CN109762763A - 添加d-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

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吴昊
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Abstract

本发明公开了一种添加D‑氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用，将D‑氨基酸混合物加入培养基可提高乳酸乳球菌耐酸性和乳酸链球菌素(Nisin)产量。将原始菌株在加入D‑氨基酸混合物的培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，原始菌株提高1.5～1.7倍，8h酸应激存活率提高1.4～1.7倍。本发明的D‑氨基酸混合物对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响，其中Nisin是一种安全无毒的食品防腐剂，D‑氨基酸在食品、医药等方面广泛应用。

Description

添加D-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种添加D-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用。
背景技术
D-氨基酸广泛存在于微生物、植物、动物中，并且可以应用于食品、药物和化妆品中。细胞生长过程中D-氨基酸的产生和释放，可调节多种生理变化，例如细胞壁生物合成、生物膜完整性和孢子萌发等。
乳酸乳球菌是一种原核微生物，广泛存在于乳制品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物。乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸乳球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500Da，可被人体吸收。Nisin是一种安全无毒的食品防腐剂，主要应用于食品行业，它能有效的抑制引起食品腐烂的多种革兰氏阳性菌的生长，如乳酸杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐热腐败菌、分枝杆菌等，特别是对产生孢子的细菌，如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌等有很强的抑制作用。乳酸乳球菌作为工业上最主要的nisin产生菌，提高乳酸乳球菌的nisin产量有着重要的作用。而乳酸乳球菌代谢过程中分泌的乳酸对菌体生长及发酵很不利。因此，提高菌体的耐酸性对nisin的发酵生产更有利。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种添加D-氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用，克服现有技术中乳酸乳球菌的Nisin产量低的问题。
本发明的技术方案是：
一种添加D-氨基酸混合物培养基，其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热1M无菌碳酸氢钠溶液中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀。即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
所述母液pH在9.0左右宜现配现用，应根据所加D-氨基酸浓度适当调整发酵培养基的pH。
步骤(2)中，水浴温度在70-80℃，加热时间为20分钟。
所述发酵培养基的配方为：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，半胱氨酸0.23g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 7.2。
酸应激培养基的配方为：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 3。
一种添加D-氨基酸混合物培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热1M无菌碳酸氢钠溶液中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀。即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
添加D-氨基酸混合物培养基在乳酸乳球菌发酵中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中的D-氨基酸是一种安全、无毒，并被广泛应用在医药、食品中。在发酵培养基中添加D-氨基酸混合物，可以有效的提高乳酸乳球菌的Nisin产量，因此，D-氨基酸混合物对Nisin产量的提高有着重要的实践价值。
(2)本发明在含低浓度D-氨基酸混合物的发酵培养基中，乳酸乳球菌在发酵过程中菌体浓度OD600、pH的数据说明D-氨基酸混合物对菌体生长趋势影响较小。
附图说明
图1为对照组和实验组在pH3的条件下应激1.5h、2h后菌体存活率；其中对照组为发酵培养基中未加D-氨基酸混合物，实验组为发酵培养基中加入D-苯丙氨酸：D-甲硫氨酸不同比例的D-氨基酸混合物；
图2为对照组和实验组在发酵6h、8h、10h的Nisin含量；其中对照组为发酵培养基中未加D-氨基酸混合物，实验组为发酵培养基中加入D-苯丙氨酸：D-甲硫氨酸不同比例的D-氨基酸混合物；
图3为对照组和实验组在发酵过程中菌液pH的变化情况；其中对照组为发酵培养基中未加D-氨基酸混合物，实验组为发酵培养基中加入D-苯丙氨酸：D-甲硫氨酸不同比例的D-氨基酸混合物；
图4为对照组和实验组在发酵过程中菌体浓度变化情况；其中对照组为发酵培养基中未加D-氨基酸混合物，实验组为发酵培养基中加入D-苯丙氨酸：D-甲硫氨酸不同比例的D-氨基酸混合物；
具体实施方式
以下结合实施例进一步阐述本发明，但本发明所涉及的主题范围并非仅限于实施例。
本发明是以乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis命名为YF11，已于2016年5月10日保藏)为例，实验证明，乳酸乳球菌亚种属也可以用于本发明。
各实施例所用的乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)YF11菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12429，保藏时间为2016年5月10日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101,。该菌种以下简称为乳酸乳球菌YF11。
培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热的无菌碳酸氢钠溶液(1M)中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热20分钟左右溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀。即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
本发明所用的发酵培养基配方：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，半胱氨酸0.23g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 7.2。
酸应激培养基的配方为：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 3。均为现有配方。
本发明通过上述步骤提供了6种实施例，Nisin含量的测定采用琼脂糖扩散法(菌种为滕黄微球菌)，酸应激菌体的存活率采用涂板计数法。
实施例1
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热的无菌碳酸氢钠溶液(1M)中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热20分钟左右溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀。即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例50：0加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为50mM，0mM。
(2)将乳酸乳球菌F44按1％的接种量活化三代，取活化好的菌株按5％的接种量分别转接到含D-氨基酸混合物的发酵培养基和对照培养基中，发酵培养12h，每2h取发酵液样品，用0.02M HCl将4h、12h的发酵液稀释10倍，6h、8h、10h的发酵液稀释20倍，将稀释后的样品与Nisin标准品各100μL加入到Nisin效价培养基的孔中。每个样品三个平行，正置37℃培养约24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
(3)将乳酸乳球菌F44按1％的接种量活化三代，取活化好的菌株按5％的接种量转接到D-氨基酸混合物的发酵培养基中，培养至8h，实验组和对照组的发酵液各取5mL，5000rpm离心5分钟，弃上清，加入等体积pH 3的酸应激培养基，轻柔重悬，30℃静置培养2h。期间0h、1.5h、2h各取100μL菌悬液稀释涂板，30℃静置培养24h左右,计算乳酸乳球菌存活率。
存活率＝应激后菌落数(1.5h or 2h)/应激前菌落数(0h)*100％
实施例2
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
重复实施例中步骤1
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例0:50加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为0mM，50mM。
(2)重复实施例1步骤2中(2)(3)。
实施例3
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
重复实施例中步骤1
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例1:1加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为25mM，25mM。
(2)重复实施例1步骤2中(2)(3)。
实施例4
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
重复实施例中步骤1
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例2.5:1加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为25mM，10mM。
(2)重复实施例1步骤2中(2)(3)。
实施例5
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
重复实施例中步骤1
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例1:1加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为10mM，10mM。
(2)重复实施例1步骤2中(2)(3)。
实施例6
1.培养基中添加D-氨基酸混合物的制备方法，包括以下步骤：
重复实施例中步骤1
2.菌株YF11Nisin产量和酸应激
(1)D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸母液按比例1:1加入灭菌的发酵培养基中，摇匀。所述氨基酸的浓度分别为1mM，1mM。
(2)重复实施例1步骤2中(2)(3)。
以上所述是本发明的部分实施例，并不限制于以上范围，本发明采用D-氨基酸混合物有效的提高了乳酸乳球菌Nisin产量和菌株的耐酸性。
如图1所示为YF11在含有不同D-氨基酸混合物的发酵培养基中生长8h后在pH3的条件下应激1.5h、2h后菌体存活率。其中在10Mm:10mM生长的菌体在酸应激下存活率较高，提高1.7倍左右，而其它浓度的D-氨基酸混合物也均有不同程度的提高。
如图2所示为YF11在含有不同D-氨基酸混合物的发酵培养基中发酵6h、8h、10h的nisin含量。YF11为对照组，其中发酵培养基中含有10mM:10mM的D-氨基酸Nisin含量较高，提高1.7倍左右。
图3、图4为发酵过程中菌液pH和菌体浓度变化情况，两者成负相关，即菌体浓度越大，代谢分泌的乳酸也就相应较大，pH越低。含低浓度D-氨基酸混合物对菌体生长趋势影响较小，而超生理浓度的D-氨基酸混合物对菌体生长趋势有抑制作用。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种添加D-氨基酸混合物培养基，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热的1M无菌碳酸氢钠溶液中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀,即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的添加D-氨基酸混合物培养基，其特征在于，所述母液pH在9.0左右宜现配现用，应根据所加D-氨基酸浓度适当调整发酵培养基的pH。
3.根据权利要求1所述的添加D-氨基酸混合物培养基，其特征在于，在步骤(2)中，水浴温度在70-80℃，加热时间为20分钟。
4.根据权利要求1所述的添加D-氨基酸混合物培养基，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：酵母浸粉15g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾20g/L，蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，半胱氨酸0.23g/L，氯化钠1.5g/L，七水-硫酸镁0.15g/L，pH 7.2。
5.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述添加D-氨基酸混合物培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别称取相应质量的D-苯丙氨酸和D-甲硫氨酸加入到70℃预热的无菌碳酸氢钠溶液(1M)中，配制浓度分别为0.8M的母液；
(2)水浴加热20分钟左右溶解，加热期间晃动，防止结块；
(3)溶解后趁热在超净台过无菌水膜，即可按浓度比例范围50mM:0mM～0mM:50mM加入到灭菌培养基中，摇匀,即可得到添加D-氨基酸的发酵培养基。
6.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述添加D-氨基酸混合物培养基在乳酸乳球菌发酵中的应用。
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