WO2005045005A1 - 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 - Google Patents

新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO
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brevibacillus
gene
choshinensis
hpd31
protein
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PCT/JP2004/016912
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Hiroshi Hanagata
Takayuki Nishijyo
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Higeta Shoyu Co., Ltd.
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a novel Previbacillus ⁇ Brevibacillus choskiiiensis. More specifically, the present invention relates to Brevibacillus spp. Sinensis which has a significantly reduced extracellular and intracellular proteolytic activity and does not form spores. In addition, the present invention relates to a method for producing a protein by genetic recombination using the Brevibacillus schiyosinensis as a host. Background art
  • Genetic recombination technology is difficult to isolate because of its presence in living organisms in very small amounts, and it has been extremely difficult to use proteins or polypeptides with arbitrary amino acid sequences in bacteria or animal cells. It has made it possible to produce a large amount of this as a host.
  • Various bacteria are used as hosts for protein production by genetic recombination The most widely used bacteria are large S. cerevisiae.
  • Escherichia coli as a host, the produced protein accumulates in the cells, and the volume of cells becomes the upper limit of the amount of protein produced, resulting in large-scale production of protein. Is difficult.
  • Bacillus subtilis a typical bacterium capable of secreting and producing proteins, as a host.
  • Bacillus subtilis a typical bacterium capable of secreting and producing proteins
  • the produced recombinant protein is secreted and produced in the medium. Therefore, this dead Bacillus subtilis systems have excellent properties not found in Escherichia coli systems, such as no need for cell disruption to recover proteins and little endotoxin generation.
  • Bacillus subtilis has the property of secreting large amounts of proteolytic enzymes extracellularly, so that the secreted and produced recombinant protein is degraded by the proteolytic enzyme, and the yield of recombinant protein is reduced. There was a big problem that the number was extremely low. Therefore, various efforts have been made to reduce the production of Bacillus subtilis proteolytic enzymes. Nevertheless, little has been known about the use of Bacillus subtilis-hosted recombinant protein production systems for the industrial production of heterologous proteins.
  • Bacillus subtilis in order to avoid this problem of the Bacillus subtilis system, a new recombinant protein that uses a bacterium that secretes and produces a recombinant protein outside the cell but does not secrete proteolytic enzymes outside the cell is used. Production system development was performed. As a result, Bacillus brevis 47 (Bacillus brevis 47), which has weaker protease activity than Bacillus subtilis and has a higher protein secretory productivity than Bacillus subtilis, has been disclosed. Bacillus brevis as a host successfully developed a recombinant protein production system.
  • Non-Patent Document 1 (Brevibacillus brevis), Brevibacillus brevis, etc.).
  • Bacillus brevis 47 also had a weak extracellular proteolytic activity.
  • Recombinant protein production using Bacillus brevis as a host requires a relatively long (usually about 313) culture power. Therefore, even if the extracellular proteolytic activity of Bacillus brevis cells is weak, the produced recombinant protein is degraded by the extracellular proteolytic activity and the yield of recombinant protein decreases. There was a case. To solve this problem, efforts have been made to further reduce the extracellular proteolytic activity of Bacillus previs.
  • Brevibacillus choshinensis HPD 31 is a strain in which Bacillus previs strains are screened over a wide range, have extremely low extracellular proteolytic activity, and have excellent protein secretion productivity.
  • FE RM BP — 1087 FE RM BP _ 68 63: same strain as Bacillus brevis H102 (Patent Document 2)
  • FE RM BP _ 68 63 same strain as Bacillus brevis H102 (Patent Document 2)
  • Previbacillus tyyosinensis HPD31-S5 Bacillus brevis H102 (Patent Document 2)
  • FERM BP-6623 This strain was deposited under the designation Bacillus brevis HPD31-S5) was isolated.
  • These strains have also been used as hosts in the production of various recombinant proteins, including human epidermal growth factor (hEGF).
  • hEGF human epidermal growth factor
  • Non-Patent Document 2 (in this document, Brevibacillus schiyosinensis HPD31 is referred to as Bacillus brevis HPD31). Others are shown.
  • Bacillus brevis 31-OK strain which is called a mutant Bacillus previs which does not substantially exhibit proteolytic enzyme activity (proteolytic activity)
  • proteolytic activity has also been disclosed (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 a band indicating that the proteolytic activity remains was confirmed in the results of the evaluation test of the proteolytic activity by the gelatin-PAGE method. The outside proteolytic activity was not lost. Furthermore, no elucidation of this extracellular proteolytic activity at the gene level has been made at all. That is, no proteolytic enzyme was isolated, and even the gene sequence was not even cloned.
  • these Brevibacillus schiyosinensis are obtained by screening or mutagenesis by treatment with a mutagen, and the proteolytic enzyme gene on the genome is identified. It was not obtained by inactivating the gene. Therefore, Brevibacillus tychodinensis, which has identified a proteolytic enzyme gene on the genome and further reduced the proteolytic activity by inactivating the gene, has not been known so far.
  • Brevibacillus tychosinensis is also known to cause lysis of some cells during culturing, and as a result, the intracellular proteins including intracellular proteases are eluted in the medium. Has been. For this reason, even a recombinant protein secreted and produced outside the cell may be degraded by the eluted intracellular protease.
  • the intracellular proteolytic activity of Brevibacillus reticulosinensis has not been elucidated at the gene level. That is, There is no known example of isolating intracellular proteolytic enzymes of Brevibacillus sp. Also, no example is known in which the cloning and sequencing of the intracellular proteinase gene are performed.
  • Plebibacillus schiyosinensis may form sporophytes, similar to Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis. Spore bodies have higher heat resistance than living cells (non-spore cells) and require strict sterilization conditions. For this reason, Brevibacillus tiyocinensis is used as a host, especially in the production of recombinant protein drugs that require assurance of complete sterilization and removal of bacterial cells, including spores, in the production line after completion of culture. However, the production required a rather difficult technology.
  • Brevibacillus choshinensis usable as a recombinant host in a wide range of industrial applications, including the production of recombinant protein drugs, mild sterilization conditions (without sporangial formation) Previbacillus that can be completely killed even at 60 ° C to 100 ° C).
  • the D value of living cells (non-spore cells) of Previbacillus choshinensis is less than 1 minute. It is about.
  • Bacillus subtilis SMS 275 (Patent Document 4: Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 28-87686) is disclosed as a non-spore-free strain.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 28-87686
  • Brevibacillus schiyoschinensis strains that have not been able to form spores, That is, there was no known strain that completely died even under mild sterilization conditions.
  • Patent Document 2
  • Patent Document 3
  • Brevibacillus choshinensis has extremely excellent properties as a host for genetic recombination, but in order to further enhance its industrial utility as a host for genetic recombination. Had several issues to be solved.
  • the objective is to obtain Brevibacillus tychosinensis whose extracellular proteolytic activity is much lower than that of known strains. Also, to obtain Brevibacillus tychosinensis whose intracellular proteolytic activity is significantly reduced as compared with known strains. Still further, the goal is to obtain Brevibee /consult chinensis that does not form sporophytes and therefore die completely under mild sterilization conditions.
  • the present invention relates to Brevibacillus sp. Chinensis, in which the extracellular proteolytic activity is significantly reduced compared to known strains, and the secretory production efficiency of the recombinant protein is improved. In addition, the intracellular proteolytic activity was significantly reduced compared to known strains, and the efficiency of accumulation and production of recombinant proteins in cells was improved.
  • Brevi Bacillus' Choshinensis Brevibacillus tychosinensis is completely killed under mild sterilization conditions because it has no spore-forming ability.
  • the extracellular and intracellular proteolytic activities are significantly reduced compared to known strains, the production efficiency of the recombinant protein is improved, and the lack of spore-forming ability leads to a milder It is intended to provide a Previbacillus 'Chou sinensis' which is completely killed under sterile conditions.
  • "the extracellular and intracellular proteolytic activities are significantly reduced compared to known strains" also includes the complete disappearance of the activities.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a protein by genetic recombination using the Brevibacillus tychodinens as a host.
  • the present inventors first obtained a strain of Brevibacillus tychosinensis which does not have a spore-forming ability by using, as a parent strain, Previbacillus tychosinensis HPD31, which has been used as a host for production of a recombinant protein, Attempt to obtain mutant strains First, a mutant strain was selected based on the change in colony morphology as an index. The strains that formed were selected. Furthermore, among these strains, those that could not confirm spores by microscopic observation were selected as strains having ⁇ fe that do not have sporulation ability.
  • an evaluation test for the ability to form spores was performed on these strains that may not have the ability to form spores, and strains that did not have the ability to form spores were selected. Furthermore, an evaluation test of the productivity of the recombinant protein using this strain as a host was performed, and a recombinant protein equivalent to the known strain Previbacillus typhosinens HPD31 used as a host for genetically modified recombinant proteins was used. A mutant having the above productivity was selected. As described above, the present inventors have obtained Brevibacillus' choshinensis having no sporulation ability. -.
  • the present inventors further sought to obtain Brevibacillus' Thiojicinensis strain in which extracellular and intracellular proteolytic enzyme activities were significantly reduced as compared with known strains.
  • Bacillus typhidinens strain used as parent strain Furthermore, the gene for the major protease was extracellularly and intracellularly inactivated.
  • the present inventors first attempted to clone a proteolytic enzyme gene in order to identify a proteolytic enzyme gene to be inactivated. As a result, the present inventors succeeded in cloning the genes of two types of novel proteases, namely, IMP, which is a major intracellular protease, and EMP, which is a major extracellular protease. Brevibacillus choshinensis was prepared by inactivating the gene.
  • the present inventors carried out the inactivation of a specific protein-degrading enzyme gene on the genome of Plebinovirus typhidinosa by the method according to known homologous recombination. As described below, each inactivation of each gene leaves a marker gene such as a drug resistance gene on the genome. Therefore, in order to perform multiple gene inactivation, it is necessary to delete marker genes such as drug resistance genes from the genome each time the gene is inactivated.
  • the present inventors used a system consisting of the FRT sequence and a yeast-derived F1p recombinase gene to delete the marker gene.
  • the present inventors evaluated the spore-forming ability and the proteolytic activity of the Brevibacillus tiodincinsis strain in which the extracellular and intracellular major protease enzymes thus obtained were inactivated. went. As a result, it was confirmed that the strain did not have a spore-forming ability, and that the extracellular and intracellular proteolytic activities were significantly reduced compared to the known strain Brevibacillus' Thiojicinensis HPD31. I affirmed. -In addition, this strain of Brevibacillus tychosinensis is used as a host for protein production by genetic recombination, and other known Brevibacillus tychosinensis is used.
  • Brevibacillus tyyosinensis in which extracellular proteolytic activity is significantly reduced compared to known strains and secretory production efficiency of recombinant protein is improved, and intracellular proteolytic activity is known.
  • the strain is much lower than that of S. cerevisiae, and the efficiency of accumulation and production of recombinant proteins in cells has been improved.Because it has no sporulation ability, it is completely sterilized under mild sterilization conditions. Providing Brevibacillus chiyosinensis to die.
  • the present invention provides a method for producing a protein by genetic recombination using the Brevibacillus tychodinensis as a host.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a gene inactivation method by homologous recombination used for producing Brevibacillus sp. Chinensis of the present invention.
  • FIG. 3 is a drawing showing the results of measuring the protease activity of the culture supernatant fraction of SP 3 (lane 2).
  • the white frame shows the clear band generated due to the decomposition of gelatin due to the activity of the protein.
  • Brevibacil by gelatin-PAGE (zymograph) under native conditions 1 is a drawing showing the results of measuring the proteolytic enzyme activity of the intracellular fraction of Suchoeninsis HPD 31 (lane 1) and Brevibee / less' Choshinensis HPD31-SP3 (lane 2).
  • the white frame indicates the clear band generated due to the degradation of gelatin due to the protease activity.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of CBB staining of ptA IL-11 secreted and produced by genetic recombination using Previbacillus choshinensis HPD31 and Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 as hosts.
  • 1 is a drawing showing secretion production and degradation of IL-1 ⁇ .
  • Lane 1 shows the genetically modified product Previbacillus tychosinensis HPD3 l / p ⁇ 301—pIL—1] 3.
  • Lane 2 shows the genetically modified product Previbacillus choshinensis HPD31-SP3 / pNY301.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting by the present inventors, showing the secretory production and degradation of porcine IL-1 / 3.
  • Lane 1 shows the genetically modified Brevibacillus' Cowshinensis HPD 3 l / NY301-p IL-li3
  • lane 2 shows the genetically modified Brevibacillus, Chiyoshinensis HPD31-SP3 / ⁇ 301-pi L_ Indicates 1/3.
  • FIG. 3 is a drawing showing the results of Western plots using an antibody, showing the accumulation and production of porcine IL-11 ⁇ in cells and the decomposition.
  • Lane 1 shows the genetically modified Brevibacillus schiyosinensis HPD 31 / ⁇ " ⁇ 301
  • Lane 2 shows the genetically modified Brevibacillus schiyosinensis HPD31 / ⁇ 301— ⁇ INF- ⁇
  • Lane 3 shows the transgenic Brevibacillus' choshinensis HPD31-SP3 / pNY301-pIFN- ⁇ . .
  • the primers imp Pl and imp P 2 are shown.
  • the primer flp P4 is shown. .
  • the primer fl p P6 is shown.
  • the primers emp P i, e mp P 2 of the base sequence and Amino acid sequence data.
  • Example 19 shows a sense primer in Example 20.
  • Example 14 shows a sense primer in Example 21.
  • Example 13 shows a sense primer in Example 24.
  • Example 17 shows a sense primer in Example 25.
  • the antisense primer is shown. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
  • the present invention includes the following (1) to (16) as examples of embodiments.
  • Previbacillus chosenius having the following mycological properties and not forming spores.
  • Liquid medium 0.4-O.6 X 1.5-4 / _im
  • Sporogenesis-related gene hos is inactivated, and non-spore-forming Brepino, chinores tyyodininsis.
  • Brevibacillus which does not form spores and has reduced or eliminated protease activity in extracellular and Z or intracellular cells.
  • Liquid medium 0.
  • a method for producing a protein comprising a step of culturing the transformant of Brevibacillus' choshinensis according to (14).
  • a method for producing a recombinant protein which comprises using the Brevibacillus chochosinensis according to any one of the above (1) to (13) as a host for recombinant protein production.
  • the Brevibacillus tychosinensis having no spore-forming ability of the present invention is obtained by subjecting a parent strain, Brevibacillus tychosinensis, to drug treatment with a mutagen, and from the mutant strains obtained as a result of the drug treatment. It was obtained by selecting a strain having no sporulation ability. In the experiment ⁇ , nitrosoguanidine was used as a mutagen, but nitrite, methanes / ethyl methacrylate, etc.
  • the parent strain for obtaining the mutant strain having no spore-forming ability of the present invention belongs to Previbacillus tychosinensis.
  • the strain is not particularly limited as long as it is a strain, but Brevi / Kutirus has been used as a host for protein production by genetic recombination. Choshinensis HPD 31 (FERM BP-1087) or its mutant strain Brevibacillus Sinensis HPD 31 -S5 (FERM BP-6623) is particularly preferred.
  • the presence or absence of spore-forming ability of the obtained mutant strain can be determined by a heat resistance test, measurement of D value, or the like.
  • the D value (D-va 1 ue) refers to the time in each temperature range where the number of all cells including viable cells (non-spore cells) and sporophytes is reduced to lZ10, and the D-va 1 ue Used as an indicator.
  • the Brevibacillus schidocinensis strain having no sporulation ability provided by the present invention was analyzed using a genomic library, and a gene presumed to be associated with sporulation was inactivated. I confirmed that This inactivated gene was named hose.
  • the DNA sequence of the sporulation-related gene hos the DNA nucleotide sequence of hos of Previbacillus schidocinensis HPD31 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence table (upper row in FIGS. 7 and 8). The amino acid sequence corresponding to the sequence is shown in SEQ ID NO: 2 (the lower part of FIGS. 7 and 8).
  • the extracellular and intracellular proteolytic activities of the present invention are characterized by the inactivation of the extracellular and intracellular major proteolytic enzyme genes on the Previbacillus' choshinensis genome.
  • the proteolytic enzyme gene on the genome of Brevibacillus chonsinensis to be inactivated is not particularly limited, in order to obtain Brevibacillus' choiosinensis of the present invention in which the proteolytic activity is significantly reduced. it can be exemplified intracellular major protease gene i mp and extracellular major protease gene e mp as.
  • nucleotide sequence of the DNA sequence of the emp gene of Brevi bacillus tychosinensis HPD31 is shown in SEQ ID NO: 3 (upper row in Figs. 9 to 11).
  • amino acid sequence of the corresponding extracellular proteolytic enzyme EMP of Previbacillus typhosinensis HPD31 is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 9: lower part of L1).
  • the DNA nucleotide sequence of the imp gene of Brevibacillus choshinensis HPD31 is shown in SEQ ID NO: 5 (upper row in FIGS. 12 to 13), and the cells of Previbacillus tychosinensis HPD31 corresponding to the DNA sequence are shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the inner major proteolytic enzyme IMP is shown in SEQ ID NO: 6 (lower part of FIGS. 12 to 13).
  • EMP and IMP are both novel proteins that have no more than 40% homology in amino acid sequence with known proteins.
  • amino acid sequence in which some amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added differs depending on the type of amino acid residue and the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. It means an amino acid sequence having 60% or more, preferably 7% or more, more preferably 80% or more homology to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is a protein comprising an amino acid sequence in which some amino acids have been substituted, deleted, inserted or added, as long as the protein has proteolytic activity, all of the amino acids can be treated with protease Included.
  • amino acid sequence in which some amino acids have been substituted, deleted, inserted or added differs depending on the types of amino and amino acid residues and the positions of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein.
  • the amino acid sequence has a homology of 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Cloning of the major intracellular proteinase gene imp and the extracellular major protease gene emp on the genome of Brevibacillus typhosinensis is expressed as Mo 1 ⁇ cu 1 ar Cloning 2 nd ⁇ ., AL b rat rat 9 ry Manu al, Old Spring Harbor Laboratory, New York (1989), etc.
  • a genomic DNA library of Brevibacillus tychosinensis was prepared, and a DNA fragment having a part of the DNA sequence encoding the gene to be inactivated was used as a probe for this genomic DNA library.
  • the hybridization can be performed by the hybridization method, or by the PCR method using this DNA fragment as a primer.
  • inactivation of the imp ⁇ gene or the emp gene on the genome of Brevibacillus choshinensis can be performed by a method according to known homologous recombination.
  • the inactivation of the imp gene can be performed by the following procedure. First, a DNA fragment containing the im gene is cloned into a vector that cannot be replicated in Previbacillus choshinensis, for example, a vector that can be replicated in Escherichia coli, and a partial region inside the imp gene is FRT sequence (Gene, 212, 77).
  • — 86 (1 998) is replaced with a DNA fragment consisting of a drug metamura gene (for example, neomycin resistance gene) having both sides, and the i gene is divided.
  • a vector containing the imp gene inactivated by partially replacing the neomycin resistance gene is obtained.
  • a second drug resistance gene for example, an erythromycin resistance gene
  • the vector for inactivating the imp gene is introduced into Brevibacillus schiyoschinensis, and a strain showing neomycin resistance is selected.
  • the imp gene inactivation vector in some Brevibacillus tiyoschinensis cells, the imp gene on the genome and the im gene on the imp gene inactivation vector were inactivated.
  • a homologous recombination reaction is induced with the imp gene.
  • the strains showing neomycin resistance showed that the homologous recombination reaction occurred only in the upstream part of the neomycin resistance gene-FRT cassette, and that the homologous recombination reaction occurred only in the downstream part of the FRT cassette.
  • the strain in which the imp gene on the target genome is inactivated is a double crossover strain, and the double crossover strain is sensitive to erythromycin. Therefore, these strains showing neomycin Di activity are further cultured on TM agar medium containing erythromycin, and strains showing sensitivity to erythromycin are selected. As described above, it is possible to obtain a Brevibacillus' Thichodinensis strain in which the imp gene on the genome is inactivated.
  • a plasmid vector that is easily removed from the Pleivobacterium-Thiojicinensis cells is prepared. Further, a vector for deleting the neomycin resistance gene is prepared by incorporating the yeast-derived F1p recombinase gene (Nature, 286, 860-864 (1980)) and the bleomycin resistance gene into this plasmid vector. Next! Then, the neomycin-resistant gene deletion vector was introduced into the imp gene inactivated strain obtained above, and further cultured on TM agar medium containing bleomycin to obtain a strain transformed with this vector. Sort out. Then, the transformed strain is shake-cultured in a TM liquid medium containing no bleomycin, and further cultured on a TM agar medium.
  • the neomycin resistance gene on the genome is deleted by the recombination reaction between the FRT sequences on both sides of the neomycin resistance gene, and It is a strain from which the vector for gene deletion is missing.
  • This strain is sensitive to neomycin and bleomycin. Therefore, by selecting a strain showing sensitivity to neomycin and bleomycin from the strains having colonies obtained on TM agar medium, an imp gene inactivated strain from which the neomycin resistance gene of interest was deleted was obtained.
  • an objective strain in which the imv gene of Brevibacillus schiyoschinensis is inactivated can be obtained. The outline of the above procedure is shown in FIG.
  • the Brevibacillus choshinensis strain in which both the protease genes imp and emp are inactivated uses the imp gene-inactivated strain constructed as described above as a parent strain, and furthermore, inactivates the emp gene on its genome. It can be obtained by activation.
  • the inactivation of the emp gene can be achieved by repeating the same procedure as the inactivation of the imp gene.
  • drug resistance genes such as neomycin resistance gene, erythromycin resistance direct gene, and pleomycin resistance gene used as marker genes in the above method are examples, and the type of marker gene used in the above method is particularly Not limited. Gene inactivation by homologous recombination can be carried out by using any plural marker genes and following the above procedure.
  • the proteolytic activity of the Previbacillus tychosinensis strain is similar to that of gelatin. It can be measured by a PAGE (zymogram) method or a method using a substrate obtained by azotizing a protein such as azocasein diazocol.
  • Brevibacillus'Thiojicinensis having no spore-forming ability of the present invention obtained by the method described above, Brevibacillus' Cowus sensis HPD31-SP1 (BrevibacUlus choshinensis HPD31-SP1) shown in Examples Can be mentioned.
  • Brevibacillus choshinensis which has significantly reduced intracellular proteolytic activity as compared with known strains and does not have spore-forming ability
  • Previbacillus sp. -SP 2 (BrevibaciUus choshinensis HPD31-SP2).
  • examples of Brevibacillus schiyoschinensis which have significantly reduced extracellular and intracellular proteolytic activities as compared to known strains and do not have spore-forming ability include the Previbacillus shown in Examples. 'Cowshinensis HPD31-SP3 (Brevibadllus choshinensis HPD31-SP3).
  • Brevibacillus ⁇ cho Ushinensis HPD31-SP3 (BrevibaciUus choshinensis HPD31-SP3) was internationally deposited under the Budapest Treaty on September 11, 2003 at the Patent Organism Depositary Center 1 (1-1, Higashi 1-1-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture). Accession number FERM BP-0 8479.
  • the Previbacillus schiyosinensis according to the present invention is characterized in that (a) it does not form spores, (mouth) has low or no extracellular major protease activity, and (c) intracellular major protease activity. Is characterized by having at least one of the three requirements of low or not, and other characteristics are not much different from ordinary Brevibacillus' choshinensis. Its bacteriological properties are as follows. (a) Form
  • Liquid medium 0.4 ⁇ 0.6X 1.5 ⁇ 4 / m
  • a method for measuring the decomposition activity of azocohol which comprises reacting the culture supernatant with azocophore and measuring the change in absorbance of the reaction solution.
  • Gelatin-gelatin-degrading activity is not detected in the intracellular fraction by the measurement of gelatin-degrading activity by PAGE.
  • the extracellular proteolytic enzyme activity is significantly reduced compared to known bacteria
  • the enzyme activity in the culture supernatant as measured by the azocasein method or the azocoinore method is Brevi. It means that the enzyme activity of Bacillus' choshinensis known strain is reduced to lZ10 or less, preferably 1Z30 or less, more preferably 1/1000 or less.In Examples described below, Data of Zl20 or less and 1/3330 or less are also shown.
  • the intracellular proteolytic enzyme activity is significantly reduced compared to the known strain
  • the enzyme activity in the intracellular fraction as measured by the azocasein method is the enzyme activity of the Brevibacillus' chousinensis known strain. 1 Z 2 or less, preferably 1/5 or less, more preferably 1/8 to 1/10 or less.
  • the present invention provides a method for producing a protein by genetic recombination using the above Brevibacillus tychosinensis as a host bacterium.
  • the expression vector used for the production of a protein using Previbacillus tychosinensis of the present invention as a host bacterium is not particularly limited as long as it can be replicated in Previbacillus tychosinensis.
  • An expression vector containing the promoter region of the major extracellular protein gene (MWP gene) of Brevis 47 and the promoter region of the major extracellular protein gene (HW gene) of Brevibacillus 'Cowshine ⁇ cis HPD31' is mentioned. it can.
  • proteins produced in a thread-recombinant protein production system using Brevibacillus choshinensis as a host do not accumulate in the host cells but transfer to the outside of the cells.
  • DNA sequence encoding a secretory signal peptide at the 3 'end of the DNA sequence encoding the promoter region.
  • DNA sequence encoding the secretory signal peptide include a DNA sequence encoding a secretory signal peptide of a major extracellular protein of Previbacillus choshinensis HPD31.
  • pHT110 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-1338782
  • NY301 Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-2955378
  • the DNA encoding the protein to be incorporated into the expression vector in the present invention is not particularly limited as long as it can be expressed in the production of a recombinant protein using the Brevibacillus tychodinensis of the present invention as a host.
  • it may be a gene such as a site force in, a chemokine, an enzyme, a hormone, or the like, or a DNA fragment encoding any other peptide.
  • the use of the protein produced by genetic recombination is not particularly limited. Its application may be any of pharmaceuticals, biochemical reagents, industrial enzymes and the like.
  • the DNA encoding the protein is inserted into the expression vector by treating the purified DNA encoding the protein with an appropriate restriction enzyme to obtain a DNA fragment. Alternatively, it can be carried out by a general method known to those skilled in the art, such as insertion into a multicloning site and ligation.
  • Brevibacillus choiosinensis can be transformed by introducing an expression vector incorporating DNA encoding the above protein into Brevibacillus choshinensis of the present invention.
  • the method of introducing the expression vector into the Brevibacillus choshinensis of the present invention is not particularly limited, and any method known to those skilled in the art can be appropriately selected. However, as a particularly preferred method, Brevibacillus choyocinensis is preferable.
  • An electroporation method generally used for introducing an expression vector into a vector can be exemplified.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 46% used in the examples of the present specification.
  • 0.5% yeast extract, 2% dalcose, pH 7.2 at 30 ° C. for 2 to 4 days.
  • inorganic salts such as iron sulfate, manganese sulfate, and zinc sulfate may be appropriately added.
  • the cultured protein of Brevino Tinoles tychosinensis and the secreted and produced protein are contained by general methods such as centrifugation and filtration.
  • the recombinant protein produced by the separation can be recovered.
  • the protein accumulated and produced in the cell can be obtained by appropriately using a method known to those skilled in the art. Can be recovered. For example, cells are collected from the culture solution by centrifugation, filtration, etc., and then the cells are crushed by an ultrasonic crushing method, a French press method, etc., and a surfactant is added as necessary. By solubilizing the protein, the protein accumulated and produced in the cells can be recovered.
  • the Brevibacillus' choshinensis of the present invention is a protein obtained by genetic recombination. It can be used as a host in quality production. .
  • the present invention provides Brevibacillus and T. sinensis whose extracellular proteolytic activity is significantly reduced as compared to known strains.
  • the Brevibacillus typhidinens When used as a host for secretory production of a recombinant protein, the Brevibacillus typhidinens remarkably suppresses degradation of the recombinant protein due to extracellular proteolytic activity. This allows the Brevibacillus choshinensis to secrete and produce recombinant proteins more efficiently than known Brevibacillus tychosinensis.
  • the present invention provides Brevibacillus schiyosinensis which has significantly reduced intracellular proteolytic activity as compared to known strains.
  • the Brevibacillus choshinensis remarkably suppresses the degradation of recombinant proteins due to intracellular proteolytic activity when used as a host for producing recombinant proteins accumulated and produced in cells. This allows the Brevibacillus choshinensis to accumulate and produce intracellular recombinant proteins more efficiently than the known Brevibacillus choshinensis.
  • the present invention provides Brevibacillus sp.
  • Brevibacillus tychosinensis is completely killed under mild sterilization conditions and can be used as a host for recombinant protein production in a wide range of industrial applications, including the production of recombinant protein drugs. It is.
  • Brevibacillus choshinensis of the present invention is extremely useful as a host for protein production by genetic recombination.
  • Example 1 is intended to limit the present invention to any of these Examples.
  • Example 1 is not intended to limit the present invention to any of these Examples.
  • the cells treated with the mutagen are appropriately diluted with sterile water, spread on a plate medium, and cultured at 30 ° C for 3 days to form a colony of the strain on the TM plate medium.
  • strains that formed smooth colonies with no surface on the surface were selected, and among those selected strains, those whose spores could not be confirmed by microscopic observation, were identified as having a spore-forming ability.
  • the five mutants obtained in Example 1 were evaluated for their sporulation ability by a heat resistance test.
  • Brevibacillus tychocinens HPD31 was used as a test control.
  • Brevibacillus' schioxinensis HPD31 and 5 mutant strains (No. 1 to No. 5) were applied to TM agar medium, respectively, and incubated at 30 ° C. for 7 S statically.
  • culturing was performed for 7 days, which is longer than a normal culturing period, to form a sporophyte.
  • After completion of the culture suspend the cells in sterile distilled water containing 0.8% NaC1 so that the absorbance at 660 nm becomes 1.0, and add 100 ⁇ l of the cell suspension.
  • TM agar medium After keeping the temperature at 80 ° C for 10 minutes, it was applied to TM agar medium. The cells were further cultured at a constant temperature of 30 ° C for 24 hours and grew. The number of viable bacteria was counted from the number of mouths. ,
  • the cell suspension before heat treatment at 80 ° C was diluted stepwise with sterile distilled water, applied to a TM agar medium, and cultured at a constant temperature of 30 ° C for 24 hours. After completion of the culture, the number of viable bacteria was counted from the number of grown colonies. Table 1 shows the above results.
  • Brevibacillus tychoseninsis HPD31 has about 12% of the total number of bacteria by heating at 80 ° C for 10 minutes. To the contrary, Brevibacillus' choshinensis mutants No. 1 to No. 5 are completely killed under the same conditions. That is, it was strongly suggested that heat-resistant spores were not formed.
  • Example 3
  • Brevibacillus tychosinensis I-IPD31 and Brevibacillus'chousenensis mutants No. 1 to No. 5 were applied to TM agar medium and cultured at 30 ° C. for 7 days. After completion of the culture, the bacterial cells are 0.8 so that the absorbance at 660 nm becomes 1.0. /. After suspension in sterile saline, 60 ° C, 70. Insulate at each temperature of C and 80 ° C, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and 60 minutes after the start of the incubation. At this point the suspension was dispensed.
  • each of the collected suspensions was cooled, applied to a TM agar medium, and cultured at 30 ° C for 24 hours. After completion of the culture, the number of grown colonies and the number of bacteria were counted. Furthermore, the D value of the cells was determined as the time required to reduce the number of spores to 1/10 from the measured number of cells.
  • ND Unavailable (less than 1 minute)
  • Table 2 for Brevibacillus' choshinensis HPD 31, the D value of the cells in each temperature range could be determined. However, as for Previbacillus-Chaosinensis mutant No. 1 to No. 5, ⁇ all the strains died within 1 minute after the start of the test in each temperature range. The D value of could not be determined. This result is considered to be due to the fact that none of the Brevibatinoles tychodinens strains No. 1 to No. 5 formed sporophytes. ⁇
  • the productivity of the recombinant protein was evaluated by producing recombinant hEGF for Brevi tilus choshinensis mutant strains No. 1 to No. 5. The procedure and results are shown below. As a control, Pleivatis' choshinensis HPD31 was used.
  • Previbacillus choshinensis HPD31 and the mutant strains ⁇ .1 to ⁇ .5 were each converted into a plasmid vector expressing human epithelial cell growth factor (hEGF) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -EGF (Japanese Unexamined Patent Publication No. 133782) was transformed by electroporation.
  • hEGF human epithelial cell growth factor
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -EGF Japanese Unexamined Patent Publication No. 133782
  • the transformants of each strain were cultured with shaking at 30 ° C for 60 hours using 3 ml of 2 SL liquid medium (peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2). No transformants could be obtained for mutant Nos. 4 and No, 5.
  • the above mutant No. 1 was named Brevibacillus' choshinensis HPD31-SP1 (BrevibacUl s choshinensis HPD31-SPl).
  • Example 5 Identification of Mutant Gene of Previbacillus choshinensis HPD31-SP1
  • the gene of Brevibacillus' choshinensis HPD31-SP1 which was mutated on the genome was identified. Identification of the mutated gene was performed by preparing a genomic library of Brevibacillus tychosinensis HPD31, introducing each of these libraries into SP1, and selecting strains that had recovered the ability to form the moon-capsule. I went.
  • a genomic library of Brevibacillus choshinensis HPD 31 was prepared by the following procedure. First, Brevibacillus chondinasis HPD31 or tasom DNA cultured for 15 hours in a medium was prepared, and then the genomic DNA was treated with the restriction enzyme Sau3AI to obtain a fragment of the genomic DNA. Was. A ligation reaction was performed with the obtained genomic DNA fragment and the plasmid vector pNY301 treated with the RS enzyme BamHI to obtain a genomic library plasmid DN. One A was made. Furthermore, these genomic library plasmid DNAs were introduced into Brevibacillus schiyosinensis HPD31-SP1 by the electroporation method. ,
  • a transformant of Brevibacillus choshinensis HPD31-SP1 into which the genomic library plasmid DNA has been introduced is cultured in a TM liquid medium (without antibiotics) at 30 ° C. for 1 hour, and neomycin is further cultured.
  • the cells were cultured in TM liquid medium at 30 ° C for 3 days.
  • a heat treatment was performed at 80 ° C. for 10 minutes, and the resultant was smeared on a TM agar medium and cultured at 30 ° C. for 30 minutes.
  • a strain that formed a colony by this culture was selected as a strain that had revived its spore-forming ability.
  • an inactivated strain of the hos gene was prepared using Brevibacillus / res.
  • Jiyosinensis HPD31 as a parent strain, and it was confirmed that the spore-forming ability of Brevibacillus schiyoschinensis was enhanced by inactivating the hos gene.
  • the hos gene inactivated strain was prepared by a method according to known homologous recombination. The specific procedure is described below.
  • a hos gene inactivation vector was constructed.
  • a DNA fragment of the upstream portion of the hos gene (1.5 kbp: KpnI upstream and BamHI recognition sequence downstream) was introduced by PCR using primers HosP1 and HosP2. Amplified and further amplified by this PCR, the 1.5 kbp DNA fragment was treated with restriction enzymes Kp ⁇ I and BamHI to recover the DNA fragment.
  • a DNA fragment of about 1.5 kbp downstream of the hos gene was obtained by PCR using the primers HosP3 and HosP4.
  • the DNA fragment of about 1.5 kbp was treated with restriction enzymes PstI and XbaI to recover a DNA fragment. Furthermore, a DNA fragment (1.4 kbp) containing the neomycin resistance gene and having the FRT sequence (Gene, 212, 77-86 (1998)) on both sides was treated with the restriction enzymes BamHI and PstI. The DNA fragment was recovered.
  • pB a vector that cannot be replicated in Brevibacillus tychosinensis
  • the nucleotide sequences of 1, HosP2, HosP3 and HosP4 are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, 9, and 10, respectively, and are shown in FIG.
  • the hos gene inactivation vector: B 1 e - hos:: the Nm r was introduced into Brevibacillus Chiyoushinenshisu HPD 31 by the electroporation method, we were selected transformant as an indicator neomycin resistance. Further, the obtained strain showing neomycin resistance was smeared on a TM agar medium containing erythromycin, and
  • the cells were cultured at 0 ° C for 2 hours, and strains were selected based on the sensitivity to erythromycin. The hs gene inactivation of the selected strains was confirmed by PCR and genomic Southern analysis. Further, the neomycin resistance gene was deleted from the hos gene-inactivated strain according to the procedure described in Example 7 below, to obtain a hos gene-inactivated strain of Brevibacillus and T. chinensis.
  • this hos gene-inactivated strain was subjected to an evaluation test for the ability to form spores according to the procedures of Examples 2 and 3, and it was confirmed that the strain had no ability to form spores.
  • plasmid DNA was extracted from the strain obtained above and subjected to DNA sequence analysis.
  • ORF translation frame
  • a translation frame (ORF) of about 1.4 kbp was found in a 3.6 kbp DNA fragment derived from the Previbacillus choshinensis HPD 31 genome, and about 0.7 kbp was added to the complementary sequence of the DNA fragment. ORF was present.
  • the plasmid containing the DNA fragment of about 3.6 kbp was named pNY-im.
  • plasmid containing only about 1.4 kbp ORF and a plasmid containing only about 0.7 kbp ORF were prepared.
  • Brevibacillus tychosinensis cis HPD31 was transformed with the above plasmid.
  • the DNA base sequence of the major intracellular proteolytic enzyme gene imp derived from this strain of Brevibacinoles HPD31 is shown in SEQ ID NO: 5 (upper row in FIGS. 12 to 13).
  • the amino acid sequence of the major internal protease IMP is shown in SEQ ID NO: 6 (lower part of FIGS. 12 to 13).
  • a plasmid vector pNY—imp—His that expresses a polypeptide with a peptide tag (histidine tag) consisting of eight histidines added to the C-terminus of IMP was used. It was constructed. The construction of the plasmid vector pNY-imp-His was performed according to the following procedure. First, using the sense primer imP1 and the antisense primer imP2, PCR was performed using the pNY-imp plasmid DNA as type III.
  • the sense primer imp PI is a primer homologous to a DNA sequence encoding an amino acid sequence presumed to be the N-terminal of IMP.
  • the antisense primer impP2 is a primer to which a DNA sequence obtained by repeating gtg eight times to add a histidine tag is added, and further a stop codon and a restriction enzyme EcoRI recognition sequence are introduced.
  • the nucleotide sequence of the sense primer imPPI is shown in SEQ ID NO: 11
  • the nucleotide sequence of the antisense primer impP2 is shown in SEQ ID NO: 12, and these are shown together in FIG.
  • the DNA fragment was treated with restriction enzymes XhoI and EcoRI to obtain a DNA fragment of about 500 bp.
  • this DNA fragment was inserted into the XhoI / EcoRI restriction enzyme cleavage site of plasmid pNY-imp to obtain plasmid vector pNY-imr> —His.
  • Brevibacillus tychodinens HPD31 was transformed with the plasmid and vector: NY-imp-His obtained above, and the resulting transformant was transformed with 600 ml of TM liquid medium for 30 minutes.
  • the cells were collected by centrifugation at 600,000 xg and 30 ml of washing buffer (20 mM phosphoric acid, pH 7.4, 2M KC1
  • the cells were collected by centrifugation again at 6000 X g.
  • 30 mM lysate containing 0.2 mg of lysozyme and 10 units of DNase was recovered.
  • the cells were suspended in a buffer solution (20 mM phosphoric acid, pH 7.4) and kept at a constant temperature of 37 ° C. for 20 minutes.Then, the cells were disrupted by sonication, and 34,000 X g was applied.
  • the protein was transferred to a PVDF membrane by a semi-dry type protein transfer device, and then 0.1%.
  • IMP protein band was detected using a staining solution consisting of CBB (Coomassie Prilian Blue) and 40% methanol.
  • CBB Common Brown Blue
  • the PVDF membrane was decolorized with a 40% methanol solution containing no CBB, and the membrane was dried.
  • the protein band of IMP was cut out from the membrane, and its N-terminal amino acid sequence was analyzed. It was confirmed that the N-terminal sequence was MetAsnHisProAsp.
  • IMP is an intracellular proteolytic enzyme with an estimated molecular weight of 49,81 1 Da consisting of 453 amino acid residues.
  • Qu anti C leave registered trademark
  • Protease Assay Kit Pierce Biotechnology, Inc.
  • the protein degradation activity of IMP was determined by measuring the absorbance at 450 nm.
  • the amount of enzyme that increases the absorbance of 45 Onxn by 0.1 by reaction at 30 ° C for 60 minutes is defined as one unit, and the amount of enzyme protein used in the reaction is determined by the Bradford method using BSA as a standard. did.
  • the optimal temperature of IMP is 30 ° C
  • the optimal pH is 8.0
  • the specific activity is 44.7 un its Zmg protein
  • the activity of IMP is inhibited by EDTA of lmM or more. It became clear that it would be.
  • Brevibacillus tychodinensis in which the imp gene was inactivated was prepared using Brevibacillus tychosinensis HPD31-SP1 as a parent strain.
  • Brevibacillus choshinensis in which the im gene was inactivated was prepared by a method similar to the method of inactivating a gene by homologous recombination. Specifically, the procedure was as follows.
  • a vector for inactivating the ⁇ mp gene was constructed.
  • Restriction enzyme E co RV to thus cut the 1 kbp DNA fragment is an internal region of the i mp gene
  • restriction enzyme P st to i mp gene inside the 120 bp region was removed by treatment with I, neomycin H 1 raw gene DNA fragment with FRT sequences on both ends comprises a P st I restriction enzyme cleavage
  • the i gene was disrupted by inserting into the site.
  • a vector for inactivating the imp gene was constructed by inserting a DNA fragment containing the erythromycin resistance gene cut out by the restriction enzyme into the BamHI restriction enzyme cleavage site of this plasmid.
  • the i mp gene inactivation vector was constructed by the above p B 1 ue- im:: was Nm r.
  • the i mp gene inactivation vector p B 1 ue- i mp:: the Nm r 1 mu g was introduced into Brevibacillus Chiyoushinenshisu HP D 3 1 -SP 1 by electrospray Toroporesho down method, a neomycin resistance Transformants were selected as indicators.
  • the obtained neomycin-resistant strain was added to a TM agar medium containing 1 ⁇ g Zm 1 of erythromycin (peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, agar 1 5%, pH 7.0), cultivated at 30 ° C for 2 days, and caused a homologous recombination reaction at two loci in the upstream and downstream regions of the imp gene (Davnorecross). Over strains) were selected for their sensitivity to erythromycin. Furthermore, PCR and genomic Southern analysis were performed on the selected strain, and it was confirmed that the imp gene was inactivated.
  • erythromycin peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, agar 1 5%, pH 7.0
  • neomycin resistance gene was deleted from the genome of the imp gene-inactivated strain constructed above.
  • a plasmid vector for deleting the neomycin resistance gene having a yeast-derived F1p recombinase gene and a bleomycin resistance gene was constructed by the following method.
  • the pNY301 plasmid vector Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. Heisei 9 (1999)
  • the drug was treated with hydroxylamine on 10—2 9 5 3 7 8) to obtain its mutant.
  • the procedure was performed as follows.
  • pNY301 plasmid DNA 1.5 ⁇ g was dissolved in a solution (100 / z 1) obtained by dissolving 350 mg of hydroxylamine and 90 mg of NaOH in 5 ml of ice-cold sterile distilled water. After being kept at a constant temperature of 70 ° C. for 120 minutes, the plasmid DNA was concentrated by ethanol precipitation and dried. Furthermore, this plasmid DNA is sterilized by steam. After dissolving in distilled water, 100 ng of the plasmid DNA was used to transform Brevibacillus tiyodininsis HPD31, and a transformant was selected based on .neomycin resistance as an index.
  • Plasmid DNA obtained from a transformant with a slow growth rate and a small colony size has a copy number per cell reduced to several tenths compared to the original ⁇ 301 plasmid vector DNA, When cultivation was performed using a medium containing no, the cells were easily removed from the cells.
  • a sense primer f1 PPI obtained by adding EcoR I and Pst I recognition sequences to this plasmid DNA and an antisense primer having a BamHI recognition sequence added.
  • PCR was performed using f1pP2 (SEQ ID NO: 14: FIG. 17) to amplify an approximately 1.6 kbp DNA fragment containing the rep gene. Furthermore, a DNA fragment of about 1.6 kbp was treated with restriction enzymes EcoRI and BamHI.
  • P NH300 plasmid containing bleomycin ft transgene (Yasuhiro, Shiga et al, Applied and Environmental Microbiology, 58, 525-531 (1992)) was added to the B type with a B g 1 recognition sequence.
  • An approximately 1.1 kbp DNA fragment containing the resistance gene and the plasmid Ori was amplified.
  • plasmid was designated as pNY_Mut-B1e.
  • a yeast-derived 2 — // in plasmid was used as type I, and a sense primer f1pP5 (SEQ ID NO: 17: FIG. 20) added with an NcoI recognition sequence and an antisense added with a 1101 recognition sequence.
  • PCR was performed using the primer f1P6 (SEQ ID NO: 18: FIG. 21) to amplify the region containing the F1p recombinase gene.
  • the DNA fragment containing the F1R recombinase gene obtained by this PCR was treated with NcoI and 'XhoI, and inserted into the NcoI / XhoI restriction enzyme cleavage site of pNY301 betada1.
  • a vector containing the Flp recombinase gene was obtained.
  • This vector was designated as PNY3O1_F1r>.
  • a sense primer f1PP7 (SEQ ID NO: 19: FIG. 22) obtained by adding the XbaI recognition sequence to the pNY301—F1p type II and an anti-mouse containing the PstI recognition sequence PCR was performed using the sense primer f1P8 (SEQ ID NO: 20: FIG. 23) to amplify an approximately 1.6 kbp DNA fragment containing the F1p recombinase gene and the promoter region derived from pNY301.
  • a vector for deleting the neomycin resistance gene was constructed.
  • This vector for deleting the neomycin resistance gene was designated as pNY—Mut—B 1 e—F 1 p.
  • This pNY—Mut—Ble—Flp expresses the Flp recombinase gene, and when cultured in a medium that does not contain neomycin, it can be easily isolated from Brevibacillus choshinensis cells. This is a plasmid vector that is delocalized.
  • this neomycin metamura gene deletion vector pNY—Mut-B1e—F1p was introduced into an imp gene-inactivated strain by electroporation, and transformants were expressed using bleomycin resistance as an index. Selected.
  • the transformant was cultured with shaking in a TM liquid medium containing no bleomycin, and further cultured on a TM agar medium. Strains showing sensitivity to neomycin and bleomycin were selected from the strains in which colonies were obtained on TM agar medium.
  • neomycin resistance gene was deleted, and the neomycin resistance gene deletion vector pNY—Mut—B1e—F1p was dropped.
  • An activated strain was obtained.
  • Brevibacillus typhosinensis in which the intracellular major protease gene imp on this genome has been inactivated, is converted to brevibacinoles typhosinensis HPD31-SP2
  • Previbacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087) is cultured in 5 L of TM liquid medium for 24 hours. After completion of the culture, the culture supernatant is fractionated by centrifugation, and a final concentration of 50 mM Tris After adding hydrochloric acid (pH 7.5), the solution was subjected to DEAE anion exchange column chromatography, and EMP was eluted with a linear concentration gradient of 0.6-0.6M NaC1.
  • the EMP-containing fraction was dialyzed against a buffer of 5 OmM Tris-HCl (pH 7.5), applied to a heparin column, and eluted with a linear gradient of 0-0.5 M NaC1 to purify EMP.
  • An enzyme preparation was used.
  • the enzymatic activity of each eluted fraction was measured by gelatin-PAGE according to the method of Analyticalb Biochemistry, 102, 196-202 (1980).
  • the protein is transferred to PVDF membrane using a semi-dry protein transfer device, consisting of 0.01% CBB and 40% methanol. EMP protein band was detected in the staining solution. After decolorization with a 40% methanol solution containing no CBB, the membrane was dried, a membrane containing a protein band was cut out, and N-terminal amino acid sequence analysis was performed using an ABI protein sequencer, model 1492.
  • a la Ser Lys Ar gVa 1 H is Thr A s pAs nL e uVa 1 I 1 e A 1 a L eu V al G lu P h eAs nAs p L e uG 1 uG 1 yA
  • the N-terminal amino acid sequence consisting of the 24 amino group of snG1n was determined.
  • Enzyme treatment in the gel was carried out with 1 g to perform limited degradation within the gel.
  • the trypsin-treated EMP peptide fragment was recovered with an acetonitrile solution, and then subjected to Mighty Sinore Aqua PR 18 reverse-phase column chromatography (Kanto Chemical Co., Ltd.) to obtain 0-60% of acetonitrile containing 0.05% TFA.
  • EMP peptide fragments were eluted and separated by a linear gradient. Further, after the eluted and separated EMP peptide fragment was dried, an amino acid sequence analysis was performed on one of the peptide fragments using an ABI protein sequencer model 492. By this amino acid sequence analysis, an internal partial amino acid sequence consisting of 10 amino acid residues of I 1 e Ph eGlnThrGlnPRoThrGlyPHeAsP was determined.
  • oligonucleotide primers emp-1 and 6111 P2 were designed and synthesized based on the partial amino acid sequence data of EMP obtained above.
  • the nucleotide sequence of empPI is shown in SEQ ID NO: 21, and the nucleotide sequence of empP2 is shown in SEQ ID NO: 22.
  • FIG. 24 shows the nucleotide sequences of emPPI and empP2, and the amino acid sequences corresponding to the nucleotide sequences of empPI and empP2.
  • the sixth n from the left in the sequence of SEQ ID NO: 21 and the sixth n from the left in the sequence of SEQ ID NO: 22 are inosine.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Brevibacillus-Thiocysinensis HPD31 as a type III, and a DNA fragment of about 700 bp was amplified. Further, this DNA fragment of about 700 bp was subcloned into the Hinc II recognition sequence of the pUC118 vector (Toyobo Co., Ltd.), and DNA sequence analysis was performed. This DNA fragment of about 700 bp was a part of the emp gene. Including, and confirmed. -In addition, in order to close the upstream and downstream DNA fragments of the approximately 700 b DNA fragment, the DNA sequence data of the approximately 700 b DNA fragment obtained above was used. Based on the above, two specific primers shown below, antisense primer einpP3 for upstream amplification, and sense primer empP4 for downstream: tiiliII were designed and synthesized. ,
  • genomic DNA of Previbacillus typhosinensis HPD31 is fragmented with a restriction enzyme such as Eco RV, and further, by adding an adapter DNA to the ends of these DNA fragments, Brevibacillus.
  • An adapter genomic DNA library of T. chinensis HPD31 was prepared.
  • nucleotide sequences of the antisense primer em ⁇ P3, the sense primer empP4 and the adapter A are shown in SEQ ID NOS: 23, 24 and 25, respectively. These are summarized in Figure 25.
  • PCR was performed using this Brevibacillus 1 choshinensis HPD31 genome adapter-DNA library as type I to amplify a DNA fragment containing the full length emp gene. Furthermore, the DNA system of the emp gene was determined by direct sequencing of the obtained PCR amplification product.
  • the DNA sequence of this extracellular proteolytic enzyme gene, emp, derived from Brevibacillus schijocchinensis HPD31 strain is shown in SEQ ID NO: 3 (upper row in FIGS. 9 to 11).
  • the amino acid sequence of EMP corresponding to the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 9: lower part of L1).
  • EMP a major extracellular proteolytic enzyme
  • EMP is an acidic protein consisting of 754 amino acid residues in the prepro structure and having a molecular weight of approximately 84 kE> a.
  • the N-terminal 1.24 amino acid residues are cleaved and 630 amino acids It was presumed to mature to a structure consisting of residues and having a molecular weight of about 71 kDa.
  • the HEXXH sequence which is thought to be involved in the coordination of the zinc ion of the Z inc meta-oral protease, exists, so EMP is considered to be a Z inc meta-oral protease.
  • the nip gene was inactivated by using the Brevibacillus' choshinensis HPD31-SP2 obtained in Example 7 as a parent strain, and the two types of proteolytic enzymes, imp and emp genes, were inactivated.
  • T. chinensis strain was prepared.
  • the Brevibacillus choshinensis strain in which the emp gene was inactivated was prepared according to the gene inactivation method by homologous recombination.
  • a vector for inactivating the emp gene was constructed.
  • the emp P4 primer (SEQ ID NO: 24) and the adapter-1 primer (SEQ ID NO: 25) described in Example 8-3 above were used as primers, and the adapter genomic DNA library of Previbacillus choshinensis HPD 31 was type III
  • the PCR was carried out to amplify a DNA fragment of about 2.2 kbp partially containing the emp gene.
  • the DNA fragment of about 2.2 kbp amplified by the PCR was inserted into the Hinell restriction enzyme cleavage site of pUC118.
  • a DNA fragment containing the E. coli mycin resistance gene excised by the same restriction enzyme was inserted into the BamHI recognition sequence located in the vicinity of the inserted DNA fragment.
  • this plasmid contains the neomycin resistance gene at the HindIII / PstI restriction enzyme cleavage site and has FRT sequences on both sides.
  • a vector for inactivating the emp gene was constructed by inserting a DNA fragment.
  • Brevibacillus-choshinensis strain in which the imp gene and the emp residue were obtained as described above were inactivated, and Brevibacillus choshinensis HPD31-S ⁇ 3 (Brevibaci 1 1 uschoshinensis HPD31— SP 3) and deposited internationally as FERM BP-08479.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 is inoculated on each of the TM agar plates containing 5%, 2%, and .1% skim milk, and cultured at 37 ° C for 3 days to degrade milk casein. The presence or absence of halo formation around the colony was observed. As a result, none of the TM agar media containing 5%, 2%, and 1% skim milk did not form any lipstick.
  • Aseptically filtered BSA (Sigma A4 503) solution was added to a final concentration of 3.2 mg / m 1 in TM liquid medium (1 Oml) and added to Brevibacillus tiyocinens HPD 3 1 _S P 3 And cultured with shaking at 37 ° C. and 200 rpm.
  • the culture filtrate was collected at 24 hours, 48 hours, and 72 hours after the start of the culture, and each of the collected culture filtrates was centrifuged at 10000 rpm for 5 minutes. Then, 0.5 ⁇ Tris-HC 1 (PH6.8) 1 25 ⁇ 1 s 10% SD S 200 ⁇ ⁇ -melt was added to the culture supernatant fraction 6 25 ⁇ 1 obtained by centrifugation. After adding 50 ⁇ l of captoethanol and stirring, the mixture was heat-treated for 3 minutes in boiling water. After further heat treatment, add 0.05% ⁇ ⁇ ⁇ and 70% glycerol 0.0 6 25 ⁇ ri ris-HC 1 (PH6.8) 0. The samples were subjected to gel electrophoresis (SD S-PAGE).
  • the cells were cultured with shaking at 30 ° C for 6 days.
  • the culture was centrifuged at 10, OO O pra for 10 minutes, and the resulting supernatant was used as a sample for activity measurement.
  • 5 g of azocasein was dissolved in 1 L of 0.1 M Tris_HCl (pH 8.0), and the solution was dissolved overnight. Next, an equivalent amount of the sample was added to 0.1 ml of the above substrate solution, and reacted at 37 ° C. for 5 hours.
  • ND Undetectable (0.001 or less)
  • Previbacillus tychodinens cis HPD 31-SP 3 also detects proteolytic enzyme activity by activity measurement using Rozocadin reagent I could't.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 Provides proteolytic enzyme activity of the culture supernatant fraction of SP 3 It was less than lZl 20 compared to HPD31.
  • Brevibacillus tychosinensis HPD31 and Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 were cultured in TM liquid medium for 48 hours, and after the culture was completed, the culture solution was centrifuged and fractionated. The culture supernatant fraction was concentrated 10-fold with Centric on lus-20 (Bioomax-5). Then, it concentrated supernatant 300 1 and an equal volume of 10 Omm Tris-HCl (pH7. 5), 1 OmM C a C 1 2, 1% Azokoru solution was mixed for 3 hours at a constant temperature of 37 ° C, and stirred.
  • ND Not detectable (0.1 or less)
  • Brevibacillus tychosinensis HPD 31-SP3 shows that the activity of proteolytic enzyme can be measured by using the azochol reagent. could not be detected.
  • Brevi Bacillus Chiyoshinensis HP D31-1 SP 3 Proteolytic enzyme activity of the culture supernatant fraction of Brevibacillus' choshinensis
  • the extracellular proteolytic enzyme activity of Brevibacillus' choshinensis HP D31-SP3 of the present invention is significantly higher than that of the known strain Brevibacillus choshinensis HP D31. It was shown that it was reduced.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31 and Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 were each cultured in a TM liquid medium at 30 ° C for 48 hours. After completion of the culture, the cells were recovered from the culture solution by centrifugation, and then disrupted by ultrasonic waves, followed by centrifugation to obtain an intracellular fraction. Then, the intracellular fraction was subjected to electrophoresis under a native strip 4 ⁇ . For electrophoresis under native conditions, a final concentration of 5 OmM Tris-HCl ( ⁇ 6.8) and 10% glycerol were added to 10 ⁇ l of the intracellular fraction, and the mixture was applied to a 10% acrylamide gel containing 0.1% gelatin. The electrophoresis was performed by running in a tris-glycine buffer without SDS at 4 ° C and a constant current of 10 mA for 10 hours. .
  • Brevibacillus reticulosinensis HPD 31 and Brevibacillus chochinesinensis HPD 31-SP3 obtained in the same manner as in Example 17, each of the intracellular fraction 200 1 and an enzyme reaction solution (10 OmM Tris-HCl) (pH7. 5), 0. 2 % Azokazin, 1 OmM C a C 1 2 ) 400 ⁇ 1 and admixed, after placing 1.5 hours in a constant temperature of 37 ° C, final concentration 2.5% of TC a The reaction was stopped by adding. Next, the reaction solution was centrifuged, and the absorbance at 440 nm of the supernatant was measured.
  • the total protein amount of the crude enzyme solution used for the reaction was quantified by the Bradford method using BSA as a standard. Table 8 shows the above results.
  • the amount of the enzyme that increases the absorbance at 440 nm by 0.01 in a reaction at 37 ° C for 1 hour was defined as 1 uii it.
  • Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 has an intracellular protease activity of Brevibacillus chosichinen. It was reduced to about 1Z8 compared to cis HPD31.
  • proteins that were partially degraded include IL-1; 3 mature form from septum (EMBL accession X 74568), Escherichia coli K12 strain Mature maleose binding protein (maltosebindingrotein) (EMB L accession AAB 59056), mature macula phage colloie stimulating factor from genus (Gen BANK accession NM-174026.1), swine erysipelas antigen A part of the protein, EN 2 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • Pig-derived IL-1] 3 mature form EMB L accession X 74568, (Hereinafter referred to as “pta IL-1] 3), a sense primer obtained by adding a NcoI recognition sequence and a sequence encoding a part of a signal peptide to a DNA sequence encoding the N-terminal amino acid residue of SEQ ID NO: 26: 26) and an antisense primer (SEQ ID NO: 27: Fig. 27) obtained by adding a HindIII recognition sequence to the DNA sequence encoding the C-terminal amino acid residue were used to transform IL-1] 3c DNA derived from pig into type III. PCR was performed.
  • DNA fragment amplified by PCR was treated with restriction enzymes NcoI and HindIII, and inserted into the NcoI / HindIII restriction enzyme cleavage site of the pNY301 vector, whereby the peptide IL-1 was deleted. ; 3 A vector for secretory production was constructed. This pig for production of porcine IL-1] 3 secretion was designated as ⁇ 301-pIL-Ij3.
  • a transformant was constructed by introducing this pNY301-IL-1j3 into each of Previbacillus tiyocinensis HPD31 and Brevibacillus tiyocinesis HPD31-SP3 by an electroporation method. .
  • each of these transformants was cultured in a TM liquid medium at 30 ° C. for 90 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and fractionated,
  • the sample was subjected to acrylamide gel electrophoresis with a 10-25% concentration gradient. After completion of the electrophoresis, the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane using a semi-dry protein transfer device. In the absence of the 7, the transfer membrane was subjected to a gel stamp analysis using an anti-pig IL-1] 3 antibody to detect pig IL-1] 3 according to a standard method.
  • Previbatinoles-Cowshinensis HPD 31-SP380 As shown in Table 9, the presence of porcine IL-1] 3 in cultures produced using Brevibacillus schiyoschinensis HPD31-SP3 as a host The amount of accumulation increased about 2.5 times or more as compared with the case where Brevi batinoles tychosinensis HPD31-S5 was used as a host.
  • Example 20 Example 20
  • Maltose binding protein derived from K12 strain of Otsuki fungus (EMP L accession A AB 59056) (hereafter referred to as E. coli MBP)
  • E. coli MBP A sense primer (SEQ ID NO : 28 : FIG. 28) added with an stI recognition sequence and an antisense primer (SEQ ID NO : 29) obtained by adding a Hind III recognition sequence to a DNA sequence encoding a C-terminal amino acid residue : PCR was performed using Escherichia coli K12 genomic DNA as shown in Fig. 29).
  • DNA fragment amplified by PCR is treated with the restriction enzymes PstI and HindIII, and inserted into the PstI / Hind restriction site of the pNY301 vector to produce E. coli MBP secretion.
  • a construction vector was constructed. This E. coli MBP secretory production was named pNY301-MBP.
  • a BamHI recognition sequence was added to the DNA sequence encoding the N-terminal amino acid residue of the macrophage colony-stimulating factor matured from ⁇ ⁇ (GenBank accession NM ⁇ 174026.1) (hereinafter ⁇ M M-CSF).
  • ⁇ M M-CSF Genetic Engineering Sequence
  • a sense primer SEQ ID NO: 30: FIG. 30
  • an antisense primer SEQ ID NO: 31: FIG. 31 obtained by adding a HindIII recognition sequence to a DNA sequence encoding a C-terminal amino acid residue.
  • PCR was performed using type I M-CSF cDNA.
  • DNA fragment amplified by PCR is treated with restriction enzymes BamHI and HindIII, and inserted into the BamHI / HindIII restriction enzyme cleavage site of the NY301 vector.
  • a vector for CSF secretion production was constructed. This vector for secretory M-CSF production was designated as pNY301-M-CSF.
  • a transformant was constructed by introducing this pNY301-M-CSF into each of Brevibacillus s. Typhodinensis HPD31 and brevibacillus tychoshinensis cis HPD31-SP3 by an electroporation method.
  • each of these transformants was cultured in TM liquid medium at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and fractionated, and the culture supernatant fraction obtained was subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis in the same manner as in Example 19.
  • Plasmid vector pNH300 en2 (JP-A-2000-279179) expressing EN2, which is a part of the swine venom antigen protein, was prepared by the electroporation method using Brevibacillus tychosinensis HPD31 and Brevibacillus chow. Transformants were constructed by introducing each of Sinensis HPD31-SP3, and these transformants were further cultured in TM liquid medium at 30 ° C for 90 hours.
  • Example 19 After completion of the culture, the culture solution was centrifuged and fractionated, and the culture supernatant fraction obtained was subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis in the same manner as in Example 19.
  • a remarkable band showing the degradation of EN 2 was confirmed.
  • Brevibacillus chinsiocinsis HPD 31 -SP 3 was used as a host. In some cases, no band indicating the degradation of EN 2 was observed.
  • CBB staining was performed on the gel after electrophoresis, protein bands were detected, and the densitometry of the band corresponding to EN2 was measured to determine the amount of protein accumulated in the culture solution. Was done. Table 12 shows the results of this measurement.
  • a sense primer obtained by adding a Bam HI recognition sequence to the DNA sequence corresponding to the 339th amino acid sequence of mature intimin, and a Hind to the DNA sequence corresponding to the amino acid sequence near the 575th position
  • an antisense primer SEQ ID NO: 33: Fig. 33
  • PCR was performed using the intimin gene as type II.
  • the DNA fragment amplified by PCR is treated with restriction enzymes HindIII and BamHI, the DNA fragment is inserted into the BamHI / HindIII restriction enzyme cleavage site of pNY301 to thereby obtain Escherichia coli O157: H7.
  • intimin Amino acid sequence of intimin (SWI SS—PROT accession P 43261) derived from the strain A plasmid vector expressing the polypeptide corresponding to the portion from positions 339 to 575 in the column (hereinafter referred to as Intimin (339-575)) was constructed.
  • the vector for secretion production of Int im in (339-575) was designated as pNY301-Intimin.
  • transformants were constructed by introducing this pNY301-Intimin into each of Previbacillus tychosinensis HPD31 and Previbacillus' chow sinensis HPD31-SP3 by electroporation. . Further, each of these transformants was cultured in TM liquid medium at 30 ° C. for 90 hours. After completion of the culture, the culture supernatant was centrifuged and fractionated, and the culture supernatant fraction obtained was subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis in the same procedure as in Example 19.
  • Cyanobacteria HPD 31 200 As shown in Table 13, Previbacillus Cyanogensis HPD 31 (1) The amount of accumulation of Intimin (339-575) in the culture solution produced using SP3 as a host increased by about 2 times compared to the case where Brevibacillus' choshinensis HP D31 was used as a host. Was.
  • PCR was performed using swine-derived interferon-1 ⁇ cDNA as type II. Furthermore, after the DNA fragment amplified by PCR is treated with restriction enzymes NcoI and HindIII, it is inserted into the BspHIZHindIII restriction enzyme cleavage site present on the translation initiation method of the pNY301 vector. Thus, a vector for porcine IFN- "V expression was constructed.
  • This porcine IFN- ⁇ expression vector was designated as ⁇ 301-pIFN- ⁇ .] DNY301-: iFN- ⁇ The porcine IFN- ⁇ produced because it does not have a DN ⁇ sequence encoding a secretory signal peptide accumulates intracellularly.
  • a transformant was constructed by introducing the ⁇ 301-pIFN- ⁇ into each of Brevibacillus tychosinensis HPD31 and Previbacillus tychosinensis HPD31-SP3 by an electroporation method. .
  • Brevibacillus typhosinensis HPD 31 / pp301 into which p ⁇ 301 into which pta I FN- ⁇ gene was not incorporated was also constructed.
  • these transformants and Previbacillus choshinensis HPD 31 / pNY301 were each cultured in a TM liquid medium at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the cells were recovered from the culture solution by centrifugation, and then disrupted by ultrasonication, followed by centrifugation to obtain an intracellular fraction. Next, this intracellular fraction was subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis in the same manner as in Example 19. As a result, as shown in FIG. 6, when Brevibacillus choshinensis HPD31 was used as a host, a remarkable band indicating porcine IFN- ⁇ degradation was confirmed. (2) When T. chinensis HPD31-S ⁇ 3 was used as a host, no band showing degradation of puta IF ⁇ - ⁇ was observed.
  • the Bs pH I recognition sequence was added to the DNA sequence encoding the N-terminal amino acid residue of the mature canter of interferon derived from dog (Gen B ANK accession E 1 1 229) (hereinafter referred to as dog IFN-3).
  • the sense primer (SEQ ID NO: 36: 036) added to the primer and the antisense primer (SEQ ID NO: 37: Fig. 3) which added the HindIII recognition sequence to the DNA sequence encoding the C-terminal amino acid residue Using 7), PCR was performed on canine IFN-] 3cDNA type II.
  • canine IFN- a vector for expression of canine IFN- was constructed.
  • This canine I FN- expression vector was designated as NY301-cIFN-.
  • This ⁇ 301-cIFN- ⁇ is produced because it does not have a DNA sequence encoding a secretory signal peptide.
  • the canine IFN-] 3 accumulates intracellularly.
  • a transformant was constructed by introducing this pNY301-cIFN-] 3 into each of Brevibacillus oxysinensis HPD31 and Brevibacillus schiyosinensis cis HPD31-SP3 by the electroporation method.
  • each of these transformants was cultured in TM liquid medium at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, the cells were recovered from the culture solution by centrifugation, the cells were disrupted by ultrasonic waves, and further centrifuged to obtain an intracellular fraction. Next, this intracellular fraction was subjected to SDS-PAGE and Western plot analysis in the same manner as in Example 21.
  • Chovinensis HPD31—SP380 As shown in Table 15, the intracellular accumulation of canine I FN produced using Brevibacillus tychosinensis HPD31-SP3 as a host was Previbacillus. (1) The amount was increased about 1.6-fold as compared with the case of using C. chinensis HPD31 as a host. According to the above Examples 24 and 25, when the Brevibacillus choshinensis HPD31-SP3 of the present invention was used as a host to produce a recombinant protein, Brevibacill. It was shown that the amount of accumulation of the protein was increased as compared with the case where it was used. These results are considered to be due to the remarkable suppression of the recombinant protein accumulated in the cells due to the inactivation of the intracellular proteinase gene imp. Deposit number: FERM BP-08497
  • Depositary institution name National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center Address of the depositary institution: ⁇ 305—8566 Tsukuba, Ibaraki, Japan

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Description

明 書 新規ブレビバチルス 'チョウシネンシス及ぴ該微生物を宿主とするタンパク質の 製造方法 技術分野
本発明は、 新規なプレビバチルス ■ チヨ ゥシネンシス （Brevibacillus choskiiiensis) に関する。 より具体的には、 本発明は、 細胞外及び細胞内のタン パク質分解活性が格段に低減し、 また、 胞子を形成しないブレビバチルス■チヨ ゥシネンシスに関する。 また該ブレビバチルス■チヨゥシネンシスを宿主に用い た遺伝子組換えによるタンパク質製造方法に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術は、 生体内に微量しか存在せず単離が難しいために従来は利 用が著しく困難であったタンパク質、 または、 任意のアミノ酸配列を有するポリ ぺプチドを、 細菌または動物細胞などを宿主に用いて大量に生産することを可能 にした。 遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主には様々な細菌が用いられて いる力 最も広く用いられている細菌は大 S昜菌である。 しかしながら、 大腸菌を 宿主とする組換えタンパク質生産系では、 生産されたタンパク質が菌体内に蓄積 されるため、 細胞の容積が生産されたタンパク質の量の上限となってしまい、 タ ンパク質の大量生産が難しい。 また更に、 細胞内に蓄積されたタンパク質を回収 するために大腸菌菌体を破砕する必要があることや、 大腸菌菌体の破碎物に含ま れる菌体由来の成分である核酸、 目的以外のタンパク質及び菌体の細胞壁に由来 するエンドトキシン等から目的とするタンパク質を分離回収する操作が煩雑にな るなどの問題がある。
大腸菌の系が持つこれらの問題を回避するため、 タンパク質を分泌生産する能 力を有する代表的な細菌である枯草菌 （Bacillus subtilis) を宿主に用いた組 換えタンパク質の生産系の開発が行われた。 この枯草菌を宿主に用いた生産系で は、 生産された組換えタンパク質は培地中に分泌生産される。 そのため、 この枯 草菌の系には、 タンパク質を回収するための菌体破碎が不要であることゃェンド トキシンがほとんど生じないことなどの大腸菌の系にはない優れた性質がある。 ところが、 一方で、 枯草菌にはタンパク質分解酵素を大量に細胞外に分泌する という性質があるため、 分泌生産された組換えタンパク質が、 タンパク質分解酵 素により分解されてしまい、 組換えタンパク質の収量が極めて少なくなるという 大きな問題があった。 そのため、 枯草菌のタンパク質分解酵素の産生を低減する ための様々な努力が行われてきた。 し力 し、 それにもかかわらず、 枯草菌を宿主 とする組換えタンパク質生産系が異種タンパク質の産業的な生産に用いられた例 は、 これまでほとんど知られていない。
一方で、 枯草菌の系が持つこの問題を回避するために、 組換えタンパク質を細 胞外に分泌生産するが、 細胞外にタンパク質分解酵素を分泌しない細菌を宿主に 用いた新たな組換えタンパク質生産系の開発が行われた。 そして、 その結果、 枯 草菌よりタンパク質分解酵素活性が弱く、 なおかつ、 枯草菌より優れたタンパク 質の分泌生産性を示すバチルス ·ブレビス 4 7 (Bacillus brevis 47) (特許文 献 1 ) を初めとするバチルス 'ブレビス （Bacillus brevis) を宿主とする組換え タンパク質の生産系の開発に成功した。
なお、 現在、 バチ/レス 'ブレビス （Bacillus brevis) は、 16S rRNA遺伝子の 塩基配列に基づく系統解析の結果、 プレビバチルス 'チヨゥシネンシス
(BreviDaciHus cnoshiaensis)、ブレヒノヽナノレス■ブレヒ、、ス (Brevibacillus brevis) などからなるブレビバチルス （BrevibaciJlus) 属細菌に再分類されている （非特 許文献 1 ) 。
しかしながら、 バチルス 'ブレビス 4 7にも細胞外に微弱なタンパク質分解活 性が存在していることがわかった。 バチルス ·ブレビスを宿主とする組換えタン パク質生産においては比較的長時間 （通常 3 13間程度） の培養力必要とされてい る。 そのため、 たとえバチルス■ブレビス菌体の細胞外のタンパク質分解活性が 微弱なものであっても、 生産された組換えタンパク質が細胞外のタンパク質分解 活性により分解されてしまい組換えタンパク質の収量が減少する場合があった。 この問題の解決のために、 これまでにもバチルス .プレビスの細胞外のタンパク 質分解活性を更に低減させるための努力が行われてきた。 例えば、 バチルス 'プレビス菌株のスクリーユングが広い範囲で行われ、 細胞 外のタンパク質分解活性が著しぐ低く、 なおかつ、 タンパク質の分泌生産性にも 優れた菌株としてブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31 (Brevibacaius choshinensis HPD31) (F E RM BP— 1087) (FE RM B P _ 68 63 ：バチルス■ブレビス H 102 (Bacillus brevis H102) (特許文献 2) と 同一株） や、 その変異株であるプレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31— S 5 (Brevibacfflus choshinensis HPD31-S5) (F E RM B P— 6623 ： 本菌株は： Bacillus brevis HPD31— S5の表示で寄託された。 ） が分離された。 そ して、 これらの菌株はヒ 卜上皮細胞増殖因子 （hEGF) を初めとする様々 な組換えタンパク質の生度において宿主として利用されている。 例えば、 ブレビ バチルス .チヨゥシネンシス HPD31による hEGFの生産に関しては、 非特 許文献 2 (同文献にお!/、てブレビバチルス ■チヨゥシネンシス H P D 31は Bacillus brevis HPD31と言己载されている。 ） 他に示されている。
ところが、 このブレビバチルス ■チヨゥシネンシス HPD 31及び HPD 31 一 S 5においても、 鋭敏なタンパク質分解活性の検出法を用 、た場合には細胞外 のタンパク質分解活性が換出されている。 たとえば、 ブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD—31の薛養上清に対してゼラチン一 PAGE (ザィモグラフ） 法によるタンパク質分解 S "性の検出を行った結果では、 図 2に示されているよう にゼラチンの分解による/ ンドが確認されている。
—方、 タンパク質分解酵素活性 （タンパク質分解活性） を実質的に示さない変 異バチルス ·プレビス菌昧と称されるバチルス■ブレビス 31— OK株も開示さ れている (特許文献 3) 。 しか ながら、 このバチルス ·プレビス 31— OKに おいても、 ゼラチン - P A G E法によるタンパク質分解活性の評価試験の結果で は、 タンパク質分解活性 残存していることを示すバンドが確認でき、 完全に細 胞外のタンパク質分解活†生が失われているわけではなかった。 しかも、 この細胞 外のタンパク質分解活性についての遺伝子レベルでの解明は全くなされていなか つた。 すなわち、 タンパク質分解酵素の単離は行われておらず、 ましてや、 その 遺伝子の配列決定はおろ \ クロー-ングさえ行われていなかった。
したがって、 これらの細胞外のタンパク質分解活性が低減されたとされる菌株 T JP2004/016912
を用いた場合においても、 菌株に残存する細胞外タンパク質分解活性により分泌 生産されたタンパク質が分解され、 その収量が減少する可能性があった。
また、 これらのブレビバチルス■チヨゥシネンシス （もしくはバチルス■ブレ ビス） は、 スクリーニングもしくは変異剤処理等による突然変異により得られた ものであり、 そのゲノム上のタンパク質分解酵素遺伝子を同定し、 更に、 該遺伝 子の不活化を行うことにより得られたものではなかった。 したがって、 そのゲノ ム上のタンパク質分解酵素遺伝子を同定し、 更に、 該遺伝子の不活化を行うこと によりタンパク質分解活性の低減を行ったブレビバチルス ·チヨゥシネンシスは これまで知られていなかった。
また、 上記のブレビバチルス 'チョウシネンシスのタンパク質分解活性の低減 は、 全て細胞外タンパク質分解活性の低減を目的としており、 細胞内のタンパク 質分解活性の低減には注意が払われていなかった。 ところが、 ブレビバチルス ' チヨゥシネンシスを宿主とする組換えタンパク質生産において、 目的とするタン パク質の種類によっては、 分泌生産はできないが細胞内への蓄積生産であれば可 能である場合がある。 その場合、 生産されたタンパク質によっては細胞内のタン パク質分解酵素の作用により分解されてしまい、 組換えタンパク質がほとんど得 られない場合があった。 ■
また、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシスは、 培養中に一部の菌体の溶菌が起 こり、 その結果、 培地中に細胞内タンパク質分解酵素を含むその細胞内のタンパ ク質が溶出することが知られている。 そのため、 細胞外に分泌生産された組換え タンパク質であっても、 その溶出した細胞内タンパク質分解酵素により分解され てしまう可能性があった。
したがって、 細胞内のタンパク質分解活性を低減することもまた、 遺伝子組換 え宿主としてのブレビバチルス■チヨゥシネンシスの有用性をより高めるために 解決すべき課題のひとつであつた。
なお、 これまで、 ブレビバチルス■チョウシネンシスの細胞内のタンパク質分 解活性の低減化を行った例は、 全く知られていない。
また、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシスの細胞内のタンパク質分解活' I生に関 する遺伝子レベルでの解明も、 これまで全く行われていない。 すなわち、 これま でブレビバチルス■チヨゥシネンシスの細胞内タンパク質分解酵素の単離を行つ た例は、 全く知られていない。 また、 細胞内ダンパク質分解酵素遺伝子のクロー 二ング及び配列決定を行った例についても全く知られていない。
更に、 ブレビバチルス 'チョウシネンシスを遺伝子,組換え宿主として、 より広 範な産業上の用途に利用可能にするためには、 上記のタンパク質分解活性の低減 とは別の問題を解決する必要があった。
プレビバチルス■チヨゥシネンシスは、 枯草菌などのバチルス属細菌と同様に 胞子体を形成する場合がある。 胞子体は生細胞 （非胞子菌体） に比べて耐熱性が 高く、 力なり厳しい殺菌条件が要求される。 そのため、 特に、 培養終了後に製造 ライン内の胞子体を含めた菌体の完全な滅菌 ·除去の保証が求められる組換えタ ンパク質医薬品の製造において、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシスを宿主に用 いて、 その製造を行うためには、 かなり難しい技術が要求された。
したがって、 組換えタンパク質医薬品の製造を初めとする広範な産業上の用途 においてブレビバチルス ·チョゥシネンシスを ,組換え宿主として利用可能にする ために、 胞子体を形成せず、 おだやかな殺菌条件 （6 0 °Cから 1 0 0 °C) でも完 全に死滅するプレビバチルス ■チヨゥシネンシス菌株が要望されていた。
• なお、 プレビバチルス■チ aゥシネンシスの胞子体の殺菌に必要とされる条件 は、 枯草菌の胞子体の殺菌に求められる条件よりはるかに弱い。 たとえば、 1 0 0 °Cでの枯草菌の胞子体の D値 （生細胞 （非胞子菌体） 及び胞子体を含むすべて の菌数を 1 / 1 0に減少させる、 各温度域での時間） は菌株によつて差があるも のの 1 1分程度とされている。 —方、 ブレビバチルス 'チョウシネンシスの胞子 体では 1分以下である。 しかしながら、 それでも、 プレビバチルス 'チョウシネ ンシスの胞子体の殺菌には、 その生細胞 （非胞子菌体） の殺菌に比べてかなり厳 しい条件が必要になる。 たとえば、 後述の実施例に示すように、 8 0 °Cでのプレ ビバチルス 'チョウシネンシスの生細胞 （非胞子菌体） の D値は 1分未満である 力 胞子体の D値は 6 7分程度である。
枯草菌においては無胞子性菌株としてバシラス■サチリス SMS 2 7 5 (特許 文献 4 ：特開平 4一 2 8 7 6 8 6 ) などが開示されている。 しかしながらブレビ バチルス■チヨゥシネンシスにおいては、 これまで胞子形成能を有しない菌株、 すなわち、 おだやかな殺菌条件でも完全に死滅する菌株は知られていなかった。 特 文献 1 ,
特開昭 60— 58074号公報
非特許文献 1
I n t. J . S y s t . B a c t e r i o l 46， 939-946 (19 -96)
特許文献 2
特開昭 .63-56277号公報
非特許文献 2
Ann. NY Ac a d. S c i . , 782 1 15-122 (1996) 特許文献 3 '
特開平 6— 29648 5号公報
特許文献 4
特開平 4一 287686号公報 発明が解決しようとする課題
前記のように、 ブレビバチルス 'チョウシネンシスは、 遺伝子組換えの宿主と して極めて優れた特性を有しているが、 遺伝子組換えの宿主として、 より一層、 その産業上の有用性を高めるためには解決すべき課題がいくつかあった。
それは、 細胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレビ バチルス ·チヨゥシネンシスを得ること。 また、 細胞内のタンパク質分解活性が 公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを得ること。 また更には、 胞子体を开成せず、 したがって、 おだやかな殺菌条件で完全に死滅 するブレビバチ^/ス■チヨゥシネンシスを得ることである。
したがって、 本発明は、 钾胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に 低減したことにより、 組換えタンパク質の分泌生産効率が向上したブレビバチル ス■チヨゥシネンシス。 また、 細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格 段に低減したことにより、 組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産効率が向上し たブレビバチルス 'チョウシネンシス。 胞子形成能を有しないことにより、 おだ やかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス ·チヨゥシネンシス。 また更に は、 細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したこ とにより、 組換えタンパク質の生産効率が向上し、 なおかつ、 胞子形成能を有し ないことにより、 おだやかな殺菌条件で完全に死滅するプレビバチルス 'チョウ シネンシスを提供することを目的とする。 なお本 明において 「細胞外及び細胞 内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減する」 には該活性が完全に 消失することも包含する。
また更 、 本発明は、 該ブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを宿主として利用 した遺伝子組換えによるタンパク質製造方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、 まず胞子形成能を有しないブレビバチルス■チヨゥシネンシス を得るために、 a換えタンパク質生産の宿主として実績のあるプレビバチルス · チヨゥシネンシス HPD31を親株に、 変異剤処理による突然変異株の取得を試み まず、 コロニーの形態の変化を指標にして変異が起きた株を選択することとし、 通常のプレビバチ ス■チヨゥシネンシスのコロニーの形態と異なりシヮを有し ないコロニーを形成した菌株を選択した。 更に、 これらの菌株の内から顕微鏡観 察で胞子が確認、できないものを、 胞子形成能を有しない可能 ^feがある菌株として 選択した。 更に、 これらの胞子形成能を有しない可能性がある菌株に対して胞子 形成能の評価試験を行い、胞子形成能を有しない菌株を選択した。そして、更に、 この菌株を宿主に用いた組換えタンパク質の生産性の評価試験を行い、 遺伝子組 換えの宿主に利用されている公知の菌株であるプレビバチルス ·チヨゥシネンシ ス HPD31と同等の組換えタンパク質の生産性を有している変異株を選択した。 以上により、 本発明者らは、 胞子形成能を有しないブレビバチルス 'チョウシネ ンシスを得た。 ― .
本発明者らは、 更に、 細胞外及び細胞内のタンパク質分解酵素活性が、 公知の 菌株より格段に低減されたブレビバチルス 'チヨゥシネンシス菌株を得るために、 前記の胞子形成能を有しないブレビバチルス .チヨゥシネンシス菌株を親株に用 いて、 更に、 細胞外及ぴ細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化を行つ た。 本発明者らは、 まず、 不活ィ匕の対象とな ¾タンパク質分解酵素遺伝子を同定 するために、 タン ク質分解酵素遺伝子のクローニングを試みた。 その結果、 本 発明者らは 2種類の新規のタンパク質分解酵素、 すなわち、 細胞内主要タンパク 質分解酵素である I M Pと細胞外主要タンパク質分解酵素である E M Pの遺伝子 のクローニングに成功し、 更に、 これらの遗伝子を不活化したブレビバチルス - チョウシネンシスを作製した。
なお、 本発明者らは、 プレビノくチルス ·チヨゥシネンシスのゲノム上の特定の タンパク軍分解酵素遺伝子の不活ィ匕を、 公知の相同組換えに準じた方法により行 つたが、 その際、 後述のとおり、 各遺伝子の不活化毎【こ薬剤耐性遺伝子等のマー カー遺伝子がゲノム上に残されることになる。 そのため多重の遺伝子不活化を行 うには、 遺伝子不活化の都度、 薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子をゲノム上か ら削除する必要がある。 本発明者らは、 そのマーカー遺伝子の削除に、 F R T配 列と酵母由来の F 1 pリコンビナーゼ遺伝子からなる系を利用した。 更に、 その 際、 後述の実施例に示すように、 F l pリコンビナーゼ遺伝子を有し、 かつ、 ネ ォマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合にはブレビバチルス■チヨ ゥシネンシスの菌体から容易に脱落するプラスミド D NAを新規に構築し、 これ を用いた。 このプラスミドは、 菌体内に導入しゲノム上に残されたマーカー遺伝 子を削除した後、 ネオマイシンを含まな 、培地で培養を行うことにより菌体から 容易に脱落させることができる。 このプラスミドを用いることにより多重遺伝子 不活化が可能になった。
更に、 本発明者らは、 このようにして得た細胞外及び細胞内の主要タンパク質 分解酵素遺伝子を不活化したブレビバチルス ·チヨゥシネンシス菌株について胞 子形成能及びタンパク質分解活'性の評価を行った。 その結果、 該菌株が胞子形成 能を有していないこと、 また、 細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の 菌株であるブレビバチルス 'チヨゥシネンシス H P D 3 1より格段に低減したこ とを確言忍した。 - また更に、 このブレビバチノレス■チヨゥシネンシス菌株を遺伝子組換えによる タンパク質生産の宿主に用いて、 他の公知のブレビバチルス ·チヨゥシネンシス 菌株を宿主に用いた場合には分泌生産後に分解を受けることが確認されているタ ンパク質の生産を行った。 その結果、 タンパク質の蓄積量が、 公知の菌株である ブレビバチルス ·チョウシネンシス H P D 3 1を宿主に用いた場合に比べて増加 していることを確認し、 本発明を完成させた。
以上により、 本発明は、 細胞外タンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低 減したことにより、 組換えタンパク質の分泌生産効率が向上したブレビバチル ス 'チヨゥシネンシス、 細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低 減したことにより、 組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産効率が向上したブレ ビバチルス■チヨゥシネンシス、 及び胞子形成能を有しないことにより、 おだや かな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを提供する。 また更には、 細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低 減されたことにより、 組換えタンパク質の生産効率が向上し、 なおかつ、 胞子形 成能を有しないことにより、 おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチル ス ·チョウシネンシスを提供する。
また更に、 本発明は、 該ブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを宿主として利用 した遺伝子組換えによるタンパク質製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1
本発明のブレビバチルス■チヨゥシネンシスの作製に用いた相同組み換えによ る遺伝子不活化法の概略を示す図である。
図 2
ゼラチン一 P A G E (ザィモグラフ) により、 ブレビバチルス ·チヨゥシネン シス H P D 3 1 (レーン 1 ) 、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス H P D 3 1—
S P 3 (レーン 2 ) の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性を測定した結果を 示す図面である。 なお、 白枠内は、 タンパク質分角?酵素活性によってゼラチンが 分解したために生じたクリァバンドを示す。 '
図 3
未変性条件下でのゼラチン一 P A G E (ザィモグラフ) により、 ブレビバチル ス 'チョウシネンシス HPD 31 (レーン 1) 、 ブレビバチ /レス 'チョウシネン シス HPD31— SP 3 (レーン 2) の細胞内画分のタンパク質分解酵素活性を 測定した結果を示す図面である。 なお、 白枠内は、 タンパク質分解酵素活性によ つてゼラチンが分解したために生じたクリアバンドを示す。
図 4
プレビバチルス■チョウシネンシス HPD 31及びブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HP D 31-SP 3を宿主として用いた遺伝子組換えにより分泌生産さ れたプタ I L一 1 に対する C B B染色の結果を示す図面であって、 ブタ I L一 1 βの分泌生産および分解を示す図面である。 なお、 レーン 1は遺伝子組換え体 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD3 l/p ΝΥ 301— p I L— 1 ]3を 示し、 レーン 2は遺伝子組換え体プレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31 -S P 3/pNY301-p I L— 1 /3を示す。
図 5
プレビバチルス ·チヨゥシ-ネンシス HP D 31及びブレビバチルス ·チヨゥシ ネンシス HPD 31-SP 3を宿主として用いた遺伝子組換えにより分泌生産さ れたブタ I L- 1 βに対する抗ブタ I L- 1 ]3抗体によるウェスタンブロットの 結果を示す図面であって、 ブタ I L一 1 /3の分泌生産および分解を示す図面で ,あ る。 なお、 レーン 1は遺伝子組換え体ブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 3 l/ NY301-p I L— l i3を示し、 レーン 2は遺伝子組換え体ブレビバ チルス ,チヨゥシネンシス HPD31— S P 3/ρΝΥ301— p i L_ 1 /3を 示す。
図 6
ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31及びプレビバチルス 'チョウシ ネンシス HP D 31-SP 3を宿主として用いた遺伝子糸且換えにより、 細胞内に 蓄積生産されたブタ I FN— yに対する抗ブタ I FN— 0/抗体によるウェスタン プロットの結果を示す図面であって、 ブタ I L一 1 γの細胞内への蓄積生産と分 解を示す図面である。 なお、 レーン 1は遺伝子組換え体ブレビバチルス■チヨゥ シネンシス H P D 31 / ρ " Υ 301を示し、 レーン 2は遺伝子組換え体ブレビ バチルス ■チヨゥシネンシス HPD31/ρ ΝΥ 301— ρ I NF- γを示し、 レーン 3は遺伝子糸且換え体ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— SP 3/pNY301— p I FN— γを示す。 .
図 7 ,
胞子形成関連遺伝子 h o sの DNA塩基配列 （上段） 及びそれに対応するアミ ノ酸配列 （下段） を示す。
図 8
同上続きを示す。
図 9
細胞外タンパク質分解酵素 E M Pのァミノ酸配列 （下段） 及びそれをコ一ドす る遺伝子 em pの DN A配列 （上段） を示す。
図 10
同上続きを示す。 .
図 11
同上続きを示す。
図 12
細胞内タンパク質分解酵素 I M Pのァミノ酸配列 （下段） 及びそれをコ一ドす る遺伝子 i の DNA配列 （上段） を示す。 ， 図 13
同上続きを示す。
図 14
プライマー Ho s P l、 Ho s P 2、 Ho s P 3、 Ho s P 4を示す。 図 15
プライマー imp P l、 imp P 2を示す。
図 16
プライマー f 1 p P Iを示す。
図 17 .
プライマー f 1 p P 2を示す。 - 図 18
プライマー f 1 p P 3を示す。 図 19
プライマー f l p P4を示す。 .
図 20 ,
プライマー f 1 ρ P 5を示す。
図 21
プライマー f l p P 6を示す。
図 22
プライマー f 1 P 7を示す。 '
図 23 .
プライマー f l p P 8を示す。
図 24
プライマー e m p P i、 e mp P 2の塩基配列及びァミノ酸配列データを 示す。
図 25
プライマー emp P 3、 e mp P4、 アダプタープライマーを示す。 図 26
実施例 19におけるセンスプライマーを示す。 ' 図 27
同アンチセンスプライマーを示す。
図 28
実施例 20におけるセンスプライマーを示す。
図 29
同アンチプライマーを示す。
図 30
実施例 21におけるセンスプライマーを示す。
図 31 .
同アンチセンスプライマーを示す。 "
図 32
実施例 23におけるセンスプライマーを示す。 図 3 3
同アンチセンスプライマーを示す。
図 34 ,
実施例 24におけるセンスプライマーを示す。
図 3 5
同アンチセンスプライマーを示す。
図 3 6
実施例 25におけるセンスプライマーを示す。
図 3 7 .
同ァンチセンスプライマーを示す。 以下、 本発明について詳述する。
本発明は、下記の （1) 〜 （1 6) を実施態様の例として包含するものである。
( 1 ) 胞子を形成しないブレビバチ^/レス■チョゥシネンシス。
(2) 下記の菌学的性質を有し、 胞子を形成しないプレビバチルス 'チョウシ ネン ス。
(a) 形態 , 細胞の大きさ
液体培地： 0. 4〜O . 6 X 1. 5〜4 /_im
細胞の形 ' 桿菌
胞子の有無 無
(b) 生理学的性質
硝酸塩の還元 一
VPテスト 一
クェン酸の利用 +
ゥレアーゼ _ 一
ォキシダーゼ +- カタラーゼ +
(c) 他の性質 温度抵抗性 60°Cで死滅する。
(3) 胞子形成関連遺伝子 h o sが不活性化されたこと、 を特徴とする胞子を 形成しないブレピノ,くチノレス ·チヨゥシネンシス。
( 4 ) 胞子形成関連遺伝子 h o sの塩基配列が配列番号 1に示す配列であるこ と、 を特徴とする請求項 3に記載のプレビバチルス■チヨゥシネンシス。
(5) 胞子を形成せず、 且つ、 細胞外及び Z又は細胞内のタンパク質分解酵素 活性が低減ないし消失したブレビバチルス ■チヨゥシネンシス。
(6) 下記の菌学的性質を有し、 胞子を形成しないブレビバチルス ·チヨゥシ
(a) 形態
細胞の大きさ
液体培地： 0.
細胞の形
胞子の有無
Figure imgf000016_0001
(b) 生理学的性質
硝酸塩の還元
VPテスト
クェン酸の利用 +
ゥレアーゼ
才キシダーゼ +
カタラーゼ +
(c) 他の性質
温度抵抗性 60°Cで死滅する (
細胞外のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
( 7 ) 細胞外主要タンパク.質分解酵素遺伝子 e m pが不活性化されたこと、 を 特徴とするブレビバチノレス■チヨゥシネンシス。
( 8 ) 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 e m pの塩基配列が配列番号 3に 示す配列であること、 を特徴とする請求項 7に記載のブレビバチルス 'チョウシ ネンシス。
(9) 細胞内主要タンパク質分角?酵素遺伝子 impが不活性化されたこと、 を 特徴とするブレビ チルス 'チヨゥシネンシス。
(10) 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i m pの塩基配列が配列番号 5 に示す配列であること、 を特徴とする上記 (9) に記載のブレビバチルス 'チヨ ゥシネンシス。
(1 1) 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 e m p及び細胞内主要タンパク 質分解酵素遺伝子 i m pが不活性化されたこと、 を特徴とするプレビバチルス · チヨゥシネンシス。
(12) 胞子を形成しないこと、 を特徴とする上記 （1 1) に記載のブレビバ チノレス ■チヨゥシネンシス。
(13) プレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31— S P 3 (FERM B P- 08479)。
(14) 上記 （1) 〜 （13) のいずれか 1項に記載のブレビバチルス ·チ ョゥシネンシスを、 タンパク質をコ一ドする遺伝子を組込んだ発現べクターによ り形質転換してなるブレビバチノレス ·チヨゥシネンシス。
(15) 上記 （ 14 ) に記載のブレビバチルス 'チョウシネンシス形質転換体 を培養する工程を含むこと、 を特徴とするタンパク質の製造方法。
(16) 上記 (1) 〜 (13) のいずれか 1項に記載のブレビバチルス -チ ョゥシネンシスを組換えタンパク質生産の宿主として使用すること、 を特徴とす る組換えタンパク質を製造する方法。 本発明の胞子形成能を有しないブレビバチルス ·チヨゥシネンシスは、 親株で あるブレビバチルス■チヨゥシネンシスに対して変異剤による薬剤処理を行い、 薬剤処理の結果、 得られた変異株の中から胞子形成能を有しない菌株を選択する ことにより取得した。 実施^では、 変異剤にニトロソグァ二ジンを使用したが、 変異剤として亜硝酸、 メタンス /レホン酸ェチルなども利用可能である。 或いは、 紫外線、 γ線なども利用することができる。 また、 本発明の胞子形成能を有しな い変異株を取得するための親株は、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシスに属する 菌株であれば特に限定されないが、 遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主と して実績のあるブレビ/くチルス .チョウシネンシス HPD 31 (FERM BP -1087) 、 または、 その変異株のブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31 -S 5 (FERM BP— 6623) が特に好ましい。 なお、 得られた変異 株の胞子形成能の有無は、 耐熱性試験、 或いは、 D値の測定などにより行うこと が可能である。 また、 D値 （D— v a 1 u e) は生細胞 （非胞子細胞） 及び胞子 体を含むすべての菌数を lZl 0に減少させる各温度域での時間を意味し、 菌体 の死滅率の指標として用いられている。
また、 本発明が提供する胞子形成能を有しないブレビバチルス■チヨゥシネン シス菌株に対してゲノム 'ライブラリーを用いた解析を行い、 胞子形成に関連し ていると推定される遺伝子が不活化されている事を確認した。 この不活化された 遺伝子を h o sと命名した。 胞子形成関連遺伝子 h o sの DN A配列の例として プレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31の h o sの DN A塩基配列を配列 表の配列番号 1 (図 7、 図 8の上段） に示し、 その DN A塩基配列に対応するァ ミノ酸配列を配列番号 2 (図 7、 図 8の下段） に示した。
また.、 本発明の細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が、 格段に低減したブ レビバチルス 'チョウシネンシスは、 プレビバチルス 'チョウシネンシスゲノム 上の細胞外及び細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化を行うことによ り得ることができる。 本発明のタンパク質分解活性が格段に低減したブレビバチ ルス 'チヨゥシネンシスを得るために、 不活化の対象とするブレビバチルス ·チ ョゥシネンシスのゲノム上のタンパク質分解酵素遺伝子は特に限定されないが、 特に好ましいものとして細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i mp及び細胞外 主要タンパク質分解酵素遺伝子 e m pをあげることができる。
細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 e m pの D N A配列の例として、 ブレビ バチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31の e mp遺伝子の DNA塩基配列の配列 番号 3 (図 9〜11の上段） 示し、その DN A配列に対応するプレビバチルス · チヨゥシネンシス HPD 31の細胞外主要タンパク質分解酵素 EMPのアミノ酸 配列を配列番号 4 (図 9〜： L 1の下段） に示す。
また、 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i m pの D N A配列の例として、 ブレビバチルス .チョウシネンシス H P D 3 1の i m p遺伝子の D N A塩基配列 を配列番号 5 (図 1 2〜1 3の上段） に示し、 その D NA配列に対応するプレビ バチルス ·チヨゥシネンシス H P D 3 1の細胞内主要タンパク質分解酵素 I MP のアミノ酸配列を配列番号 6 (図 1 2〜1 3の下段） に示す。 EMP及び I MP は、 いずれも、 公知のタンパク質とアミノ酸配列に 4 0 %以上の相同性がない新 規なタンパク質である。
また、 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入 もしくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質であつてもタンパク質分解 活性を有する限り、 全てタンパク質分解酵素 EM Pに包含される。 ここで 「一部 のァミノ酸が置換、 欠失、 揷入もしくは付加されたァミノ酸配列」 とは、 ァミノ 酸残基の種類ゃタンパク質の立体構造におけるァミノ酸残基の位置によっても異 なるが、 前記配列番号 4のァミノ酸配列全体に対し、 6 0 %以上、 好ましくは 7 ひ％以上、より好ましくは 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。 更に、 配列番号 6に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入 もしくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質であってもタンパク質分解 活性を有する限り、 全てタンパク質分解酵素 I M Pに包含される。 ここで 「一部 のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入もしくは付加されたァミノ酸配列」 とは、 アミ,ノ 酸残基の種類やタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置によっても異 なるが、 前記配列番号 6のァミノ酸配列全体に対し、 5 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、より好ま Lくは 7 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を意味する。 また、 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入 もしくは付加されたァミノ酸配列力 らなるタンパク質をコ一ドする遺伝子であつ ても、 そのコードしているタンパク質がタンパク質分解活性を有する限り、 全て タンパク質分解酵素遺伝子 e m p (配列番号 3 ) に包含される。 ここで 「一部の ァミノ酸が置換、 欠失、 挿入もしくは付加されたァミノ酸配列」 の意味は、 上記 した EM Pについての場合 同様である。
'また更に、 配列番号 6に記載のァミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入もしくは付加されたァミノ酸酉己列からなるタンパク質をコードする遺伝子で あっても、 そのコードしているタンパク質がタンパク質分解活性を有する限り、 全てタンパク質分解酵素遺伝子 imp (配列番号 5.) に包含される。 .ここで 「一 部のァミノ酸が置換、 欠失、 挿入もしくは付加されたァミノ酸配列」 の意味は、 上記した IMPに いての場合と同様である。 emp遺伝子及ぴ i mp遺伝子も、 従来単離されたこともなければ、 DNA配列の決定もされておらず、 従来未知の 新規遺伝子である。
このブレビバチルス -チヨゥシネンシスのゲノム上の細胞内主要タンパク質分 解酵素遺伝子 i m p及び細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 e m pのクロー二 ングは、 Mo 1 Θ c u 1 a r C l o n i n g 2 n d Θ α . , A L b ο r a t 9 r y Ma nu a l , C o l d Sp r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y Pr e s s, New Yo r k (1989) 等に記载 の当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜、 選択し、 組み合わせて用い ることにより行うことができる。 たとえば、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス のゲノム DNAライブラリ一を作製し、このゲノム DNAライブラリーに対して、 不活化対象となる遺伝子をコードする D N A配列の一部を有する D N A断片をプ ローブに用いたハイブリダィゼーシヨン法により、 もしくは、 この DNA断片を プライマーとして用いる PC R法により行うことができる。
また、 ブレビバチルス ·チョゥシネンシスのゲノム上の i mp遗伝子または, e m p遺伝子の不活化は、公知の相同組換えに準じた方法により行うことができる。 例えば、 i m p遺伝子の不活ィヒは、 以下に示す手順により行うことができる。 まず、 i m 遺伝子を含む DNA断片をプレビバチルス 'チョウシネンシスで 複製不可能なベクター、 例えば大腸菌で複製可能なベクターにクローニングし、 i mp遺伝子内部の一部領域を FRT配列 （G e n e， 212， 77— 86 (1 998) ) を両側に持つ薬剤而村生遺伝子 （例えばネオマイシン耐性遺伝子） から なる DNA断片に置きかえ i 遺伝子を分断する。 その結果、 その一部がネオ マイシン耐性遺伝子に置きかわったことにより不活化された i m p遺伝子を含む ベクターを得る。 更に、 この _ベクターに上記の不活ィ匕された i mp遺伝子がゲノ ム DN Aに組み込まれたブレビバチルス ·チョウシネンシス菌株を選択するため の第二の薬剤耐性遺伝子 （例えばエリスロマイシン耐性遺伝子） を揷入すること により、 imp遺伝子不活化用ベクターを構築する。 次いで、 この i mp遺伝子不活化用ベクターをブレビバチルス■チヨゥシネン シスに導入し、 ネオマイシン耐性を示す菌株を選抜する。 この i m p遺伝子不活 化用ベクターの導 Sにより、 一部のブレビバチルス■チヨゥシネンシス菌体にお いて、 ゲノム上の i mp遺伝子と、 i mp遺伝子不活化用ベクター上の不活化さ れた imp遺伝子との間で相同組換え反応が誘発される。 その結果、 ネオマイシ ン耐性を示す菌株には、 ネオマイシン耐性遺伝子一 F R Tカセットの上流側の i mp部のみで相同組換え反応が起こっている株、 下流側の i mp部のみで相同組 換え反応が起こっている株、 上流側及び下流側の 2箇所の i m 部で相同組換え 反応が起こっている株 (ダブルクロスオーバー株) が含まれることになる。 目的とするゲノム上の imp遺伝子が不活化された菌株はダブルクロスオーバ 一株であり、 また、 ダブルクロスオーバー株はエリスロマイシンに対して感受性 を示す。 そのため、 これらのネオマイシン Di生を示す菌株を、 更に、 エリスロマ ィシンを含む TM寒天培地で培養し、 エリス口マイシンに対する感受性を示す菌 株を選抜する。 以上により、 ゲノム上の i m p遗伝子が不活化されたブレビバチ ルス 'チヨゥシネンシス菌株を得ることができる。
上記で得たブレビバチルス■チヨゥシネンシス菌株の i mp遺伝子の不活化の 確認は、 PCRとゲノミックサザン解析などにより行うことができる。 ， 更に、 上記で得た i m p遺伝子不活化株のゲノム上からネオマイシン耐性遺伝 子の削除を行う。 上記の i m 遺伝子不活化株に導入されたネオマイシン耐性遺 伝子は、 その上流域と下流域に FRT配列を有しているため、 FRT配列を特異 的に認識する F 1 pリコンビナーゼを用いた FRT配列間の組換え反応により上 記で得た i m 遺伝子不活化株からネオマイシン耐性遗伝子を削除することが可 能である。
具体的には、 まず、 ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合に は、 プレビバチルス -チヨゥシネンシス菌体から容易に脱落するプラスミドべク ターを調製する。 更に、 このプラスミドベクターに酵母由来の F 1 pリコンビナ ーゼ遺伝子 （Na t u r e, 286, 860— 864 (1980) ) とブレ ォマイシン耐性遺伝子を組み込んだネオマイシン耐性遺伝子削除用べクターを作 製する。 次！/、で、 上記で得た i m p遺伝子不活化株に、 このネオマイシン耐性遺伝子削 除用ベクターを導入し、 更に、 ブレオマイシンを含む TM寒天培地上で培養する ことにより、 このベクターにより形質転換された菌株を選別する。 次いで、 この 形質転換された菌株を、ブレオマイシンを含まない TM液体培地で振とう培養後、 更に、 TM寒天培地で培養する。
目的とするネオマイシン耐性遺ィ云子が削除された i m p遺伝子不活化株は、 ネ ォマイシン耐性遺伝子の両側の F R T配列間の組換え反応によりゲノム上のネオ マイシン耐性遺伝子が削除され、 なおかつ、 ネオマイシン耐性遺伝子削除用べク ターが脱落している菌株である。 この菌株は、 ネオマイシンとブレオマイシンに 対して感受性を示す。 そこで、 T M寒天培地上にコロニーが得られた菌株からネ ォマイシンとブレオマイシンに対-して感受性を示す菌株を選抜することにより、 目的とするネオマイシン耐性遺伝子が削除された i m p遺伝子不活化株を得た。 以上により、 目的とするブレビバチルス■チヨゥシネンシスの i m p遺伝子不 活化株を得ることができる。 以上の手順の概略を図 1に示した。
また更に、 タンパク質分解酵素遺伝子 i m p及び e m pの双方とも不活化され たブレビバチルス 'チョウシネンシス菌株は、 上記により構築した i m p遺伝子 不活化株を親株に用いて、 更に、 そのゲノム上の e m p遺伝子を不活化するこ により得ることができる。 e m p遺伝子の不活化は、 i m p遺伝子の不活化と同 様の手順を繰り返すことにより可能である。
なお、 上記の方法においてマーカー遺伝子として用いられるネオマイシン耐性 遺伝子、 エリス口マイシン耐性直伝子、 プレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性 遺伝子は例示であって、 上記の方法に用いられるマーカ一遺伝子の種類は特に限 定されない。 任意の複数のマーカー遺伝子を用い、 上記の手順に従うことにより 相同組換えによる遺伝子の不活ィ匕を行うことができる。
以上に記したブレビバチルス · チョウシネンシスゲノム上の細胞外及び細胞内 の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化により、 本発明の細胞外及び細胞内の タンパク質分解活性が、 公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス 'チョウ シネンシス菌株を得ることができる。
プレビバチルス ·チヨゥシネンシス菌株のタンパク質分解活性は、 ゼラチン一 PAGE (ザィモグラム） 法またはァゾカゼインゃァゾコール等のタンパク質を ァゾ化した基質を用いた方法などにより測定することができる。
以上に記載の方法により得られた、 本発明の胞子形成能を有しないブレビバチ ルス 'チヨゥシネンシスの例としては、 実施例に示すブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD31— SP 1 (BrevibacUlus choshinensis HPD31-SP1) を挙げ ることができる。 また、 公知の菌株より格段に細胞内のタンパク質分解活性が低 減し、 なおかつ、 胞子形成能を有しないブレビバチルス■チョウシネンシスの例 としては、 実施例に示すプレビバチルス■チヨゥシネンシス HP D 31 -S P 2 (BrevibaciUus choshinensis HPD31-SP2) を挙げることができる。 また更に、 公知の菌株より格段に細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が低減し、 なおか つ、 胞子形成能を有しないブレビバチルス■チヨゥシネンシスの例としては、 実 施例に示すプレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— SP 3 (Brevibadllus choshinensis HPD31-SP3) を挙げることができる。
ブレビバチルス■チョ ウシネンシス HPD31一 S P 3 (BrevibaciUus choshinensis HPD31-SP3) は、 平成 15年 9月 11日付で特許生物寄託センタ 一 （茨城県つくば市東一丁目 1の 1) にブダペスト条約下に国際寄託され、 受託 番号 FERM B P- 0 8479が与えられた。 ， 本発明に係るプレビバチルス■チヨゥシネンシスは、 （ィ ) 胞子を形成しなレ、、 (口） 細胞外主要タンパク質分解酵素活性が低いないしはない、 （ハ） 細胞内主 要タンパク質分解酵素活性が低いないしはない、 の 3要件の内の少なくともひと つを有する点で特徴的であり、 他の性質は、 通常のブレビバチルス 'チョウシネ ンシスと格段に相違するものではない。 その菌学的性質は次のとおりである。 (a) 形態
細胞の大きさ
液体培地： 0. 4~0. 6X 1. 5〜4 /m
胞子の形 . 桿菌
' 胞子の有無 無 ―
細胞の多形性の有無 無
運動性の有無 有 （周毛） (b) 生理学的性質
硝酸塩の還元
VPテスト （ァセトインの生成）
ィンドールの生成
硫化水素の生成 （T S I寒天培地） +
クェン酸の利用 +
無機窒素源の利用
硝酸塩
アンモニゥム塩 ' +
色素の生成 （キング培地）
ゥレアーゼ
ォキシダーゼ +
カタラーゼ +
O— Fテスト 分解せず
ゼラチンの分角军
グルコースから酸の生成
キシロースから酸の生成
ラタトースから酸の生成
マルトースから酸の生成
生育できる: H 6~8. 5
(c) 他の性質
温度抵抗性 60°Cで死滅する
細胞外のタンパク質分解酵素活 t生 低いないしなし （注 1)
細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし (注 2)
(注 1 )
以下のいずれの方法にお ても培養上清中にタンパク質分解活性が検出されな い。 '
(1) ゼラチン一 PAGEによるゼラチンの分解活性測定法。
(2) 培養上清とァゾカゼインを反応させ、 反応液の吸光度変化を計測するァゾ カゼィンの分解活性測定法。 .
( 3 ) 培養上清とァゾコ一ノレを反応させ、 反応液の吸光度変化を計測するァゾコ ールの分解活性測定法。
(注 2 )
ゼラチン一 P AG Eによるゼラチン分解'活生の測定によっても、 細胞内画分に ゼラチン分解活性が検出されない。
なお本発明において、 「細胞外のタンパク質分解酵素活性が公知菌より格段に 低減された」 とは、 ァゾカゼィン法又はァゾコ一ノレ法にて測定した場合の培養上 清中の該酵素活性が、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス公知菌株の該酵素活性 の l Z l 0以下、 好ましくは 1 Z 3 0以下、 更に好ましくは 1 / 1 0 0以下にま で低下することをいい、 後記する実施例では、 l Z l 2 0以下、 1 / 3 3 0以下 のデータも示されている。
同じく 「細胞内のタンパク質分解酵素活性が公知菌株より格段に低減された」 とは、 ァゾカゼイン法により測定した場合の細胞内画分中の該酵素活性が、 ブレ ビバチルス 'チョウシネンシス公知菌株の該酵素活性の 1 Z 2以下、 好ましくは 1 / 5.以下、 更に好ましくは 1ノ8〜1 / 1 0以下をいう。
これらの低減値は、 了ゾカゼィン法ゃァゾコ一ノレ法で測定した場合のものであ るので、 他の方法で測定した ± 合には、 これらの低減値に基づいてそれぞれの低 減値を規定すればよいことほいうまでもない。
更に、 本発明は、 上記のブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを宿主菌として用 レヽる遺伝子組換えによるタンパク質生産方法を提供する。
本宪明のプレビバチルス · チヨゥシネンシスを宿主菌として用いたタンパク質 生産に用いられる発現ベクターは、 プレビバチルス■チヨゥシネンシス中で複製 可能であるものならば特に限定されないが、 好ましいものとしてバチルス■ブレ ビス 4 7の主要菌体外タンパク質遺伝子 （MWP遺伝子） のプロモーター領域、 ブレビバチルス 'チョウシネ^シス H P D 3 1の主要菌体外タンパク質遺伝子（H W 遺伝子） のプロモーター領域を有する発現ベクターを挙げることができる。 また、 通常、 ブレビバチルス 'チョウシネンシスを宿主とする糸且換えタンパク質 生産系において生産されたタンパク質は、 宿主細胞内に蓄積せずに、 細胞外への 分泌を行うため、 プロモーター領域をコードする D NA配列の 3 ' 末端側に分泌 シグナルぺプチドをコ一ドする D NA配列を含むものが望ましい。 分泌シグナル ペプチドをコードする D N A配列として好ましいものとして、 プレビバチルス · チョウシネンシス H P D 3 1の主要菌体外タンパク質の分泌シグナルぺプチドを コードする D N A配列などを挙げることができる。
具体的には、 本発明のブレビバチルス 'チョウシネンシスを宿主に用いた組換 えタンパク質生産に用いられる発現ベクターとして好ましいものとして、 p HT 1 1 0 (特開平 6—1 3 3 7 8 2 ) 、 NY 3 0 1 (特開平 1 0— 2 9 5 3 7 8 ) 等を挙げることができる。
本発明において発現ベクターに組み込まれるタンパク質をコードする DNAは、 本発明のブレビバチルス ·チヨゥシネンシスを宿主に用いた組換えタンパク質生 産において、 その発現が可能であるものであれば特に限定されない。 例えば、 サ イト力イン、 ケモカイン、 酵素、 ホルモンなどの遺伝子、 もしくは、 その他の任 意のペプチドをコードする DNA断片などのいずれであってもよい。 また、 遺伝 子組換えにより生産されるタンパク質の用途も特に限定されない。 その用途は医 薬品、 生化学試薬、 産業用酵素などのいずれであってもよい。
発現ベクターへのタンパク質をコードする D NAの挿入は、 精製された当該タ ンパク質をコードする D N Aを適当な制限酵素で処理することにより得た D N A 断片を発現用ベクターの適当な制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイ トに挿入し、 連結するなどの当業者に公知の一般的な方法により行うことができ る。
更に上記のタンパク質をコードする D N Aを組み込んだ発現べクターを、 本発 明のブレビバチルス ·チョゥシネンシスに導入することによりブレビバチルス - チヨゥシネンシスの形質転換を行うことができる。 本発明のブレビバチルス ·チ ョゥシネンシスへの発現ベクターの導入の方法も特に限定されず、 当業者に公知 の方法を適宜選択して行え ょレ、が、特に好ましい方法として、ブレビバチルス ' チヨゥシネンシスへの発現ベクターの導入に通常用いられるエレクトロポレーシ ョン法を例示することができる。
更に、 この形質転換体を用いたタンパク質の生産は、 この形質転換体を適切な 培地に接種、培養し、培養終了後、 タンパク質を回収 ·精製することにより行う。 本発明のブレビバチルス ·チヨゥシネンシスの形質転換体の培養条件も、 形質 転換体の培養及び組換えタンパク質遺伝子の発現が可能なものであるならば、 特 に限定されないが、 特に好ましい条件として、 本明細書の実施例で用いた TM培 地 （ペプトン 1 %、 肉エキス 0 . 5 %、 酵母エキス 0 . 2 %、 グルコース 1 %、 p H 7 . 0 ) または 2 S L培地 （ぺプトン 4 %、 酵母エキス 0 . 5 %、 ダル コース 2 %、 p H 7 . 2 ) で 3 0 °C、 2〜 4日間の培養条件を例示することが できる。
また、 ^要に応じて、 硫酸鉄、 硫酸マンガン、 硫酸亜鉛などの無機塩類を適宜 カロえてもよい。
更に、 組換えタンパク質が分泌生産される場合には、 培養終了後、 遠心分離、 ろ過などの一般的な方法でブレビノ チノレス ·チヨゥシネンシスの培養細胞と分泌 生産されたタンパク質を含む上、? を分離することにより生産された組換えタンパ ク質を回収することができる。
また、 生産されたタンパク質が分泌生産されず、 プレビバチルス 'チョウシネ ンシスの細胞内に蓄積される場合にも、 当業者に公知の方法を適宜用いることに より、 細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。 例えば、 培 養液から遠心分離、 ろ過などの方法により菌体を採取し、 次いで、 この菌体を超 音波破砕法、 フレンチプレス法などにより破砕し、 また必要に応じて界面活性剤 等を添加して可溶化することにより、 細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収 することができる。
更に、 生産されたタンパク質の精製を行う場合には、 当業者に公知の方法、 た とえば溶媒抽出、 限外濾過、 硫酸ァンモ-ゥム沈殿、 ゲルろ過ク口マトグラフィ 一、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 疎水性 クロマトグラフィー、 電気泳動、 等電点沈殿などの方法を適宜、 単独または組み 合わせて用いることにより うことができる。 発明の効果
本発明のブレビバチルス 'チョ ウシネンシスは、 遺伝子組換えによるタンパク 質生産における宿主として利用することができる。 .
本発明は、 細胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレ ビバチルス ,チヨ ゥシネンシスを提供する。 該ブレビバチルス ·チヨゥシネンシ スは、 分泌生産される組換えタンパク質生産の宿主に用いられた場合、 細胞外の タンパク質分解活性による組換えタンパク質の分解を顕著に抑制する。 そして、 このことにより、該ブレビバチルス 'チョウシネンシスは公知のブレビバチルス · チヨゥシネンシスより効率的な組換えタンパク質の分泌生産を可能にする。 また、 本発明〖ま、 細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減し たブレビバチルス ■チヨゥシネンシスを提供する。 該ブレビバチルス 'チョウシ ネンシスは、 細胞内に蓄積生産される組換えタンパク質生産の宿主に用いられた 場合、 細胞内のタンパク質分解活性による組換えタンパク質の分解を顕著に抑制 する。 そして、 このことにより、 該ブレビバチルス 'チョウシネンシスは公知の ブレビバチルス - チョウシネンシスより効率的な組換えタンパク質の細胞内への 蓄積生産を可能にする。
また更に、 本発明は、 胞子体を形成しないブレビバチルス■チヨゥシネンシス を提供する。 該ブレビバチルス ·チヨゥシネンシスは、 おだやかな殺菌条件で完 全に死滅するため、 組換えタンパク質医薬品の製造を初めとする産業上の広範な 用途において組換えタンパク質生産の宿主として利用することが可能である。
したがって、 本 明のブレビバチルス ■チョウシネンシスは遺伝子組換えによ るタンパク質生産の宿主として極めて有用である。 本菌のひとつ H P D 3 1— S P 3株を国際寄託したが （F E RM B P— 0 8 4 7 9 ) 、 この菌株は上記 3条 件をいずれも満足する新規 3重欠損株である。
以下、 本発明を実施例により更に具体的に説明する力 本発明をこれらの実施 例のいずれかに限定することを意図するものでない。 実施例 . 実施例 1
(胞子形成能を有しないプレビバチルス■チヨゥシネンシス変異株の取得） ブレビバチルス ，チヨクシネンシス HPD 3 1 (FERM B 1 0 8 7) (F ERM B P—6 8 6 3) に対してニトロソグァ二ジンによる変異剤処理を 行い、 胞子形成能を有しないブレビバチルス ·チヨゥシネンシス変異株の取得を 試みた。
まず、 ブレビバチルス ' チョウシネンシス HPD 3 1を TM液体培地 （ぺプト ン 1。/0、 肉エキス 0. 5 %、 酵母エキス 0. 2%、 グルコース 1 %、 p H7. 0) で一晚、 30°Cで培養した。 培養終了後、 遠心分離により菌体を回収 し、 更に、 回収した菌体を滅菌水で ODが 0. 1になるように洗浄希釈した。 次 いで、 こ c 菌体に 1 00m g/Lとなるように Nメチル— N， —ニトロ一 N—ニトロ ソグァニジンを添加し、 ^存率が 1〜 1 0 %となるように振とうすることで、 変 異剤処理を行った。
次いで、 変異剤処理を ί亍つた菌体を滅菌水で適宜希釈した後、 ΤΜ平板培地に 塗抹し、 3日間 30 °Cで塔養を行 、、 TM平板培地上に菌株のコロニーを形成さ せた。 通常のブレビバチノレス 'チョウシネンシスのコロニーと異なり、 表面にシ ヮがない平滑なコロニーを形成した菌株を選択し、 更に、 これらの選択した菌株 の内から顕微鏡観察により胞子が確認できないものを胞子形成能を有しない可能 性がある菌株として選択した。 以上の変異処理及ぴコロニー形成を繰り返すこ,と により胞子形成能を有しなレヽ可能性がある変異株を 5株得た。 実施例 2
(変異株の耐熱性試験による胞子形成能の評価）
実施例 1で得た 5株の変異株について耐熱性試験による胞子形成能の評価を行 つた。 試験の対照にはブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 3 1を用いた。 ブレビバチルス 'チヨクシネンシス H P D 3 1及び変異株 5株 （N o . 1〜N o. 5) をそれぞれ TM寒天培地に塗布し、 3 0°Cで 7 S間静置培養した。 なお、 胞子体を形成させるために通,常の培養期間より長い 7日間の培養を行った。 培養 終了後、 6 6 0 nmにおける吸光度が 1. 0になるように菌体を 0. 8%N a C 1を含む滅菌蒸留水に懸漏し、 菌体懸濁液 1 0 0 μ 1を 8 0°Cで 1 0分間保温し た後、 TM寒天培地に塗布した。 更に 30°Cの恒温で 24時間培養し、 生育した コ口ニー数から生菌数を計測した。 、
また、 80°C加熱処理前の菌体懸濁液を段階的に滅菌蒸留水にて希釈後、 T M寒天培地に塗布し、 30°Cの恒温で 24時間培養した。 培養終了後、 生育した コロニー数から生菌数を計測した。 以上の結果を表 1に示す。
(表 1) 生 菌 数
80°C加温前 80°C加温後 プレビバチルス ·
チヨゥシネンシス I-IPD 31 3. 3 X 10
ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス変異株 N o. 1 4. 3 X 10
プレビバチルス ·
チョウシネンシス変異株 N o. 2 1. 7X 10
ブレビバチノレス '
チョウシネンシス変異株 N o. 3 2. 6X 10
ブレビバチルス ■
チョウシネンシス変異株 N o. 4 6. 5 X 10
ブレビバチルス ·
チヨゥシネンシス変異株 N o. 5 8. 1 X 10 上記の表 1が示すように、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31は、 80°C、 10分間の加温によって全菌数の約 1 2程度しか死滅しないのに対し、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス変異株 N 0-. 1〜N o . 5は同条件によって 完全に死滅する。 つまり耐熱性胞子を形成しないことが強く示唆された。 実施例 3 '
(変異株の D値の測定） .
次いで、 ブレビィチルス ,チヨゥシネンシス変異株 N o . 1〜N o . 5につレヽ て菌体の D値の測定試験を行った。 試験の対照にはブレビバチルス ·チヨゥシネ ンシス HPD 3 1を用いた。
ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス I- IPD 3 1及びブレビバチルス 'チョウシ ネンシス変異株 No. l〜N o. 5のそれぞれを TM寒天培地に塗布し、 30°C で 7日間静置培養した。 培養終了後、 6 6 0 n mにおける吸光度が 1 · 0になる ように菌体を 0. 8。/。滅菌食塩水に懸濁後、 60 °C、 7 0。C及び 80 °Cの各温度 で保温し、保温開始から 1分後、 2分後、 3分後、 5分後、 1 0分後、 20分後、 30分後、 60分後の各々の時点で懸濁液を分取した。 次いで分取した各々の懸 濁液を冷却した後、 TM寒天培地に塗布し 3 0 °Cで 24時間培養した。 培養終了 後、 生育したコロニー数力、ら菌数を計測した。 更に、 計測した菌数から胞子体の 数を 1/1 0に減少させる時間として菌体の D値を求めた。
なお、 通常、 ブレビバチルス 'チョウシネンシスの生細胞 （非胞子菌体） は、 60°C以上の温度域において直ちに死滅するため、 試験開始後 1分において残存 している菌体は、 すべて胞子体であると仮定して計算を行った。 以上の結果を表 2に示す。
(表 2)
D値 (分間) 菌 株 60 °C 70 °C 80 °C プレビバチノレス ·
チヨゥシネンシス HPD 3 1 330 94 67 プレビバチノレス ■ ■
チョウシネンシス変異株 N o . 1 ND ND ND プレビバチノレス ■
チョウシネンシス変異株] ST o . 2 ND ND ND ブレビバチ /レス - チョウシネンシス変異株 N o . 3 ND ND ND プレビバチノレス .
チョゥシネンシス変異株 N o . 4 ND ND ND ブレビバチルス ·
チョウシネンシス変異株 N o · 5 ND ND ND
ND： 測定不能 （1分未満） 表 2に示すとおり、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31については、 各温度域での菌体の D値を求めることができた。しかしながら、プレビバチルス - チョゥシネンシス変異株 N o. 1〜N o . 5については、■各温度域での試験開始 後、 1分間以内に全ての菌株が死滅したため、 いずれの温度域でも菌体の D値を 求めることができなかった。 この結果は、 ブレビバチノレス ·チヨゥシネンシス変 異株 No. l~No. 5は、.いずれも、 胞子体を形成しなかったためであると考 えちれる。 ―
以上に示した 80 °C、 10分間の恒温試験及び D値の測定試験の結果により、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス変異株 N o. l〜No. 5は、 胞子形成能を 有さず、 また、 60 °Cに 1分間置くことで完全に死滅することが確認された。 実施例 4 ,
(変異株 No. l〜No. 5を宿主に用いた組換えタンパク質 （hEGF) の生 産）
更に、 ブレビ チルス .チョウシネンシス変異株 No. l〜No. 5について 組換え hEGFの生産を行うことにより組換えタンパク質の生産性の評価を行つ た。 その手順と結果を以下に示す。 対照にはプレビバチ ス 'チョウシネンシス HPD 31を用レヽた。
プレビバチルス■チョウシネンシス HPD 3 1及び変異株 Ν ο. 1〜Ν ο . 5 のそれぞれを、 ヒ ト上皮細胞成長因子 （hEGF) を発現するプラスミドベクタ 一 ρΗΤ Ι Ι Ο - EGF (特開平 6— 133782) をエレク トロポレーション 法により導入することで形質転換した。 次いで、 それぞれの菌株の形質転換体を 2 SL液体培地 （ペプトン 4 %、 酵母エキス 0. 5%、 グルコース 2%、 pH7. 2) 3m 1を用いて 30°Cで 60時間振とう培養した。 変異株 No. 4 と N o , 5については形質転換体を得ることができなかった。
培養終了後、 培養液を遠心分離し、 上清画分を蒸留水によって 10倍に希釈し た後、 HP LC分析に供した。 得られたピーク面積から培養液中に分泌生産され た組換え hEGFの量を算出した。 その結果を表 3に示す。 なお、 表 3では、 ブ レビバチルス ·チヨ シネンシス HPD 31での h EGFの生産量を 100%と して換算した値を示した。
(表 3) 宿主菌株 hEGF相対生産量 （％) ブレビバチルス ' ■チヨゥシネンシス HPD 31 10 0 ブレビバチノレス ■チヨゥシネンシス変異株 N o. 1 11 9 プ、レビバチルス •チヨゥシネンシス変異株 N o. 2 4 0 ブレビバチノレス •チヨゥシネンシス変異株 No. 3 2 0 上記の表 3が示すように、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス変異株 No.1を 宿主に用いた場合の h EG Fの生産量は、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス H PD 31を多少上回っていた。 また、 その生育や形質転換効率も HP D 31と同 等であった。
上記変異株 N o . 1をブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— SP 1 (BrevibacUl s choshinensis HPD31-SPl) と命名した。 実施例 5 , (プレビバチルス ·チョウシネンシス HP D 31— S P 1の変異遺伝子の同定） また、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31—SP 1のゲノム上で変 異を受けた遺伝子の同定を行った。 変異を受けた遺伝子の同定は、 ブレビバチル ス ·チヨゥシネンシス HPD 31のゲノムライブラリ一を作製し、 このライブラ リ一の各々を S P 1に導入し月包子形成能が復活した菌株を選抜することにより行 つた。
ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31のゲノムライブラリ一は以下の 手順により作製した。 まず、 培地で 1 5時間培養したブレビバチルス■チョ ゥシネンシス HPD31か タソム DNAを調製し、 次いで、 制限酵素 S a u 3 A Iによってゲノム DN Aを音分的に処理し、 -ゲノム DN Aの断片を得た。 得ら れたゲノム DNAの断片と制 RS酵素 B amH Iで処理したプラスミドベクター p NY301とでライゲーション反応を行い、 ゲノムライブラリープラスミド DN 一 Aを作製した。 更に、 これらのゲノムライプラリープラスミド DNAをエレク ト 口ポレーシヨン法によりブレビバチルス ■チヨゥシネンシス HPD31— SP 1 に導入した。 ，
次いで、 このゲノムライブラリープラスミド DNAを導入したブレビバチル ス ·チョウシネンシス HPD31— SP 1の形質転換体を（抗生物質を含まな 、） T M液体培地で 30 °Cで 1時間培養し、 更に、 ネオマイシンを含む T M液体培地 で 30°Cで 3日間培養した。 培養終了後、 80°Cで 10分間加熱処理を行い、 更 に、 TM寒天培地に塗抹し 30 °Cで 30間培養した。 この培養によりコロニーを 形成した菌株を胞子形成能が復活した菌株として選択した。
その結果、 胞子形成能が復活した菌株が 8株得られた。 次いで、 これらの 8株 力 先に導入したプラスミド DN Aを抽出し、 その DN A配列を決定した。 その 結果、 8株の内、 3株において新規な遺伝子がコードされた共通の翻訳枠が存在 することが明らかになった。 この結果から、 変異株プレビバチルス -チョウシネ ンシス HPD31— SP 1は、 変異剤処理によってこの遺伝子が不活化されて胞 子形成能が失われたと推定した。 この共通の翻訳枠にコードされた新規な遺伝子 を h o . sと命名した。 また、 その DNA配列を配列番号 1 (図 7、 図 8の上段） に示した。
更に、 ブレビバチ /レス ·チヨゥシネンシス HPD 31を親株に h o s遺伝子の 不活化株を作製し、 h o s遺伝子の不活化によりブレビバチルス ·チヨゥシネン シスの胞子形成能が头われることを確認した。
h o s遺伝子不活化株の作製は、 公知の相同組換えに準じた方法により行った。 以下に、 その具体的手順を示す。
まず h o s遺伝子不活化用ベクターの構築を行った。 プライマー Ho s P 1 及び Ho s P 2を用いた PC Rにより h o s遺伝子の上流部分の DNA断片（1. 5 k b p ：上流側に K p n I , 下流側に B a mH I認識配列を導入） を増幅し、 更に、 この PCRで增幅した.1. 5 k b pの DNA断片を制限酵素 Kp η I及び B a mH Iで処理し DNA断片を回収した。 また、 プライマー Ho s P 3及び Ho s P4を用いた PCRにより h o s遺伝子の下流部分の約 1. 5 k b pの DNA断片 （上流側に P s t I， 下流側に Xb a I認識配列を導入） を増幅した 後、 この約 1. 5 k b pの DNA断片を制限酵素 P s t I及ぴ X b a Iで処理し DN A断片を回収した。また更に、ネオマイシン耐性遺伝子を含み F R T配列 (G e n e， 212, 77 -86 (1998) ) を両側に持つ D N A断片 （ 1. 4 k b p) を制限酵素 B a mH I及ぴ P s t Iで処理し DNA断片を回収した。
また、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシスで複製不可能なベクターである p B
1 u e s c r i p tR Π SK+ (東洋紡績株式会社） の S a c I認識配列に 同制限酵素により切り出されたェリス口マイシン耐性遺伝子を含む D N A断片を 揷入した。 次いで、 このプラスミド DNAの Kp n I/Xb a I制限酵素切断部 位に、 上述の 3つの DNA断片を同時に導入することにより、 ho s遺伝子不活 化用ベクターを構築した。 以上により構築した h o s遺伝子不活化用ベクターを pB l u e-h o s : ： Nmrとした。また、上記で使用したプライマー Ho s P
1、 Ho s P 2、 Ho s P 3及び Ho s P 4の塩基配列を、 それぞれ、 配 列番号 7、 8、 9、 1 0に示し、 これらをまとめて図 14に示した。
次いで、 この h o s遺伝子不活化用ベクター： B 1 e - h o s ： ： Nmrを エレクトロポレーション法によりブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 に導入し、 ネオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。 更に、 得られたネ ォマイシン耐性を示す株を、 エリス口マイシンを含む T M寒天培地に塗抹し、 3
0 °Cで 2曰間培養し、エリスロマイシンに対する感受性を指標に菌株を選抜した。 選抜した菌株の h o s遺伝子不活ィ匕の確認は、 P C Rとゲノミックサザン解析よ り行った。 更に、 下記の実施例 7に記載の手順に従って h o s遺伝子不活化株か らネオマイシン耐性遺伝子の削除を行い、 ブレビバチルス ,チヨゥシネンシスの h o s遺伝子不活化株を得た。
次いで、 この h o s遺伝子不活化株について実施例 2、 · 3の手順に従って胞子 形成能の評価試験を行い、 胞子形成能を有していないことを確認した。
また更に、 この h o s遺伝子不活化株について実施例 4の手順に従って組換え タンパク質の生産性評価試 を行！/、、 hEGFの生産性がブレビバチルス ·チョ ゥシネンシス HPD3 1— SP 1と同等である-ことを確認、した。
以上の試験結果により、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31— S P
1は、 変異剤処理により h o s遺伝子に変異が生じたため h o s遺伝子が不活化 しており、 その結果、 胞子形成能が失われたと結論した。
細胞内主要タンパク質分解鮮素遺伝子が不活化されたプレビバチルス 'チョウ シネンシスの作製 , 実施例 6
(細胞内主要タンパク質分角 酵素遺伝子 i nipのクローユング)
(6— 1) impのクローニング
不活化対象となるタンパク質分解酵素を特定するため、 ブレビバチルス ·チョ ゥシネン ス HPD31 (F ERM B P— 1087) の細胞内主要タンパク質 分解酵素遺伝子のクローニングを行つた。
実施例 5に記載の手順に従つて構築したブレビバチルス 'チョウシネンシス H PD 31のゲノムライブラリ一プラスミド DN Aによって、 ブレビバチルス ·チ ョゥシネンシス H P D 31を形質転換し、 更に、 これらの形質転換体を 1 %スキ ムミルクと終濃度 50 μ gZm 1のネオマイシンを含む TM寒天培地に塗抹し、 30でで 4日間培養した。 培養終了後、 スキムミノレクの分解を示すハローを形成 した株 選抜した。
更に、 上記で得た株からプラスミド DNAを抽出し、 DNA配列分析を行った。 その結果、 プレビバチルス · チョウシネンシス HPD 31ゲノム由来の 3. 6 k b pの DNA断片中に約 1. 4 k b pの翻訳枠 (ORF) 、 また、 その DNA断 片の相補配列に約 0. 7 k b pの OR Fが存在していた。 この約 3. 6 kb pの DNA断片が含まれるプラスミ ドを pNY— im と命名した。
上記の 3. 6 k b pの D TA断片中に含まれるふたつの ORFの内、 約 1. 4 k b pの ORFのみを含むプラスミ ドと約 0. 7 k b pの ORFのみを含むブラ スミドを作製し、 それぞれのプラスミドにより、 ブレビバチルス ·チヨゥシネン シス H P D 31の形質転換を行つた。
更に、 それぞれの形質転換.体を、 1 %スキムミルクを含む TM寒天培地で培養 したところ、 約 1. 4 k b pの O R Fのみを有するプラスミ ドを含む形質転換体 のみが TM寒天培地上でハローを形成したため、 この約 1. 4 13 の01¾ に タンパク質分解酵素がコードされていることが明らかになった。 この約 1. 4 k b pの ORFにコードされたタンパク質分解酵素を細胞内主要タンパク質分解酵 素 （intracellular major protease) 、 略して I M Pと命名した。 I M Pと他の公 知のタンパク質との間でァミノ酸配列の相同性検索を行ったが、 有意な相同性を 有するタンパク質は発見されなかった。
このブレビバチノレス .チヨゥシネンシス HP D 31株由来の細胞内主要タンパ ク質分解酵素遺伝子 i m pの D N A塩基配列を配列番号 5 (図 12〜 1 3の上 段） に示し、 その DNA配列に対応する細胞内主要タンパク質分解酵素 IMPの ァミノ酸配列を配列番号 6 (図 12〜 13の下段） に示す。
(6-2). i mp遺伝子の発現及び IMPタンパク質の精製
次いで、 I MPの性質の詳細を明らかにするために i mp遺伝子の発現及び I MPタンパク質の精製を行った。
まず、 生産された IMPタンパク質の精製を容易にする目的で IMPの C末端 に 8つのヒスチジンからなるぺプチドタグ (ヒスチジンタグ) を付加したポリべ プチドを発現するプラスミドベクター pNY— i mp— H i sを構築した。 プラ スミドベクター p NY— i mp -H i sの構築は以下の手順により行った。 まず、 センスプライマー i mp P 1とアンチセンスプライマー i mp P 2 を用いて pNY— i mpプラスミド DNAを铸型とする PCRを行った。 なお、 センスプライマー imp P Iは、 I MPの N末端と推定されるアミノ酸配列を コードする DNA配列と相同なプライマーである。 また、 アンチセンスプライマ 一 i mp P 2は、 ヒスチジンタグをコードするため g t gを 8回繰り返した D NA配列を付加し、 更に、 ストップコドンと制限酵素 E c o R I認識配列を導入 したプライマーである。 このセンスプライマー i mp P Iの塩基配列を配列番 号 11に示し、 ァンチセンスプライマー i m p P 2の塩基配列を配列番号 12 に示し、 そして更に、 これらをまとめて図 15に示した。
この PCRにより増幅されたヒスチジンタグをコードする配列と i mp遺伝子 を含む DNA断片を精製後、，制限酵素 X h o Iと E c o R Iで処理し約 500 b pの DNA断片を得た。 次いで、 この DNA断-片をプラスミ ド pNY— i mpの Xh o I/E c o R I制限酵素切断部位に揷入し、 プラスミドベクター p NY- i m r>— H i s 得 。 次いで、 上記で得たプラスミド、ベクター: NY— i mp— H i sによりブレビ バチルス ·チヨゥシネンシス H PD 3 1を形質転換し、 得られた形質転換体を 6 00 m 1の TM液体培地で 30 ° ( 、 48時間振とう培養した。 培養終了後、 60 00 X gの遠心分離によつて菌体を回収し、 30m lの洗浄緩衝液 ( 20 mMリ ン酸、 pH7. 4、 2M KC 1 ) に懸濁し、 再度 6000 X gの遠心分離によ つて菌体を回収した。 この洗浄操作を 2回繰り返した後、 0. 2mgZm lのリ ゾチームと 10単位の D N a s eを含む 30 mMの溶菌緩衝液（ 20 mMリン酸、 pH7. 4) に菌体を懸濁し、 3 7 °Cの恒温に 20分間置いた。 次いで、 超音波 処理によ て菌体を破碎し、 3 4000 X gで 30分間遠心し、 上清を細胞内画 分として回収した。 細胞内画分 3 Om lを 0. 22 μπιのフィルターによって濾 過した後、 終濃度 0. 51V^N a C 1と 1 0 mMイミダゾールを添加し、 1m l のニッケルキレートカラム （アマシャムフアルマシア社） に供した。 1 0- 50 0 mMィミダゾールの直線濃度勾配によってニッケルキレートカラムに吸着した IMPタンパク質を溶出し分取した。 Qu a n t i C l e a v e (登録商標） P r o t e a s e As s a y i t ^P i e r c e B i o t e c h n o l o g y, I n c. ) によって分画された溶出液のプロテアーゼ活性を測定し I MP活性画 分を同定した。 更に、 活性画分 5 1を SD S— PAGEに供し IMPタンパク 質が電気泳動上で単一にまで精製されていることを確認、した。
(6-3) IMPの性質
IMP 10 μ gを含む 11VI Pの精製酵素標品をァクリルァミド 10 %濃度の SDS— PAGEによって分離した後、 セミドライ式タンパク質転写装置によつ てタンパク質を PVDF膜に車云写し、 0. 0 1% CBB (クマシープリリアン トブルー) と 40 %メタノ一ノレからなる染色液で IMPのタンパク質パンドを検 出した。 次いで、 CBBを含まない 40%メタノール液で P VDF膜を脱色した 後、 膜を乾燥させた。 次いで、 膜から IMPのタンパク質バンドを切り出し、 そ の N末端アミノ酸配列分析を.行い、 その N末端配列が Me t As nH i s P r o A s pであることを確認した。 以上により、 IMPは 453アミノ酸残基からな る推定分子量 49, 8 1 1 D aの細胞内タンパク質分解酵素であることが判明し 次いで、 Qu a n t i C l e a v e (登録商標） P r o t e a s e As s a y K i t (P i e r c e B i o t e c hn o l o g y, I n c. ) を用いて、 精製 I MPの酵素化学的性質を詳細に検討した。 基質であるスクシニル化カゼィ ン 2mgを l OOmM ホウ酸緩衝液 （pH8. 0) 65 μ 1に溶解した酵素 反応溶液に、 I MPを 1. 5 /X g含む精製酵素標品 10 μ 1を加え 37 °Cの恒温 に 20分間置いた。 次いで、 発色液 25 μ 1を添加し、 20分間、 室温で放置し た。 発色後、 450 nmの吸光度を測定することにより、 IMPのタンパク質分 解活性を定量した。 このタンパク質分解活性の定量において 30°C、 60分間の 反応により 45 Onxnの吸光度を 0. 1上昇させる酵素量を 1単位とし、 反応に 用いた酵素タンパク質量は B S Aを標準として B r a d f o r d法により定量し た。
以上の結果により、 IMPの至適温度は 30 °C、 至適 p Hは 8. 0、 比活性は 44. 7 un i t s Zm g p r o t e i nであり、 また IMPはlmM以上 の EDTAにより活' ½が阻害されることが明らかになつた。 実施例 7
(細胞内主要タンパク質分角?酵素遺伝子 i mpが不活化されたブレビバチルス · チョウシネンシスの作製)
次いで、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31 - S P 1を親株に i m p遺伝子が不活化されたブレビバチルス■チヨゥシネンシスの作製を行つた。 i m 遺伝子が不活化されたブレビバチルス 'チョウシネンシスの作製は相同組み 換えによる遺伝子の不活化法に準じた方法を用いた。 具体的には、 以下の手順に より行った。
まず、 ί mp遺伝子不活化用ベクターの構築を行った。 制限酵素 E c o R Vに よって i mp遺伝子の内部領域である 1 k b pの DNA断片を切り出し、 プラス ミドベクター p B 1 u e s c r i p t R II SK+ (東洋紡績株式会社） の Sm a I/E c oRV制限酵素切断部位に挿入しだ。 次いで、 制限酵素 P s t Iで処 理することによって i mp遺伝子内部の 120 b pの領域を除去し、 ネオマイシ ン H1生遺伝子を含み F R T配列を両端に持つ D N A断片を P s t I制限酵素切断 部位に揷入することにより、 i 遺伝子を分断した。 更に、 このプラスミ ドの B a mH I制限酵素切断部位に同制限酵素によって切り出されたエリスロマイシ ン耐性遺伝子を含む D N A断片を揷入することにより、 i mp遺伝子不活化用べ クタ一を構築した。 以上により構築した i mp遺伝子不活化用ベクターを p B 1 u e— i m ： ： Nmrとした。
次いで、 この i mp遺伝子不活化用ベクター p B 1 u e— i mp ： ： Nmr 1 μ gをエレク トロポレーショ ン法によりブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 3 1 -S P 1に導入し、 ネオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。 得 られたネオマイシン耐性を示す菌株を終濃度 1 μ g Zm 1のエリス口マイシンを 含む TM寒天培地 （ペプトン 1 %、 肉エキス 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 グルコース 1 %、 寒天 1. 5%、 p H7. 0) に塗抹し、 30°C、 2日間培 養し、 i mp遺伝子の上流敏と下流域の 2箇所の遺伝子座で相同組み換え反応を 起こした株 (ダブノレクロスオーバー株) をエリス口マイシンに対する感受性を指 標に選抜した。 更に、 選抜した菌株に対して PCRとゲノミックサザン解析を行 い i mp遺伝子が不活化されている事を確認した。
次いで、 上記で構築した i m p遺伝子不活化株のゲノムからネオマイシン耐性 遺伝子の削除を行つた。 i mp遺伝子不活化株からネオマイシン耐性遺伝子を削 除するために、 まず、 酵母由来の F 1 p リコンビナーゼ遺伝子とブレオマイシ ン耐性遺伝子を有するネオマイシン耐性遺伝子削除用プラスミドベクターを以下 の方法により構築した。
まず、 ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、 ブレビバ チルス ·チヨゥシネンシスの菌体から容易に脱落するプラスミ ドベクターを得る ために、 p NY 3 0 1プラスミドベクター （特開平 1 0— 2 9 5 3 7 8) に対し てヒドロキシルァミンによる薬剤処理を行い、 その変異体を得ることにした。 具 体的には、 以下のようにして行った。
pNY 30 1プラスミ ドべ.クタ一 DNA 1. 5 μ gを、 ヒ ドロキシルァミン 3 5 0mgと N a OH90mgを氷冷した滅菌蒸留水 5 m 1に溶解した溶液（ 1 00 /z 1 ) に溶解し、 70°Cの恒温に 1 2 0分間おいた後、 プラスミド DNAを エタノール沈澱により濃縮、 乾燥させた。 更に、 このプラスミ ド DNAを滅菌蒸 留水に溶解し、 100 n g相当の該プラスミド DNAにより、 ブレビバチルス■ チヨゥシネンシス HPD 31を形質転換し、.ネオマイシン耐性を指標に形質転換 体を選抜した。 生育速度が遅くコロニーサイズが小さい形質転換体から得られた プラスミド DNAは、 元の ρ ΓΥ301プラスミドベクター DN Aに比べ 1細胞 あたりのコピー数が数十分の 1に低下しており、 かつ、 ネオマイシンを含まない 培地を用いて培養を行った場合には、 菌体から容易に脱落した。
このプラスミド DNAを鑤型に E c oR Iと P s t I認識配列を付カ卩したセン スプライマー f 1 P P I (酉己列番号 13 :図 16) と B amHI認識配列を付 加したアンチセンスプライマー f 1 p P 2 (配列番号 14 :図 17) を用いて PCRを行い、 r e p遺伝子を含む約 1. 6 k b pの DN A断片を増幅した。 更 に、約 1. 6 k b pの DNA断片を制限酵素 E c o R Iと B a mH Iで処理した。 また、 ブレオマイシン ft性遣伝子を有する P NH 300プラスミ ド （Yasuhiro, Shiga et al, Applied and Environmental Microbiology, 58， 525-531 (1992)) を錄 型に B g 1 Π認識配列を付加したセンスプライマー f 1 p P 3 (配列番号 1 5、 図 18) と E c oR Iと Xb a I認識配列を付加したアンチセンスプライマ 一 f l.p P 4 (配列番号 16、 図 19) によって PCRを行いブレオマイシン 耐性遺伝子とプラスミド O r iを含む約 1. 1 k b pの D N A断片を増幅した。 更に、 1. 1 k b pの DNA断片を制限酵素 E c oR Iと B g 1Πで処理し、 上記で得た約 1. 61^ 1) と約1. 1 k b pの両 DNA断片を結合させることに より新たなプラスミドを作製した。 このプラスミドを pNY_Mu t -B 1 eと した。
また、 酵母由来の 2— / /inプラスミドを铸型に、 Nc o I認識配列を付加した センスプライマー f 1 p P 5 (配列番号 1 7 :図20) と 110 1認識配列を 付加したアンチセンスプライマー f 1 P 6 (配列番号 18 ：図 21) を用い て PCRを行い、 F 1 pリコンビナーゼ遺伝子を含む領域を増幅した。 次いで、 この PCRにより得た F 1 Rリコンビナーゼ遺伝子を含む DN A断片を Nc o I と' X h o Iで処理した後、 p NY 301ベタダ一の N c o I /X h o I制限酵素 切断部位に挿入することにより F l pリコンビナーゼ遺伝子を含むベクターを得 た。 このベクターを PNY3 O 1 _F 1 r>とした。 次いで、 この pNY3 01— F 1 pを錄型に Xb a I認識配列を付カ卩したセン スプライマー f 1 P P 7 (配列番号 19 :.図 22) と P s t I認識配列を付カロ したアンチセンスプライマー f 1 P 8 (配列番号 20 ：図 23) を用いて P CRを行い、 F 1 pリコンビナーゼ遺伝子及び pNY 301由来のプロモーター 領域を含む約 1. 6 k b pの DNA断片を増幅した。 更に、 この約 1. 6 k b p の DNA断片を制限酵素 Xb a Iと P s t Iで処理した後、 上記で得た pNY— Mu t-B 1 eの Xb a I /P s t I制限酵素切断部位に揷入することによりネ ォマイシン耐性遺伝子削除用べクタ一を構築した。 このネオマイシン耐性遺伝子 削除用ベクターを pNY— Mu t— B 1 e— F 1 pとした。 この pNY— Mu t — B l e— F l pは、 F l pリコンビナーゼ遺伝子を発現し、 かつ、 ネオマイシ ンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、 ブレビバチルス ·チョウシネ ンシスの菌体から容易に脱蔡するプラスミドベクターである。
次いで、 このネオマイシン而村生遺伝子削除用ベクター pNY— Mu t -B 1 e — F 1 pをエレクトロポレーシヨン法により i mp遺伝子不活化株に導入し、 ブ レオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。 次いで、 この形質転換体を、 ブレオマイシンを含まない TM液体培地で振とう培養し、 更に、 TM寒天培地で 培養した。 TM寒天培地上にコロニーが得られた菌株からネオマイシンとブレオ マイシンに対して感受性を示す菌株を選抜した。
以上により、 ネオマイシン耐性遺伝子が削除され、 かつ、 ネオマイシン耐性遺 伝子削除用ベクター pNY— Mu t— B 1 e— F 1 pが脱落した、 目的とするブ レビバチルス ·チヨゥシネンシスの i mp遺伝子不活化株を得た。 このゲノム上 の細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i mpが不活化されたブレビバチルス · チヨゥシネンシスをブレビバチノレス ·チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 2
(Brevibacillus choshinensis HPD31-SP2) と命名した。
(細胞内と細胞外の主要タンパク質分解酵素遺伝子が不活化されたブレビバチル ス■チヨゥシネンシスの作製）
次いで、 上記で得た i mp遺伝子が不活化されたブレビバチルス■チヨゥシネ ンシス HP D 31-SP 2に対して細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活 化を行った。 そのために、 まず、 細胞外主要タンパク質分解酵素の単離、 及び、 同遺伝子のクローニングを行った。 実施例 8 ,
(細胞外主要タンパク質分解酵素 (E x t r a c e l l u l a r Ma j o r P r o t e a s e , EMPと略記） 遺伝子のクローエング）
(8- 1) 細胞外主要タンパク質分解酵素 （EMP) の精製
プレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 3 1 (FERM BP— 1 087) を 5 Lの TM液体培地で 24時間培養し、 培養終了後、 培養上清液を遠心分離に より分画し、 終濃度 50mMの トリス塩酸 (pH7. 5) を添加した後、 DEA E陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、 0-0. 6M N a C 1の直 線濃度勾配により EMPを溶出した。
EMP含有画分を 5 OmMト リス塩酸 （pH7. 5) の緩衝液に対して透析し た後、 へパリンカラムに供し、 0— 0. 5Mの Na C 1の直線濃度勾配により溶 出し、 EMP精製酵素標品とした。 また、 各溶出画分の酵素活性測定は、 An a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y, 102， 1 96-202 (1 9 80) の方法に準じたゼラチン一 PAGEにより行った。
(8-2) EMPのアミノ酸配列分析
8-2- 1 N末端ァミノ酸配列分析
EMP精製酵素標品 10 μ gをアクリルアミド 1 0 %濃度の SDS— PAGE によって分離した後、 セミドライ式タンパク質転写装置によってタンパク質を P VDF膜に転写し、 0. 0 1% CBBと 40%メタノールからなる染色液で E MPのタンパク質バンドを検出した。 CBBを含まない 40%メタノール液で脱 色した後、 膜を乾燥させ、 タンパク質バンドを含む膜を切り出し、 AB Iプロテ ィンシーケンサー m o d e 1 49 2により N末端ァミノ酸配列分析を行った。 このアミノ酸配列分析により、 A l a S e r Ly s Ar gVa 1 H i s Th r A s pAs nL e uVa 1 I 1 e A 1 a L e u V a l G l u P h eAs nAs p L e uG 1 uG 1 yA s nG 1 nの 24アミノ瞧基からなる N末端のアミノ酸配 列を決定した。
8-2-2 内部部分ァミノ酸配列分析 EMP精製酵素標品 50 μ gをアクリルアミド 10 %濃度の SDS— PAGE によって分離した後、 EMPのタンパク質バンドを含むゲル片を切り出し、更に、 current protocols ια protein science, 11.3 digestion of proteins in gel tor sequence analysis, John Wiley & Sons, 1995の方法に従い、 EM Pをトリプシン
1 gによりゲル内酵素処理を行いゲル内で限定分解した。 次いで、 トリプシン 処理をした EMPのぺプチド断片をァセトニトリル溶液で回収した後、 マイティ シノレアクァ PR 18逆相カラムクロマトグラフィー（関東化学株式会社）に供し、 0. 05%TFAを含むァセトニトリノレ 0— 60%の直線濃度勾配によって EM Pのペプチド断片を、溶出分離した。 更に溶出分離した EMPのペプチド断片を乾 固した後、 AB Iプロテインシーケンサー mo d e l 492によりペプチド断 片のひとつについてァミノ酸配列分析を行つた。 このアミノ酸配列分析により、 I 1 e Ph eG l n Th r G l nP r oTh r G l yPh eAs pの 10ァミノ 酸残基からなる内部部分ァミノ酸配列を決定した。
(8-3) emp遺伝子のクローニング及び同定
次いで、 上記で得た EMPの内部部分アミノ酸配列データを基に、 2種のオリ ゴヌクレオチドプライマー em p ? 1及び6111 P 2を設計、 合成した。 e mp P Iの塩基配列を配列番号 21に、 emp P 2の塩基配列を配列番号 2 2にそれぞれ示す。 また、 e m p P I及び e m p P 2の塩基配列、 並びに、 emp P I及び emp P 2の塩基配列に対応するアミノ酸配列を図 24にま とめて示す。 なお、 配列番号 21の配列における左から 6番目の n及び配列番号 22の配列における左から 6番目の nは、 イノシンである。
これらのプライマー emp P I及び emp P 2を用いて、 ブレビバチルス - チヨゥシネンシス H PD 31のゲノム D N Aを铸型とする P C Rを行い、 約 70 0 b pの DNA断片を増幅した。 更に、 この約 700 b pの DNA断片を pUC 118ベクター （東洋紡績株式会社） の H i n c II認識配列にサブクローニン グし DNA配列分析を行い、 この約 700 b pの DN A断片が emp遺伝子の一 部を含んで 、ることを確認、した。 - 更に、 この約 70 0 b の DNA断片の上流域及ぴ下流域の DNA断片をク口 一ユングするために、 上記で得た約 700 b の DNA断片の DNA配列データ を基に下に示す 2種類の特異的ブラィマー、 上流域の増幅用にァンチセンスブラ イマ一 e in p P 3、 下流域の: tiili畐用にセンスプライマー emp P 4を設計、 合成した。 ，
また、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31のゲノム DNAを E c o RV等の制限酵素によって断片ィ匕し、 更に、 これらの DNA断片の末端にァダプ ター DN Aを付加することによ りブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD31 のアダプターゲノム D N Aライブラリーを作製した。
アンチセンスプライマー em ρ P 3、 センスプライマー emp P 4、 ァダ プター Aの塩基配列を、それぞれ、配列番号 23、 24、 25に示す。 また、 これらをまとめて図 25に示す。
次いで、 このブレビバチルス ■チョウシネンシス HPD 31ゲノムのアダプタ 一 DN Aライブラリーを錡型に用いて PC Rを行い、 emp遺伝子全長を含む D NA断片を増幅した。 更に、得られた PC R増幅産物のダイレクトシーケンスに より e m p遺伝子の D N A配歹ばを決定した。
このブレビバチルス ■チヨクシネンシス HPD 31株由来の細胞外主要タンパ ク質分解酵素遺伝子 e m pの D N A配列を配列番号 3 (図 9〜 1 1の上段） に示 す。 また、 その DN A配列に对応する細胞外主要タンパク質分解酵素 EMPのァ ミノ酸配列を配列番号 4 (図 9〜： L 1の下段） に示す。
(8-4) EMPの性状
細胞外主要タンパク質分解酵素 EMPは、 プレプロ構造として 754アミノ酸 残基からなる分子量約 84 kE> aの酸性タンパク質であり、 細胞外に分泌される 際に N末端 1.24アミノ酸残基が切断され、 630アミノ酸残基からなる分子量 約 71 kD aの構造体へと成熟すると推定した。 成熟体の N末端から 207番目 には Z i n cメタ口タンパク質分解酵素の亜鉛イオンの配位に関与するとされる HE XXH配列が存在することから、 EMPは Z i n cメタ口タンパク質分解酵 素であると推定した。
ΕΜΡίま C l o s t r i d i um a c e t o b u t y l i c umのメタロタ ンパク質分解酵素とアミノ酸レベルで 37 %の相同性を有していた。 実施例 9
( i mp遺伝子と emp遺伝子が不活化されたブレビバチルス■チヨゥシネンシ ス菌株の作製） ,
次いで、 実施例 7で得たブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31— S P 2を親株に e nip遺伝子の不活化を行い、 2種のタンパク質分解酵素 i mpと e mp遺伝子が不活化されたブレビバチルス ·チヨゥシネンシス菌株を作製した。 emp遺伝子が不活化されたブレビバチルス■チョウシネンシス菌株の作製は、 相同組み換えによる遺伝子の不活化法に準じて行つた。
まず、 e m p遺伝子不活化用べクタ一の構築を行った。 上記の実施例 8— 3に 記載の e m p P 4プライマー （配列番号 24) とァダプタ一プライマー （配列 番号 25) をプライマーに、 そして、 プレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31のアダプターゲノム DNAライブラリーを铸型に用いて PC Rを行い、 em p遺伝子を部分的に含む約 2. 2 k b pの DNA断片を増幅した。
次いで、 この PC Rにより増幅された約 2. 2 k b pの DNA断片を pUC 1 18の H i n ell制限酵素切断部位に揷入した。 次いで、 揷入した DN A断片 の近僚にある B a mH I認識配列に同制限酵素により切り出されたェリス口マイ シン耐性遺伝子を含む DN A断片を挿入した。 更に、 制限酵素 H i n d IIIと P s t Iで e mp遺伝子内咅 の 220 b pを除去後、このプラスミドの H i n d III /P s t I制限酵素切断部位にネオマイシン耐性遺伝子を含み FRT配列を両側 に持つ D N A断片を挿入することにより emp遺伝子不活化用べクタ一を構築し た。 この emp遺伝子不活化用ベクターを p B 1 u e— emp ： ： Nmrとした。 次いで、 この emp遺伝子不活化用ベクター： B 1 u e— emp ： ： Nmrを 用いてプレビバチルス 'チヨゥシネンシス HPD31 -S P 2の emp遺伝子の 不活化を行った。 pB l u e - emp ： ： Nmrを用いた e m p遺伝子の不活化、 及び、 emp遺伝子不活ィ匕株ゲノム上のネオマイシン耐性遺伝子の除去は、 上記 実施例 7に記載の i m 遺 子不活化株の構築と同様の手順により行つた。
上記により得た i m p遣伝子及ぴ emp遺 ί云子が不活化されたブレビバチル ス -チョウシネンシス菌株をブレビバチノレス■チヨゥシネンシス HPD 31 -S Ρ 3 (B r e v i b a c i 1 1 u s c h o s h i n e n s i s HPD31— S P 3) と命名し、 FERM BP—08479として国際寄託した。
(ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31-SP3が胞子形成能を有しないこ との確認） ' 実施例 10
(耐熱性試験）
以上により得たブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31— SP 3が胞子 形成能を有していなレ、ことを確認するため、 実施例 2と同様の方法により菌体の 耐熱性試験を行つた。 試験の対照にはブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31を用いた。 その結果を.表 4に示す。
(表 4) 生 菌 数
80 °C加温前 80 °C加温後 ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HPD 3 1 7. 6 X 107 1. 9 X 10 ブレビバチノレス ·
チヨゥシネンシス HP D 3 1一 S P 3 2. 1 X 107 0 ブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31は、 80 °C、 10分間の加温に より全菌数の約 3 Z 4が死滅するのに対し、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD31-SP3は同条件によって完全に死滅する。 つまり耐熱性胞子を形成 しないことが示された。 実施例 11 - (D値の測定）
更に、 ブレビバチノレス ·チヨゥシネンシス HPD 31一 S P 3の胞子形成能を 解析するため実施例 3と同様の方法により菌体の D値の測定を行った。 試験の対 照にはブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31を用いた。 その結果を表 5 に示す。 ,
(表 5)
D値 (分間)
60°C 70°C 80°C ブレビバチルス ·
チヨゥシネンシス HPD31 330 94 67 ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HPD 31— S P 3 ND ND ND 表 5に示すとおり、 ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD 31については、 各温度域での菌体の D値を求めることができた。しかしながら、ブレビバチルス · チヨゥシネンシス HP D 3 1 -S P 3については、 各温度域での試験開台後、 1 分間以内にすべての菌体が死滅したため、 いずれの温度域でも菌体の D値を求め ることができなかった。 この結果は、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31—S P 3が胞子体を形成しなかったためであると考えられる。
以上の 80°C、 10分間の恒温試験及び D値の測定試験の結果により、 ブレビ バチルス ·チヨゥシネンシス HPD 3 l—S P 3は、 胞子形成能を有しないこと が示された。
(ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD31-SP3の細胞外のタンパク質分解 酵素活性の評価）
更に、 プレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— SP 3の細胞外のタン パク質分解活性の評価を行った。 —
まず、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31 (FERM BP—10 87) (バチルス ·ブレビス HI 02 (B a c i l l u s b r e v i s HI 0 2) (特開昭 6 3- 5 6 2 7 7) ) では分解が観察されないミルクカゼイン及 ぴ B S Aに対して、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 3 1一 S P 3が分 解性を示さないことを確認した。 実施例 1 2
(ミルクカゼィンの分解試験によるブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 3 1 -S P 3の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
5%、 2%、 .1 %のスキムミルクを含む TM寒天平板培地のそれぞれにブレビ バチルス チョウシネンシス HPD 3 1— S P 3を植菌した後、 3 7 °Cで 3日間 培養を行い、 ミルクカゼィンの分解によるコロニーの周囲のハロー形成の有無を 観察した。 その結果、 5%、 2%、 1 %のスキムミルクを含む、 それぞれの TM 寒天培地のすべてにおいてハ口一は全く形成されなかつた。
この結果により、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 3 1— S P 3は、 ミルク力ゼィンの分解性を有しないことが確認された。 実施例.1 3
(B S Aの分解試験によるブレビバチルス■チヨゥシネンシス HP D 3 1 - S P
3の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
無菌濾過した B SA (S i gma A4 5 0 3) 溶液を終濃度 3. 2mg/m 1 になるように添カ卩した TM液体培地 1 Om lにブレビバチルス ·チヨゥシネンシ ス HPD 3 1 _S P 3を接種し、 3 7°C、 2 00 r p mで振とう培養した。
培養濾液を、 培養開始後 24時間、 48時間、 7 2時間の各々の時点で採取し 、 採取した各々の培養濾液に対して 1 000 0 r pmで 5·分間遠心分離を行った 。 次いで、 遠心分離により得られた培養上清画分 6 2 5 μ 1に 0. 5Μ T r i s-HC 1 (PH6. 8) 1 2 5 μ 1 s 1 0% SD S 20 0 μ β—メル カプトエタノール 5 0 μ 1.を添加し、 撹拌後沸縢水中で 3分間熱処理を行った 。更に熱処理後、 0. 0 5 %Β Ρ Βと 70 %グリセ口ールを含む 0. 0 6 2 5 Μ Τ r i s-HC 1 (PH6. 8) 0. lm lを加え S D S_ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動 (SD S-PAGE) に供した。 なお、 SD S— PAGEは 1 0%のァ クリルアミド濃度で行なった。 タンパク質の検出は、 C B B (ク一マシプリリア ントブルー） による染色により行った。 その結果、 培養開始後 24時間、 48時 間、 72時間の全てにおいて BS Aの分解によるバンドは観察されなかった。 この結果により、 プレビノ チルス ·チョウシネンシス HPD31— SP 3は B S Aの分解性を有しないことが確認された。
更に、 ブレビバチルス .チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3の細胞外のタン パク質分解酵素活性をゼラチン一 PAGE法及びァゾカゼィン、 ァゾコールを用 V、た方法により測定した。 対照にはプレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 3 1 (FERM BP— 108 7) を用いた。 実施例 14
(ゼラチン一 PAGEによる HPD 31— S P 3の細胞外のタンパク質分解酵素 活性の評価）
ブレビバチノレス ■チヨゥシネンシス HP D 31、 ブレビバチノレス ·チヨゥシネ ンシス HPD31— SP3のそれぞれを TM液体培地で 48時間培養した後、 培 養上清画分 10 μ 1をゼラチン一PAGEに供した。 ゼラチン一PAGEは、 A n a l y t i c a l B i o c h em i s t r y 102， 196— 202 ( 1 980) の方法に従い行った。 電気泳動後のゲルを 1 OmM C a C 12を含む 50 mMトリス塩酸 （ p H 7. 5) 緩衝液中に、 37 °Cの恒温に 16時間置くこ とによりゲル内のゼラチンを分解させた。 恒温に置いた後、 0. 1 %ァミドプラ ックと 30 %メタノールと 1 0 %酢酸からなる染色液で 30分間染色し、 アミ'ド ブラックを含まない同液で脱色した。 その結果を図 2に示す。
図 2に示されているとおり、 ブレビバチルス 'チヨゥシネンシス HPD31の 培養上清画分では、 約 40 k D aの移動度にタンパク質分解活性によりゼラチン が分解されたことを示すク ァバンドが確認されたが、 ブレビバチルス ·チヨゥ シネンシス HPD31— S P.3の培養上清画分においては、 ゼラチンの分 を示 すクリアバンドは全く認められなかった。 ' 実施例 15 (ァゾカゼィンを使用した H P D 31 -S P 3の細胞外のタンパク質分解酵素活 †生の測定）
ブレビバチルス ,·チヨゥシネンシス HP D 31及びブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD 31— S P 3を T 2培地 （ペプトン 1 %、 肉エキス 0. 5 %、 酵 母エキス 0. 2%、 グルコース 1%) で、 30°C、 6日間振盪培養した。 培養液 を 10， O O O r pra 、 10分間遠心分離し、 得られた上清を活性測定用の試 料とした。 5 gのァゾカゼインを 0. 1Mの T r i s_HC l (pH8. 0) 1 Lに溶かし、 ¾質溶 ί夜とした。 次いで、 0. 1mlの上記基質溶液にこれと等量 の試料を加え、 37 °Cで 5時間反応させた後、 0. 2mlの 10%トリクロ口酢 酸溶液を加えて反応を止めた。 次いで、 室温で 20分間静置した後、 15, 00 0 r pmで 10分間遠心分離して上清画分をとり、 0. 4mlの 0. 5N N a OHを加え、 440 nmの吸光度を測定した。 以上の実験の結果を表 6に示す。 なお、 表 6では 5時 の反応で吸光度を 10変化させる酵素活性を 1 un i t とした。
(表 6) 酵 素 活 性
(iuuts/ml of culture supernatant) ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HPD 31 0. 12
ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HP D 31— S P 3 ND
ND ： 検出不可能 （0. 001以下） 上記の表 6に示されているとおり、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31-SP 3では、 了ゾカゼィン試薬を用いた活性測定でもタンパク質分解酵素 活性を検出できなかつた。 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD31— SP 3の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性はブレビバチルス ·チヨゥシネンシ ス HPD 31に比べて lZl 20以下であった。 実施例 16 ,
(ァゾコーノレを使用した HPD 31-SP 3の細胞外のタンパク質分解酵素活性 の測定）
ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31及びブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD 31— SP 3のそれぞれを TM液体培地で 48時間培養し、 培養 終了後、 培養液.を遠心、 分画して得たそれぞれの培養上清画分を C e n t r i c on l.u s -20 (B i oma x— 5) により 10倍に濃縮した。 次いで、 濃縮上清液 300 1と等量の 10 OmMトリス塩酸（pH7. 5)、 1 OmM C a C 12、 1 %ァゾコール溶液を混合し、 37 °Cの恒温で 3時間、 撹拌した。 反 応終了後、 反応液を直ちに遠心分離し、 培養上清液の 520 の吸光度を測定 することにより、 酵素活性を測定した。 その結果を表 7に示す。 なお、 37°C、 1時間の反応で 520 nmの吸光度を 0. 01上昇させる酵素量を 1 un i t とした。
(表 7) 酵 素 活 性
(units/mi of culture supernatant) ブレビバチノレス ·
チヨゥシネンシス HPD 31
ブレビパチノレス ·
チヨゥシネンシス HPD 31一 S P 3
. ND ： 検出不可能 （0. 1以下） 上記の表 7に示されているとおり、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 -SP 3では、 ァゾコール試薬を用いた活性測定でもタンパク質分解酵素活 性を検出できなかった。 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31一 S P 3 の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性はブレビバチルス 'チョウシネンシス
HPD31に比べて 1ノ 330以下であった。
以上の実施例 14から実施例 16により、 本発明のブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HP D 31- S P 3の細胞外のタンパク質分解酵素活性が、 公知の菌株 であるブレビバチルス ·チョウシネンシス HP D 31より格段に低減しているこ とが示された。
(ブレビバチルス ·チョゥシネンシス HP D 31 -S P 3の細胞内タンパク質分 解酵素活性の評価）
次いで、 本発明のブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3の細 胞内のタンパク質分角 酵素活性をゼラチン一 PAGE法及びァゾカゼィンを用い た方法により評価を行った。 なお、 対照にはブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31を用いた。 実施例 17
(未変性条件下でのゼラチン一 PAGEによるプレビバチルス 'チョウシネンシ ス HPD31— SP 3の細胞内タンパク質分解酵素活性の評価）
ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31、 ブレビバチルス 'チョウシネ ンシス HPD 31— S P 3のそれぞれを TM液体培地で、 30°Cで 48時間培養 した。 培養終了後、 遠心分離により培養液から菌体を回収した後、 超音波により 菌体を破砕し、 更に、 遠心分離を行うことで細胞内画分を得た。 そして、 この細 胞内画分を未変性条 ί4 ^下で電気泳動に供した。 未変性条件下の電気泳動は、 細胞 内画分 10 μ 1に終濃度 5 OmMトリス塩酸 （ρΗ6. 8) 、 10%グリセロー ルを加え、 0. 1%のゼラチンを含む 10%アクリルアミドゲルに供し、 SDS を含まないトリスーグリシン緩衝液で 4°C、 10 mAの定電流で 10時間泳動す ることにより行った。 .
電気泳動終了後、 5 OmMトリス塩酸 ( H 7. 5) 、 10mMCa C l 2緩 衝液中でァクリルァミ ドゲルを 37°Cの恒温に 24時間置いた後、 0. 1 %ァミ ドブラックと 30%メタノールと 10°/0酢酸からなる染色液で 30分間染色し、 アミドブラックを含まない同液で脱色した。 その結果を図 3に示す。
図 3に示されているとおり、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31の 細胞内画分では、 タンパク質分解活性によりゼラチンが分解されたことを示すク リァバンドが確認されたが、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31— S P 3の細胞内画分においては、 ゼラチンの分解を示すクリアバンドは全く認めら れなかった。 実施例 18
(ァゾカゼィンを使用したプレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31-S P 3の細胞內のタンパク質分解酵素活性の測定）
実施例 1 7と同様の方法で得たブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31 及びブレビバチ ス ·チョゥシネンシス HP D 31— S P 3、 それぞれの細胞内 画分 200 1 と酵素反応液 （10 OmM トリス塩酸 （pH7. 5) ， 0. 2% ァゾカゼィン， 1 OmM C a C 12) 400 μ 1を混和し、 37°Cの恒温に 1. 5時間置いた後、 終濃度 2. 5%の TC Aを添加することにより反応を停止させ た。 次いで、 反応液を遠心分離後、 上清液の 440 nmの吸光度を測定した。 反 応に用いた粗酵素液の総タンパク質量は、 B SAを標準とする B r a d f o r d 法により定量した。 以上の結果を表 8に示す。 なお、 37°C、 1時間の反応にお いて 440 nmの吸光度を 0. 01上昇させる酵素量を 1 u ii i tとした。
(表 8) 比活性 (umts/mg Drotein) ブレビバチノレス 'チョウシネンシス H P D 31
プレビバチノレス ■
チヨゥシネンシス HPD 3 1— S P 3 上記の表 8が示すとおり、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 31— S P 3では、 細胞内のタンパク質分解酵素活性力 ブレビバチルス ·チョゥシネン シス HPD 31に比べ約 1Z8に低下していた。
以上の実施例： L 7及び実施例 18により、'本発明のブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD3 1— SP 3の細胞内のタンパク質分解酵素活性は、 プレビバチ ルス ·チョウシネンシス HPD 31より格段に低減していることが示された。
(プレビバチルス -チヨゥシネンシス HPD 31一 SP 3による組換えタンパク 質の分泌、生産）
更に、 本発明のブレビバチルス ■チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3を宿主 に用いた組換えタンパク質の生産性及ぴ分解性の評価試験を、 まず、 組換えタン パク質が分泌生産される場合について行った。
この組換えタンパク質が分泌生産される場合の生産性及び分解性の評価試験は、 ブレビバチルス -チヨゥシネンシス HPD 3 1を宿主として分泌生産を行った場 合には、 その一部が分解されていたタンパク質の生産を行うことにより行った。 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31を宿主として分泌生産を行った 場合にその一部分が分解されていたタンパク質としては、 プタ由来 I L— 1 ;3成 熟体 （EMBL a c c e s s i o n X 74568 ) 、 大腸菌 K 12株由来マ ノレトー.ス結合タンノ ク質 （ma l t o s e b i n d i n g r o t e i n) 成熟体 (EMB L a c c e s s i o n AAB 59056) 、 ゥシ由来マク 口ファージコロエー刺激因子成熟体 （G e n BANK a c c e s s i o n N M— 174026. 1) 、 豚丹毒抗原タンパク質の一部分で豚丹毒抗原性を有す る E N 2 (特開 2000— 279179) 、 及び、 大腸菌 O 157 ： H 7株由来 のインチミン （SWI SS— PROT a c c e s s i o n P 43261) の 一部分でィンチミン抗原性を有するポリぺプチド （I n t i m i n (339-
575) ) を用レ、た。 なお対照にはブレビバチルス 'チョウシネンシス H P D 3
1を用レヽた。 実施例 1 9 .
(プレビバチルス ·チヨゥシネンシス I- IPD 31 -SP 3によるブタ I L- 1 /3 タンパク質の分泌生産）
ブタ由来 I L— 1 ]3成熟体 （EMB L a c c e s s i o n X 74568) (以下プタ I L— 1 ]3) の N末端アミノ酸残基をコードする DN A配列に Nc o I認識配列とシグナルぺプチドの一部をコードする配列を付加したセンスプライ マー （配列番号 26 ：図 26 ) と C末端ァミノ酸残基をコードする D N A配列に H i n d III認識配列を付加したアンチセンスプライマー （配列番号 27 ：図 2 7) を用いてブタ由来 I L一 1 ]3 c DNAを铸型に PCRを行った。 更に、 PC Rで増幅された DNA断片を制限酵素 N c o Iおよび H i n d IIIで処理し、 p NY 301ベクターの N c o I/H i n d III制限酵素切断部位に揷入すること によりプタ I L— 1 ;3分泌生産用べクターを構築した。 このブタ I L— 1 ]3分泌 生産用ベタターを ρΝΥ301— p I L— I j3とした。
次いで、 この pNY 301 - I L- 1 j3をエレクトロポレーシヨン法により プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31及びブレビバチルス ·チヨゥシネ ンシス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築し た。 次いで、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C 90時間 培養した。 培養終了後、 培養液を遠心、 分画して得たそれぞれの培養上清画分を
10-25 %濃度勾配のアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動終了後、 セミドライ式タンパク質転写装置によってタンパク質をニトロセルロース膜に転 写した。 7欠いで、 定法に従い、 転写膜を抗 p i g I L— 1 ]3抗体を用いたゥェ スタンプ口ット解析に供しブタ I L— 1 ]3の検出を行った。
その結果、 図 5に示されているとおり、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス H PD 31を宿主に用いた場合には、 ブタ I L— 1 ]3の分解を示す顕著なバンドが 確認されたが、 本発明のプレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31— S P 3 を宿主に用いた場合には、 ブタ I L—1 ]3の分解を示すバンドは認められなかつ また、 鼋気泳動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 ブタ I L一 1 に相当するバンドのデンシトメトリーを測定するこ とにより、 培養液中に蓄積されたブタ I L一 1 の定量を行った。 この測定の結 果を図 4及ぴ表 9に示す。 ' (表 9) 宿主菌株 培養液中のブタ I L一 1 /3の蓄積量 （m g / 1 ) プレビバチノレス ■
チヨゥシネンシス HPD31 30
プレビバチノレス - チョウシネンシス HPD 31— S P 3 80 表 9に示されているとおり、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HP D 31― S P 3を宿主に用いて生産された培養液中のブタ I L— 1 ]3の蓄積量は、 ブレビ バチノレス ·チヨゥシネンシス HPD31 -S 5を宿主に用いた場合に比べ約 2. 5倍以上に増加していた。 実施例 20
(ブレビバチルス ■チヨゥシネンシス HPD 31—SP 3による大腸菌 MB Pの 分泌生産）
大月昜菌 K12株由来マルトース結合タンパク質 （ma l t o s e b i n d i n g r o t e i n (MB P) ) 成熟体 (EMB L a c c e s s i o n A AB 59056) (以下大腸菌 MBP) の N末端アミノ酸残基をコードする DN A酉己歹 IJに P s t I認識配列を付カ卩したセンスプライマー（配列番号 28 :図 28) と C末端ァミノ酸残基をコ一ドする D N A配列に H i n d III認識配列を付加し たアンチセンスプライマー （配列番号 29 ：図 29) を用いて大腸菌 K12株ゲ ノム DNAを铸型に PC Rを行った。 更に、 PCRで増幅された DNA断片を制 限酵素 P s t Iと H i n d IIIで処理し、 pNY301ベクターの P s t I /H i n d ΙΠ制限酵素切断部位.に揷入することにより大腸菌 MB P分泌生産用べク ターを構築した。 この大腸菌 M B P分泌生産用 'ベタターを pNY301— MBP とした。
次いで、 この pNY301— MBPをエレク トロポレーシヨン法により、 ブレ ビバチルス - チヨゥシネンシス HP D 31及ぴブレビバチルス ·チヨゥシネンシ ス HPD31—SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。 次いで、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 72時間培養 した。 培養終了後、 培養液を遠心、 分画して得た培養上清画分を実施例 19と同 様の手順により SDS_ PAGE及びウェスタンプロット分析に供した。 その結 果、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31を宿主に用いた場合には、 大 腸菌 MB Pの分解を示す顕著なバンドが確認されたが、 本発明のプレビバチル ス 'チョウシネンシス HPD 31— S P 3を宿主に用いた場合には、 大腸菌 MB Pの分解を示すバンドは認められなかった。
また、 電気泳動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 大腸菌 MB Pに相当するバンドのデンシトメトリーを測定すること により、 培養液中に蓄積された大腸菌 MB Pの定量を行った。 この測定の結果を 表 10に示す。
(表 10)
Figure imgf000059_0001
プレビバチ /レス ·
チョウシネンシス H P D 31 500
ブレビバチ /レス ■
チヨゥシネンシス HPD 3 1 - S P 3 900 表 10に示されているとおり、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD31 — S P 3を宿主に用いて生産された培養液中の大腸菌 MB Pの蓄積量は、 プレビ バチノレス ·チヨゥシネンシス HP D 31を宿主に用いた場合に比べ約 2倍に増加 していた。 ， 実施例 21
(プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3によるゥシ M— CSF の分泌生産）
ゥシ由来マクロファージコロニー刺激因子成熟体 （Ge n BANK a c c e s s i o n NM丄 174026. 1) (以下ゥシ M— C S F) の N末端アミノ 酸残基をコードする DNA配列に B a mH I認識配列^付加したセンスプライマ 一 （配列番号 30 ：図 30 ) と C末端ァミノ酸残基をコ一ドする D N A配列に H i n d III認識配列を付カ卩したアンチセンスプライマー （配列番号 31 ：図 31) を用いてゥシ M— CSF cDNAを鎵型にPCRを行った。 更に、 PCRで増 幅された DNA断片を制限酵素 B a mH Iと H i n d IIIで処理し、 NY 30 1ベクターの B a mH I /H i n d III制限酵素切断部位に挿入することにより ゥシ M— C S F分泌生産用べクタ一構築をした。 このゥシ M— C S F分泌生産用 ベクターを pNY301 -M-C S Fとした。
次いで、 この p NY 301— M— C S Fをエレクトロポレーシヨン法によりブ レビバチルス ■チヨゥシネンシス HP D 31及びブレビバチルス ·チヨゥシネン シス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。 次いで、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 72時間培養 した。 培養終了後、 培養液を遠心、 分画して得た培養上清画分を実施例 19と同 様の手順により SDS— PAGE及びウェスタンブロット分析に供した。 その結 果、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31を宿主に用いた場合には、 ゥ シ M— C S Fの分解を示すバンドが確認されたが、 ブレビバチルス ·チヨゥシネ ンシス HPD31— S P 3を宿主に用いた場合には、 ゥシ M— CSFの分解を示 すバンドは認められなかった。
また、 電気泳動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 ゥシ M— CSFに相当するバンドのデンシトメトリ一を測定するこ とにより、 培養液中に蓄積されたタンパク質の定量を行った。 この測定の結果を 表 1 1に示す。 (表 11) 宿 主 菌 株 培養液中のゥシ M— CSFの蓄積量 （mg/1) ブレビノ チノレス - チヨゥシネンシス HPD 3 1
ブレビノくチノレス ■
チョウシネンシス HP D 31 - S P 3 表 1 1に示されているとおり、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 — SP 3を宿主に用いて生產された培養液中のゥシ M— CSFの蓄積量は、 プレ ビバチノレス .チヨゥシネンシス HPD 31を宿主に用いた場合に比べ約 3倍に増 加していた。 実施例 22
(ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31一 S P 3による EN2の分泌生 産）
豚 毒抗原タンパク質の一部分である E N 2を発現するプラスミ ドベクター p NH3 00 e n 2 (特開 2000— 279179) をエレク トロポレーション 法により、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31及びブレビバチルス · チョウシネンシス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換 体を構築し、 更に、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 9 0時^培養した。
培養終了後、 培養液を遠心、 分画して得た培養上清画分を実施例 19と同様の 手順により SD S— PAGE及びウェスタンブロット分析に供した。 その結果、 ブレビバチルス ·チヨゥシネ.ンシス HPD 31を宿主に用いた場合には、 EN 2 の分解を示す顕著なバンドが確認されたが、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3を宿主に用いた場合には、 EN 2の分解を示すバンドは認め られなカゝつた。 また、 電気泳動後のゲ^^に対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 EN2に相当するバンドのデンシトメトリ一を測定することにより、 培養液中に蓄積されたタンパク質の定量を行った。 この測定の結果を表 12に示 す。
(表 12)
ブレビバチノレス · '
チョウシネンシス HPD 31 400
ブレビバチルス ■
チョウシネンシス HPD31 -S P 3 750 表 12に示されているとおり、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス I-I P D 31 一 S P 3を宿主に用いて生産された培養液中の EN 2の蓄積量は、 ブレビバチル ス -チヨゥシネンシス HPD 31を宿主に用いた場合に比べ約 2倍に増加してい た。 実施例 23
(ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31 -S P 3による I 11 t i m i n (339-575) の生産)
成熟型インチミンの 339番目のアミノ酸配列に相当する DNA配列に B am H Iの認識配列を付加したセンスプライマー （配列番号 3.2 ：図 32) と 575 番目近傍のアミノ酸配列に対応する DN A配列に H i n d IIIの認識配列を付加 したアンチセンスプライマー （配列番号 33 ：図 33) を用いてインチミン遺伝 子を铸型に PCRを行った。 更に、 PCRで増幅した DNA断片を制限酵素 H i n d IIIと B a mH Iで処理した後、 pNY301の B a mH I /H i n d III 制限酵素切断部位に揷入することにより大腸菌 O 157 ： H 7株由来のィンチミ ン （SWI SS— PROT a c c e s s i o n P 43261 ) のアミノ酸配 列の 339番目から 575番目に相当する部分のポリペプチド （以下 I n t im i n (339-575) ) を発現するプラスミドベクターを構築した。 この I n t im i n (339— 575) 分泌生産用ベクターを pNY301— I n t i m i nとした。
次いで、 この pNY 301 - I n t i m i nをエレクトロポレーション法によ り、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31及びプレビバチルス 'チョウ シネンシス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構 築した。 更に、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 90時 間培養した。 培養終了後、 培養液を遠心、 分画して得た培養上清画分を実施例 1 9と同様の手順により SDS— PAGE及びウェスタンプロット分析に供した。 その結果、 プレビバチルス■チヨゥシネンシス HP D 31を宿主に用いた場合に は、 I n t im i n (339— 575) の分解を示す複数の顕著なバンドが確認 されたが、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31 - S P 3を宿主に用い た場合には、 I n t i m i n (339— 575) の分解を示す顕著なバンドは認 められなかった。
また、 電気泳動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 I n t im i n (339-575) に相当するバンドのデンシトメ トリ一を測定することにより、 培養液中に蓄積された I n t imi n (339— 575) の定量を行った。 この測定の結果を表 13に示す。
(表 13) 宿 主 菌 株 培養液中の Intimin (339-575) の蓄積量 （mg/1) ブレビバチノレス ·
チヨゥシネンシス HPD 31 100
ブレビバチノレス ·
チヨゥシネンシス HPD 31 200 表 13に示されているとおり、 プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 一 S P 3を宿主に用いて生産された培養液中の I n t imi n (339-57 5) の蓄積量は、 ブレビバチルス 'チョウシネンシス HP D 31を宿主に用いた 場合に比べ約 2倍 増加していた。
以上の実施例 19から実施例 23により、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD31を宿主に用いた場合には、 その生産された一部が分解されていた糸且換 ぇタンパク質の分泌生産をブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31— S P 3を宿主に用いて行った場合、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31を 宿主に用いた場合より該タンパク質の蓄積量が増加することが示された。
これらの結果は、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31— S P 3を宿 主に用いた場合には、 分泌生産されたタンパク質の分解が顕著に抑制されたため と考えられる。
(ブレビバチルス ·チョウシネンシス HPD31—SP 3による組換えタンパク 質の細胞内への蓄積生産）
更に、 プレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31— S P 3を宿主に用いた 組換えタンパク質の生産性及び分解性の評価試験を、 組換えタンパク質が分泌生 産される場合ではなく、 生産された組換えタンパク質が菌体内に蓄積される場合 について行った。 この評価試験は、 ブレビバチ^ /レス■チョウシネンシス HPD 3 1を宿主に用いて菌体内への蓄積生産を行った場合に、 その一部が菌体内で分解 されていたタンパク質であるプタ由来インターフェロン一 γ (P I R a c c e s s i o n S 10513) 及びィヌ由来インターフェロン一 j3 (Ge n BAN K a c c e s s i o n Ε 11229) の生産を行うことにより行った。 なお、 対照にはブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31を用いた。 実施例 24
(ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス H P D 31— S Ρ 3による組換えブタ由来 インターフェロン一 γの細胞内への蓄積生産） - ブタ由来インターフェロン一 γ成熟体 （P I R a c c e s s i o n S 10 51 3) (以下ブタ I FN— γ) の Ν末端アミノ酸残基をコードする DN Α配列 に N c o I認識配列と Me t A 1 aをコードする配列からなる c c a t g g c t 配列を付加したセンスプライマー （配列番号 34 ··図 34) と C末端ァミノ酸残 基をコードする D A配列に H i n d III認識配列を付加したアンチセンスブラ イマ一 （配列番号 35 : 035) を用いてブタ由来インターフェロン一 γ cD NAを铸型に PC Rを行った。 更に、 PCRで増幅した DNA断片を制限酵素 N c o Iと H i n d IIIで処理した後、 p N Y 301ベクターの翻訳開始メチォ- ン上に存在する B s p H I ZH i n d III制限酵素切断部位に揷入することによ りブタ I FN— "V発現用ベクターを構築した。 このブタ I FN— γ発現用べクタ 一を ρΝΥ301— p I FN— γとした。 この] DNY301—: i FN— γは分 泌シグナルぺプチドをコ一ドする DN Α配列を有していないため生産されたブタ I FN— γは細胞内に蓄積される。
次いで、 この ρΝΥ301 -p I FN— γをエレクトロポレーシヨン法により ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31及びプレビバチルス ·チヨゥシネ ンシス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築し た。 また、 対照として用いるためプタ I FN— γ遺伝子が組み込まれていない p ΝΥ 301を導入したブレビバチルス -チヨゥシネンシス HPD 3 l/p ΝΥ 3 01も構築した。
更に、 これらの形質転換体及びプレビバチルス ·チョウシネンシス H P D 31 /pNY301を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 72時間培養した。 培養終 了後、遠心分離により培養液から菌体を回収した後、超音波により菌体を破砕し、 更に、 遠心分離を行い細胞内画分を得た。 次いで、 この細胞内画分を実施例 19 と同様の手順により SDS— PAGE及びウェスタンプロット分析に供した。 その結果、 図 6に示されているように、 ブレビバチルス-チョウシネンシス H PD 31を宿主に用いた場合には、 ブタ I FN— γの分解を示す顕著なバンドが 確認されたが、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 31一 S Ρ 3を宿主に 用いた場合には、 プタ I F Ν— γの分解を示すバンドは認められなかった。
また、 電気泳動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 プタ I FN— yに相当するバンドのデンシトメトリ一を測定するこ とにより細胞内に蓄積されたタンパク質の定量を行った。 この測定の結果を表 1 4に示す。
(表 1 4.) 宿 主 菌 株 細胞内のプタ I FN— γの蓄積量 （mgZ 1 ) ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HPD 3 1 30
ブレビバチノレス ■
チョウシネンシス HPD 3 1 _S P 3 60 表 1 4に示されているとおり、 ブレビバチルス■チヨゥシネンシス HPD 3 1 一 S P 3を宿主に用いて生産されたブタ I FN— Vの細胞内の蓄積量は、 ブレビ バチルス ·チヨゥシネンシス HPD 3 1を宿主に用いた場合に比べ約 2倍に増加 していた。 実施例 2 5
(プレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 3 1 - S P 3によるィヌ由来ィンタ —フエロン一 βの細胞内への蓄積生産）
ィヌ由来ィンターフェロン一 成熟体（G e n B ANK a c c e s s i o n E 1 1 22 9) (以下ィヌ I FN— /3) の N末端アミノ酸残基をコードする DNA 配列に B s pH I認識配列を付カ卩したセンスプライマー（配列番号 3 6 : 03 6) と C末端ァミノ酸残基をコードする D NA配列に H i n d III認識配列を付カロし たアンチセンスプライマー （配列番号 3 7 ：図 3 7) を用いてィヌ I FN— ]3 c DN Aを铸型に PC Rを行った。 更に、 PCRで増幅したDNA断片を制限酵素 B s pH I及び H i n d ΠΙで処理した後、 p NY 3 0 1ベタターの翻訳開始メ チォニン上に存在する B s p H I ZH i n d III制限酵素切断部位に揷入するこ とによりィヌ I FN— 発現用ベクターを構築した。 このィヌ I FN— 発現用 ベクターを] NY3 0 1— c I FN- とした。 この ρΝΥ 30 1— c I FN— βは分泌シグナルぺプチドをコ一ドする DNA配列を有していないため生産され たィヌ I FN— ]3は細胞内に蓄積される。
次いで、 この pNY301 -c I FN— ]3をエレク トロポレーシヨン法により ブレビバチルス■ ヨゥシネンシス HPD 31、 ブレビバチルス ■チヨゥシネン シス HPD31— SP 3のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。 次いで、 これらの形質転換体を、 それぞれ TM液体培地で 30°C、 72時間培養 した。 培養終了後、 遠心分離により培養液から菌体を回収した後、 超音波により 菌体を破砕し、 更に、 遠心分離を行うことで細胞内画分を得た。 次いで、 この細 胞内画分を実施例 21と同様の手順により SDS— PAGE及びウェスタンプロ ット分析に供した。 その結果、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31を 宿主に用いた場合には、 ィヌ I FN— ]3の分解を示す顕著なバンドが確認された が、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HP D 31 -S P 3を宿主に用いた場合 には、 ィヌ I FN— ]3の分解を示すバンドは認められなかった。
また、 電気 動後のゲルに対して CBB染色を行い、 タンパク質バンドの検出 を行った後、 ィヌ I FN— ]3に相当するバンドのデンシトメトリ一を測定するこ とにより、 細胞内に蓄積されたタンパク質の定量を行った。 この測定の結果を表 15に示す。
(表 15) 宿 主 菌 株 細胞内のィヌ I FN— /3の蓄積量 （mg/1) ブレビバチノレス ·
チョウシネンシス HPD 31 50
ブレビバチノレス '
チョウシネンシス HPD 31— S P 3 80 表 15に示されているとおり、 ブレビバチルス ·チヨゥシネンシス HPD 31 一 S P 3を宿主に用いて生産されたィヌ I FN の細胞内の蓄積量は、 プレビ バチルス ■チヨゥシネンシス HPD 31を宿主に用いた場合に比べ約 1. 6倍に 増加していた。 上記の実施例 24及び実施例 25により、 本発明のブレビバチルス 'チョウシ ネンシス HPD31-SP 3を宿主に用いて糸且換えタンパク質の生産を行った場 合、 ブレビバチル ■チヨゥシネンシス HPD 31を宿主に用いた場合に比べ、 該タンパク質の蓄積量が増加することが示された。 これらの結果は、 細胞内タン パク質分解酵素遺伝子 i m pの不活化により細胞内に蓄積された組換えタンパク 質が顕著に抑制されたためであると考えられる。 寄託番号： FERM BP-08497
寄託の表不： B r e v i b a c i 1 l u s c h o s h i n e n s i s HPD 31— S P 3
寄託機関の名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託機関のあて名：〒 305— 8566 日本国茨城県つくば市
東 1丁目 1番地 1 中央第 6 寄託の日,付：平成 15年 （2003) 9月 11日 寄託番号： F E RM B P- 6863
寄託の表示： B r e v i b a c i 1 l u s c h o s h i n e n s i s HPD 31 (FERM B P- 1087)
寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託機関のあて名：〒 305— 8566 日本国茨城県つくば市
東 1丁目 1番 3号 寄託の日付：平成 1 1年 （1999) 8月 31日 寄託番号： FERM BP—6623
寄託の表示： B a c i l l u s b r e v i s HPD 31 -S 5
寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託機関のあて名：〒 305— 8566 日本国茨城県つくば市
東 1丁目 1番 3号 寄託の日付：平成 1 1年 （1999) 1月 1 9日

Claims

請 求 の 範 囲
1. 胞子を 成しないブレビバチルス■チョ
2. 下記の菌学的性質を有し、 胞子を形成しないブレビバチルス .チョ
(a) 形態
細胞の大きさ
液体培地： 0. 4 0. 6 X 5〜4 μ m
細胞の形
胞子の有無
(b) 生理学的性質
硝酸塩の還元
VPテス卜
クェン酸の利用 +
ゥレアーゼ
ォキシダーゼ +
カタラーゼ +
(c) 他の性質
温度抵抗性 60°Cで死滅する
3. 胞子形成関連遺伝子 h o sが不活性化されたこと、 を特徴とする胞子 を形成しないブレビバチルス ·チヨゥシネンシス。
4. 胞子形成関連遺伝子 h o sの塩基配列が配列番号 1に示す配列である こと、 を特徴とする請求項 3に記載のプレビバチルス■チヨゥシネンシス。
5. 胞子を形成せず、 且つ、 細胞外及び Z又は細胞内のタンパク質分解酵 素活性が低減ないし消失したブレビバチルス ■チヨゥシネンシス。
6. 下記の菌学的性質を有し、 胞子を形成しないプレビバチルス 'チョウ
(a) 形態
細胞の大きさ 液体培地： 0. 4〜0. 6X 1. 5
細胞の形
胞子の有無 ，
Figure imgf000070_0001
(b) 生理学的性質
硝酸塩の還元
VPテスト
クェン酸の利用 +
ゥレアーゼ
ォキシダーゼ +
カタラーゼ +
(c) 他の性質
温度抵抗性 60°Cで死滅する。
細胞外のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
7. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 empが不活性化されたこと、 を特徴とするプレビバチルス ·チヨゥシネンシス。
8. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 empの塩基配列が配列番号 3 に示す配列であること、 を特徴とする請求項 7に記载のブレビバチルス 'チョウ シネンシス。
9. 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i m pが不活性ィヒされたこと、 を特徴とするブレビバチルス ·チヨゥシネンシス。
10. 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子 i m pの塩基配列が配列番号 5 に示す配列であること、 を特徴とする請求項 9に記載のブレビバチルス 'チョウ
11. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子 emp及び細胞内主要タンパク 質分解酵素遺伝子 impが不活性化されたこと、 を特徴とするブレビバチルス · チョウシネンシス。 -
12. 胞子を形成しないこと、 を特徴とする請求項 11に記載のブレビバチ ノレス■チヨゥシネンシス。
13. ブレビバチルス 'チョウシネンシス HPD 31— S P 3 (FERM B P— 08479) 。
14. 請求項 ;L〜 1 3のいずれか 1項に記載のプレビバチルス ·チョウシ ネンシスを、 タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現べクターにより形質 転換してなるプレビバチルス ·チョウシネンシス。
15. 請求項 14に記載のブレビバチルス ·チヨゥシネンシス形質転換体を 培養する工程を含むこと、 を特徴とするタンパク質の製造方法。
16. 請求項 1〜1 3のいずれか 1項に記載のブレビバチルス ·チョウシ ネンシスを組換えタンパク質生産の宿主として使用すること、 を特徴とする糸且換 ぇタンパク質を製造する方法。
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