leder.
- Wie oben beschrieben, ist die Erfindung in der Technik sehr nützlich.
- Nun wird ein Anwendungsbeispiel für den neuen, erfindungsgemäßen B. brevis-Stamm gegeben.
- Die chromosomale DNA des thermophilen Bacillus stearothermophilus DY-5 wurde teilweise mit einem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Getrennt davon wurde pBR322, welcher ein Plasmid-Vektor von E. coli ist, vollständig mit HindIII verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Diese DNAs wurden vermischt und miteinander mit T4-DNA-Ligase verknüpft. Somit wurde E. coli transformiert, und α-Amylase-produzierende Stämme wurden aus den transformierten Stämmen ausgewählt, die gegen Ampicillin resistent und Tetracyclin empfindlich waren. Die transformierten Stämme wurden auf ein Filterpapier gegeben, wobei die Kolonieseite nach oben und die bakteriolysierte Seite nach unten zeigte. Dann wurde das Filterpapier auf eine Platte gegeben, die 1% lösliche Stärke enthielt, wobei die Kolonieseite nach unten zeigte und wurde über Nacht bei 37ºC gehalten. Die Stämme, die um jede Kolonie eine klare Zone zeigten, wurden mittels der Iod-Stärke-Reaktion ausgewählt. Im Falle eines transformierten Stammes, der eine deutlich hohe Aktivität zeigt, kann ein Hof beobachtet werden, in dem der genannte, transformierte Stamm in ein Medium repliziert wird, welches 1% lösliche Stärke enthält und direkt die Iod-Stärke- Reaktion bewirkt.
- Somit wurden vier α-Amylase-produzierende Stämme (HI100 bis HI400) aus etwa 6 000 transformierten Stämmen isoliert. Die Ergebnisse der Analyse der von diesen Stämmen getragenen Plasmide, legen nahe, daß pHI100 HindIII-Fragmente von 6,4 kb und 2,5 kb besitzt, die aus der B. stearothermophilus- DNA stammen, während pHI200 bis pHI400 dasselbe HindIII- DNA-Fragment von 6,4 kb aufweisen. Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymkarten davon. Da pHI300 noch das längere DNA-Fragment von 6,4 kb trug, wurde das Plasmid reduziert, um pHI301 zu ergeben, welches ein DNA-Fragment von 3,2 kb trug.
- Um ein α-Amylasegen in gram-positiven Bakterien wie B. subtilis, oder Protein-produzierenden Bakterien zu exprimieren, ist es erforderlich, das α-Amylasegen auf ein Plasmid zu transferieren, welches in gram-positiven Bakterien replizierbar ist, beispielsweise das Plasmid pUB110. Somit wurde die Subklonierung durchgeführt durch das in Fig. 2 gezeigte Verfahren. Da kein HindIII Bruchpunkt auf pUB110 existierte, wurde zunächst ein komplexes Plasmid aus pUB110 und pBR322 hergestellt. Das erhaltene, komplexe Plasmid wurde vollständig mit HindIII und BamHI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Getrennt wurde pHI301, welches das α-Amylasegen enthält, vollständig mit HindIII und dann teilweise mit BamHI verdaut. Diese DNAs wurden vermischt und mit T4-DNA- Ligase aneinander ligasiert. B. subtilis 1A289, der keine α-Amylase produzierte, wurde durch das Protoplastenverfahren transformiert. Ein α-Amylase-produzierender Stamm, der gegen Kanamycin resistent war, wurde ausgewählt. Der α-Amylase-produzierende Stamm von B. subtilis besaß ein Plasmid pBAM101, welches das gesamte α-Amylasegen, wie ursprünglich geplant, in pHI301 eingeschloß.
- Dann wurde der Stamm B. brevis H102, welcher keine α-Amylase produzierte und einer der erfindungsgemäßen Stämme ist, sowie B. brevis 47 und 899, welche eine Protease aufwiesen und keine α-Amylase produzierten, unter Verwendung von pBAM101 durch das Tris-PEG-Verfahren (cf. J. Bacteriol., 156, 1130-1134 (1983)) transformiert. Anschließend wurden α-Amylase-produzierende, gegenüber Neomycin resistente Stämme ausgewählt. Es wurden transformierte Stämme, die pBAM101 trugen, isoliert.
- Eigenschaften der von verschiedenen Wirten produzierten α-Amylase:
- Die Eigenschaften der von B. subtilis 1A289 und von den Protein-produzierenden Stämmen B. Brevis H102, 47 und 899 produzierten α-Amylasen, wobei die vier Stämme pBAM101 beherbergten, wurden mit den α-Amylasen verglichen, die von den thermophilen B. spearothermophilus DY-5 produziert worden waren. Als Folge waren die zuvor genannten α-Amylasen hinsichtlich der Wärmestabilität und Thermophilie vollständig dieselben wie letztere. Die zuvor genannten α-Amylasen waren nämlich bis etwa 80ºC stabil und zeigten einen optimalen Temperaturbereich von 70 bis 80ºC. Ihre Molekulargewichte waren fast gleich, d. h. etwa 60 000.
- B. subtilis 1A289 und die Protein-produzierenden B. Brevis- Stämme H102, 47 und 899, wobei die vier Stämme pBAM101 beherbergten, wurden unter Schütteln bei 37ºC gezüchtet. Von jeder Kulturflüssigkeit wurden Proben zu gegebenen Intervallen genommen und bei 10 000 Upm fünf Minuten lang zentrifugiert. Die α-Amylaseaktivität in dem erhaltenen Überstand wurde dann gemäß dem Verfahren von Fuwa bei 40ºC bestimmt.
- Somit waren B. subtilis, der Protein-produzierende B. brevis-Stamm H102, die nicht fähig sind, Protein abzubauen, und die Stämme B. brevis 47 und 899 jeweils in der Lage, Protein von α-Amylase in den Medien abzubauen, welches akkumuliert war zu 50 U/ml, etwa 30 000 U/ml, etwa 1 300 U/ml bzw. 1 600 U/ml, wenn sie in einem 5Y-Medium mit 60 ug/ml Neomycin 48 Stunden gezüchtet wurden.
Claims (3)
1. Bacillus brevis-Stämme H102 (FERM BP-1087) und H503
(FERM BP-1088), die jeweils in der Lage sind, Exoprotein
zu produzieren, jedoch nicht in der Lage sind,
Exoprotease zu produzieren, die Rinderserumalbumin
abbaut, und ferner nicht in der Lage sind, Exoprotease
zu produzieren, die Casein abbaut.
2. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Exopeptids
oder Exoproteins mittels rekombinanter DNA, welches
umfaßt die Verwendung des Bacillus brevis-Stammes H102
(FERM BP-1087) oder des Bacillus brevis-Stammes H503
(FERM BP-1088) als Wirt.
3. Wirt in der Gentechnologie, der den Bacillus brevis-
Stamm H102 (FERM BP-1087) oder den Bacillus brevis-Stamm
H503 (FERM BP-1088) darstellt.
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