CN109652436A - 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109652436A
CN109652436A CN201910091383.0A CN201910091383A CN109652436A CN 109652436 A CN109652436 A CN 109652436A CN 201910091383 A CN201910091383 A CN 201910091383A CN 109652436 A CN109652436 A CN 109652436A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
lactococcus lactis
recombinant
murf
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910091383.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109652436B (zh
Inventor
乔建军
薛二淑
吴昊
财音青格乐
宋倩倩
田开仁
支宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201910091383.0A priority Critical patent/CN109652436B/zh
Publication of CN109652436A publication Critical patent/CN109652436A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109652436B publication Critical patent/CN109652436B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用，通过过表达murF基因得到重组乳酸乳球菌菌株。构建菌株的方法：将乳酸乳球菌菌株的基因murF连接到质粒载体上，获得重组质粒；将重组质粒电转到乳酸乳球菌中，选取阳性转化子，获得重组菌株。重组乳酸乳球菌菌株可提高菌株的耐酸性和乳酸链球菌素(Nisin)产量。将原始菌株和过表达murF的菌株在发酵培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，过表达murF的菌株比原始菌株Nisin产量提高1.1～1.5倍，酸应激存活率提高1.1～1.7倍。本发明的重组菌株对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响。其中Nisin是一种安全无毒的食品防腐剂。

Description

一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术、微生物领域，尤其是一种重组乳酸乳球菌菌株及其方法和应用。
背景技术
乳酸乳球菌是工业上最主要的乳酸链球菌素(Nisin)的产生菌。Nisin是一种天然生物活性抗菌肽，由34个氨基酸残基组成，可被人体吸收。它是一种安全无毒的食品防腐剂，主要应用于食品行业，是唯一一种被允许作为食品添加剂的细菌素，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸它不会改变肠道内的正常菌群，不会引起抗药性问题。它能有效的抑制引起食品腐烂的多种革兰氏阳性菌的生长，如乳酸杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐热腐败菌、分枝杆菌等，特别是对产生孢子的细菌，如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌等有很强的抑制作用。
在现有发酵乳酸链球菌素产量的基础下，菌体代谢分泌的乳酸会抑制菌体自身的生长，对菌体发酵很不利，因此通过提高菌体在酸性条件下的存活率来提高发酵产量也是一种可行的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用，克服现有技术中乳酸乳球菌的Nisin产量低的问题。
本发明的技术方案是：
一种重组乳酸乳球菌菌株，所述重组菌株采用酶切连接的方法将目的基因表达在乳酸乳球菌中过表达，构建方法包括如下步骤：
(1)提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，设计引物扩增出murF基因片段；
(2)限制性内切酶对步骤(1)中的murF片段进行双酶切；
(3)同步骤(2)用限制性内切酶对质粒pLEB124进行双酶切，得到线性质粒；
(4)将步骤(2)的酶切片段和步骤(3)的酶切质粒通过T4连接酶进行连接；
(5)将步骤(4)得到的重组质粒化转到大肠杆菌TG1中，用红霉素抗性筛选得到阳性转化子，挑取单菌落进行PCR验证并测序，将正确的重组单菌落37℃培养克隆质粒；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，将验证正确的菌株保菌，-80℃储存菌种。
所述菌株包括乳酸乳球菌乳亚种。
一种重组乳酸乳球菌菌株的制备方法，采用酶切连接的方法将目的基因表达在乳酸乳球菌中过表达，具体包括如下步骤：
(1)提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，设计引物扩增出murF基因片段；
(2)限制性内切酶对步骤(1)中的murF片段进行双酶切；
(3)同步骤(2)用限制性内切酶对质粒pLEB124进行双酶切，得到线性质粒；
(4)将步骤(2)的酶切片段和步骤(3)的酶切质粒通过T4连接酶进行连接；
(5)将步骤(4)得到的重组质粒化转到大肠杆菌TG1中，用红霉素抗性筛选得到阳性转化子，挑取单菌落进行PCR验证并测序，将正确的重组单菌落37℃培养克隆质粒；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，将验证正确的菌株保菌，-80℃储存菌种。
一种重组乳酸乳球菌菌株在发酵培养中的应用。
所述应用是指提高Nisin产量和菌株耐酸性。
所述发酵条件为：温度30℃，静置培养。
本发明的有益效果是：本发明成功构建了过表达murF菌株，经酶切连接，质粒载体上插入目的片段，将重组质粒电转到乳酸乳球菌中，菌落PCR鉴定，重组菌株构建成功。菌株发酵培养和酸应激实验表明过表达murF菌株能有效提高Nisin产量和菌株耐酸性。将原始菌株和过表达murF的菌株在发酵培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，过表达murF的菌株比原始菌株Nisin产量提高1.1～1.5倍，酸应激存活率提高1.1～1.7倍。本发明的重组菌株对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响。
附图说明
图1为PCR扩增的murF基因片段的琼脂糖凝胶图，其中泳道1为DNA marker，泳道2、3为murF片段；
图2为重组质粒化转到TG1的菌落PCR片段，其中泳道1为DNA marker，泳道2为PCR扩增的murF片段；
图3为重组质粒电转到乳酸乳球菌中菌落PCR片段，其中泳道1为DNA marker，泳道2为PCR扩增的murF片段；
图4为乳酸乳球菌原始菌株和重组菌株在pH3的条件下应激1.5h、2h后菌体存活率；
图5为乳酸乳球菌原始菌株和重组菌株在发酵培养基中发酵6h、8h、10h的Nisin含量。
具体实施方式
以下结合实施例进一步阐述本发明。
本发明是以乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis命名为YF11，已于2016年5月10日保藏)为例，实验证明，乳酸乳球菌亚种属也可以用于本发明。
各实施例所用的乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)YF11菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12429，保藏时间为2016年5月10日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101,。该菌种以下简称为乳酸乳球菌YF11。
过表达murF菌株构建方法，步骤如下：
1)提取乳酸乳球菌YF11的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，设计引物扩增出murF基因片段；
(2)限制性内切酶对步骤(1)中的murF片段进行双酶切；
(3)同步骤(2)用限制性内切酶对质粒pLEB124进行双酶切，得到线性质粒；
(4)将步骤(2)的酶切片段和步骤(3)的酶切质粒通过T4连接酶进行连接；
(5)将步骤(4)得到的重组质粒化转到大肠杆菌TG1中，用红霉素抗性筛选得到阳性转化子，挑取单菌落进行PCR验证并测序，将正确的重组单菌落37℃培养克隆质粒；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，将验证正确的菌株保菌，-80℃储存菌种。
1、步骤(1)的具体操作步骤为：
以乳酸乳球菌YF11的基因组DNA为模板，PCR扩增出目的片段murF，记为YF11-murF。murF的PRT序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其中，用于扩增murF基因的上、下游同源臂的引物为：
YF11-murF-F:5′CGCGGATCCACGATTGCTGACAGATTTTTTT 3′(SEQ ID NO.3)
YF11-murF-R:5′CATGCCATGGAACTTTCTGTCAGTATTTTTTATCA 3′(SEQ ID NO.4)
2、步骤(2)(3)的具体操作为：
限制性内切酶对步骤(1)的片段和质粒进行双酶切，得到基因序列M(1399bp)，质粒片段P。其中，所述的限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
3、步骤(4)的具体操作步骤为：
将步骤(2)(3)得到的片段通过T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物，通过氯化钙转化法将该连接产物化转到大肠杆菌TG1中，37℃在含红霉素抗性的培养基中进行筛选，挑取单菌落进行菌落PCR(验证引物为F2和R2)，若化转成功，则在1637bp处出现电泳条带，说明该转化子为阳；验证引物为重组载体上的片段：
F2:5′AGGGAACCTAGAATAGTGAA 3′(SEQ ID NO.5)
R2:5′TTCATTCTGCTAACCAGTAAGGC 3′(SEQ ID NO.6)
4、步骤(5)的具体操作步骤为：
将筛选的阳性转化子扩大培养，提取质粒测序验证，将重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性培养基筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，扩增出1637bp长度的条带说明电转成功。本实验的片段测序由苏州金维智生物科技有限公司提供。
本发明根据上述步骤得到过表达murF菌株。
本发明所用的发酵培养基配方：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，半胱氨酸0.23g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 7.2。酸应激培养基的配方为：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 3。均为现有配方。
本发明通过上述步骤提供了2种实施例，Nisin含量的测定采用琼脂糖扩散法(菌种为滕黄微球菌)，酸应激菌体的存活率采用涂板计数法。
实施例1
将乳酸乳球菌YF11和过表达murF的YF11构建菌株按1％-3％的接种量活化三代，取活化好的菌株按5％的接种量分别转接到发酵培养基中，发酵培养12h，每2h取发酵液样品，用0.02M HCl将4h、12h的发酵液稀释10倍，6h、8h、10h的发酵液稀释20倍，将稀释后的样品与Nisin标准品各100μL加入到Nisin效价培养基的孔中。每个样品三个平行，正置37℃培养约24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
实施例2
将乳酸乳球菌YF11和过表达murF的YF11构建菌株按1％-3％的接种量活化三代，取活化好的菌株按5％的接种量转接到发酵培养基中，培养至8h，实验组和对照组的发酵液各取5mL，5000rpm离心5分钟，弃上清，加入等体积pH 3的酸应激培养基，轻柔重悬，30℃静置培养2h。期间0h、1.5h、2h各取100μL菌悬液稀释涂板，30℃静置培养24h左右,计算乳酸乳球菌存活率。
存活率＝应激后菌落数(1.5h or 2h)/应激前菌落数(0h)*100％
结果表明：如图1所示，为引物YF11-murF-F和YF11-murF-R通过PCR扩增murF基因片段的琼脂糖凝胶图，其中泳道1为DNA marker，泳道2、3为murF扩增片段，约在1400bp左右。
如图2所示为验证引物F2和R2以重组质粒化转到TG1的单菌落为模板扩增的PCR片段，其中泳道1为DNA marker，泳道2为PCR扩增的murF片段，约在1600bP左右；
如图3所示为验证引物F2和R2以重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11的单菌落为模板扩增的PCR片段，其中泳道1为DNA marker，泳道2为PCR扩增的murF片段约在1600bP左右；
如图4所示为乳酸乳球菌原始菌株和重组菌株在pH3的条件下应激1.5h、2h后菌体存活率；其中重组菌株在1.5h、2h菌体存活率均提高1.5倍左右；
如图5所示为乳酸乳球菌原始菌株和重组菌株在发酵培养基中发酵6h、8h、10h的Nisin含量。原始菌株和重组菌株在8h时Nisin均为最高，而重组菌株比原始菌株产量提高1.6倍。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。
<110> 天津大学
<120> 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用
<130>
<160> 6
<170>
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> 乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactis subsp.lactis)YF11
<400> 1
Met Lys Leu Thr Ile His Glu Ile Ala Gln Val Val Gly Ala Lys Asn
5 10 15
Asp Trp Ser Gln Leu Ala Asp Leu Ser Val Asn Lys Ile Glu Phe Asp
20 25 30
Ser Arg Leu Ile Glu Lys Gly Asp Ile Phe Leu Pro Leu Lys Gly Ala
35 40 45
Arg Asp Gly His Asp Phe Ile Glu Ile Ala Phe Asp Asn Gly Ala Ile
50 55 60
Ile Ser Phe Ser Glu Lys Glu Val Glu Gln Ala His Leu Leu Val Asp
65 70 75 80
Asp Asn Leu Leu Ala Phe Gln Lys Leu Ala Lys Tyr Tyr Leu Glu Lys
85 90 95
Thr Lys Val Pro Val Ile Ala Val Thr Gly Ser Asn Gly Lys Thr Thr
100 105 110
Thr Lys Asp Met Ile Ala Ala Val Leu Ser Lys Lys Phe Lys Thr Tyr
115 120 125
Lys Thr Gln Gly Asn His Asn Asn Glu Ile Gly Leu Pro Tyr Thr Ile
130 135 140
Leu His Met Pro Asp Asp Thr Glu Lys Leu Val Leu Glu Met Gly Met
145 150 155 160
Asp His Pro Gly Asp Ile Asp Phe Leu Ser Glu Leu Ala Lys Pro Glu
165 170 175
Leu Ala Val Ile Thr Leu Ile Gly Glu Ala His Leu Glu His Met Gly
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ile Ala Lys Gly Lys Met Gly Ile Thr Ala Gly Leu
195 200 205
His Gly Glu Leu Ile Ala Pro Ala Asp Pro Ile Ile Asn Ala Phe Ile
210 215 220
Pro Asp Asn Gln Lys Ile Ile Arg Phe Gly Leu Pro Gly Glu Asp Leu
225 230 235 240
Phe Ile Thr Lys Leu Val Glu His Lys Glu Lys Leu Thr Phe Glu Thr
245 250 255
Asn Phe Leu Asp Glu Ser Ile Thr Ile Pro Val Pro Gly Lys Tyr Asn
260 265 270
Ala Thr Asn Ala Met Leu Ala Ala Phe Val Gly Leu His Tyr Gly Leu
275 280 285
Ser Glu Ala Glu Ile Lys Lys Ala Leu Lys Glu Val Glu Leu Thr Arg
290 295 300
Asn Arg Thr Glu Trp Lys Lys Ala Lys Asn Gly Ala Asp Leu Leu Ser
305 310 315 320
Asp Val Tyr Asn Ala Asn Pro Thr Ala Met Arg Leu Ile Leu Glu Thr
325 330 335
Phe Gln Ala Ile Pro Lys Asn Glu Asn Gly Arg Lys Ile Ala Val Leu
340 345 350
Ala Asp Met Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ala Ala Gln Leu His Lys Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Ser Ile Asp Phe Asn Lys Ile Asp Lys Val Tyr Leu Tyr
370 375 380
Gly Glu Met Met Lys Asn Leu Ala Glu Ile Ser Thr Asp Lys Ala Val
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Thr Asp Leu Asp Leu Leu Thr Glu Ser Leu Ser Ala Asp
405 410 415
Leu Lys Pro Thr Asp Gln Val Leu Phe Lys Gly Ser Asn Ser Met Lys
420 425 430
Leu Ser Glu Val Val Ala Lys Leu
435 440
<210> 2
<211> 1323
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌乳亚种（lactococcus lactis subsp.lactis)YF11
<400> 2
atgaaactca caattcacga aatcgcccaa gtagttggcg caaaaaatga ttggtcgcaa 60
ctggcagatt tgtcagtcaa taaaattgaa tttgacagcc gtttgattga aaaaggggat 120
atctttttgc cacttaaggg ggcacgagat ggtcatgatt tcatcgaaat cgcttttgat 180
aatggagcaa taatcagctt ttcagaaaaa gaagttgaac aagctcatct cttggttgac 240
gataatctgc ttgctttcca aaaattagca aaatattatc ttgaaaagac aaaagttcca 300
gtcattgcgg tgacaggttc aaatggaaaa acaacaacca aagacatgat tgctgctgtt 360
ttgtctaaga aatttaaaac atacaaaaca caaggaaatc acaataatga aatcggctta 420
ccctacacca ttttacatat gccggacgat actgaaaaat tagttttgga aatgggaatg 480
gatcaccctg gtgatattga ttttttatca gaacttgcta agcctgaact tgctgtcatt 540
accttaattg gtgaagcaca tcttgaacat atgggaagtc gcgaaaatat tgctaaaggg 600
aaaatgggga ttacggctgg tttgcatggt gagcttattg cccctgctga cccaattatt 660
aatgctttta tcccagacaa tcaaaaaatt attcgctttg gtttgcccgg tgaagattta 720
tttattacaa aattagtcga acacaaagaa aaattaactt ttgaaactaa ttttttagat 780
gaatcaatta ctattccagt tcctggtaaa tataacgcga cgaatgctat gttagctgct 840
tttgttggct tacattatgg actttcagaa gccgaaatta aaaaagcttt gaaagaagta 900
gagctgacca gaaatcggac agagtggaaa aaagcaaaaa atggtgcaga ccttttgagt 960
gatgtttata atgccaatcc gacagcaatg cgtttgattt tggaaacttt ccaagccatt 1020
cctaaaaatg agaatggtcg aaagattgca gttcttgctg atatgttaga acttgggccc 1080
agtgcagccc aactccataa agatatattg aaatctattg atttcaataa aattgataaa 1140
gtctatcttt atggtgaaat gatgaaaaac ttggcagaaa tttcgactga caaagcggtc 1200
agctatttta cagatttaga tttactgaca gaaagtctgt cagcagattt gaaaccaact 1260
gaccaagtgt tattcaaagg ttcaaatagc atgaaacttt cagaggttgt tgcaaaatta 1320
taa 1323
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcggatcca cgattgctga cagatttttt t 31
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgccatgg aactttctgt cagtattttt tatca 35
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agggaaccta gaatagtgaa 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttcattctgc taaccagtaa ggc 23

Claims (6)

1.一种重组乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述重组菌株采用酶切连接的方法将目的基因表达在乳酸乳球菌中过表达，构建方法包括如下步骤：
(1)提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，设计引物扩增出murF基因片段；
(2)限制性内切酶对步骤(1)中的murF片段进行双酶切；
(3)同步骤(2)用限制性内切酶对质粒pLEB124进行双酶切，得到线性质粒；
(4)将步骤(2)的酶切片段和步骤(3)的酶切质粒通过T4连接酶进行连接；
(5)将步骤(4)得到的重组质粒化转到大肠杆菌TG1中，用红霉素抗性筛选得到阳性转化子，挑取单菌落进行PCR验证并测序，将正确的重组单菌落37℃培养克隆质粒；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，将验证正确的菌株保菌，-80℃储存菌种。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌菌株，其特征在于，所述菌株包括乳酸乳球菌乳亚种。
3.一种重组乳酸乳球菌菌株的制备方法，其特征在于，采用酶切连接的方法将目的基因表达在乳酸乳球菌中过表达，具体包括如下步骤：
(1)提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，设计引物扩增出murF基因片段；
(2)限制性内切酶对步骤(1)中的murF片段进行双酶切；
(3)同步骤(2)用限制性内切酶对质粒pLEB124进行双酶切，得到线性质粒；
(4)将步骤(2)的酶切片段和步骤(3)的酶切质粒通过T4连接酶进行连接；
(5)将步骤(4)得到的重组质粒化转到大肠杆菌TG1中，用红霉素抗性筛选得到阳性转化子，挑取单菌落进行PCR验证并测序，将正确的重组单菌落37℃培养克隆质粒；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒电转到乳酸乳球菌YF11中，用红霉素抗性筛选得到阳性菌株，挑取单菌落PCR验证，将验证正确的菌株保菌，-80℃储存菌种。
4.一种重组乳酸乳球菌菌株在发酵培养中的应用。
5.根据权利要求4所述重组乳酸乳球菌菌株在发酵培养中的应用，其特征在于，所述应用是指提高Nisin产量和菌株耐酸性。
6.根据权利要求4所述的重组乳酸乳球菌菌株在发酵培养中的应用，其特征在于，所述发酵条件为：温度30℃，静置培养。
CN201910091383.0A 2019-01-30 2019-01-30 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用 Active CN109652436B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910091383.0A CN109652436B (zh) 2019-01-30 2019-01-30 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910091383.0A CN109652436B (zh) 2019-01-30 2019-01-30 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109652436A true CN109652436A (zh) 2019-04-19
CN109652436B CN109652436B (zh) 2022-07-08

Family

ID=66121028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910091383.0A Active CN109652436B (zh) 2019-01-30 2019-01-30 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109652436B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762763A (zh) * 2019-01-24 2019-05-17 天津大学 添加d-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用
CN114717254A (zh) * 2022-04-29 2022-07-08 深圳大学 酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素Nisin的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236694A (zh) * 2017-06-09 2017-10-10 江南大学 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法
CN109486834A (zh) * 2018-11-29 2019-03-19 天津大学 高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236694A (zh) * 2017-06-09 2017-10-10 江南大学 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法
CN109486834A (zh) * 2018-11-29 2019-03-19 天津大学 高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO WU 等: "D-Methionine and D-Phenylalanine Improve Lactococcus lactis F44 Acid Resistance and Nisin Yield by Governing Cell Wall Remodeling", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
JIAN ZHANG 等: "Enhance nisin yield via improving acid-tolerant capability of Lactococcus lactis F44", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
WU,H. 等: "Lactococcus lactis subsp. lactis strain F44 chromosome, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
薛二淑 等: "细菌中D-氨基酸生物合成及调控作用研究进展", 《中国生物工程杂志》 *
薛二淑: "D-氨基酸对乳酸乳球菌F44酸耐受及nisin产量影响的研究", 《万方》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762763A (zh) * 2019-01-24 2019-05-17 天津大学 添加d-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用
CN114717254A (zh) * 2022-04-29 2022-07-08 深圳大学 酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素Nisin的方法及其应用
CN114717254B (zh) * 2022-04-29 2024-03-12 深圳大学 酵母工程菌展示表达乳酸链球菌素Nisin的方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109652436B (zh) 2022-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kullen et al. Genetic modification of intestinal lactobacilli and bifidobacteria
Huber et al. Methanococcus thermolithotrophicus, a novel thermophilic lithotrophic methanogen
Todorov et al. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis ST34BR, a strain isolated from barley beer
CN107236694B (zh) 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法
CN110205266B (zh) 一株产细菌素的副干酪乳杆菌及其应用
CN105733986B (zh) 一株特基拉芽孢杆菌及其应用
CN113170842A (zh) 一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用
CN110241061A (zh) 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
Jung et al. Distribution of lactic acid bacteria in garlic (Allium sativum) and green onion (Allium fistulosum) using SDS-PAGE whole cell protein pattern comparison and 16S rRNA gene sequence analysis
Todorov et al. Characterization of bacteriocin HV219, produced by Lactococcus lactis subsp. lactis HV219 isolated from human vaginal secretions
Ishida et al. Identification and characterization of lactococcal and Acetobacter strains isolated from traditional Caucasusian fermented milk
CN109652436A (zh) 一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用
CN109486834B (zh) 高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法
CN106867939B (zh) 一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用
KR102026934B1 (ko) 재조합 목적단백질 고효율 생산을 위한 신규 류코노스톡 시트리움 efel 2701 균주 및 이의 용도
CN101654681A (zh) 一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法
CN101294144A (zh) 2型猪链球菌sa1KR基因敲除突变株及其制备方法和应用
CN111254106A (zh) 一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用
Todorov et al. Medium components effecting bacteriocin production by two strains of Lactobacillus plantarum ST414BZ and ST664BZ isolated from boza
CN113699092B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN107058176B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在降低生物胺中的应用
CN103484415A (zh) 一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用
US11952596B2 (en) Application of glutamate dehydrogenase GDHA of Peptostreptococcus asaccharolyticus in increasing yield of poly-r-glutamic acid from Bacillus licheniformis
CN114181881A (zh) 基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用
CN109628366B (zh) 一种提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant