CN104830731A - 一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌ab-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌，该菌被命名为Lactobacillus plantarum AB-1，已于2014年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9653。本发明中的植物乳杆菌在全脂乳培养基中和该菌参与的复配发酵酸奶中均表现出较强广谱抑菌特性，且该菌株参与酸奶发酵时，能有效增强发酵酸奶的风味特征，复配发酵酸奶上清经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后依然能表现出较好的广谱抑菌特性。该菌在胃肠液中较高的存活率还证明其有优良的益生特性，在人体内具有较强的存活能力。另外，该菌对甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌具有较好的抑菌活性。

Description

一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌AB-1及其应用
技术领域
本发明涉及一株分离自内蒙古巴彦淖尔盟酸面团中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-1，还涉及所述植物乳杆菌在抑制致病菌、作为食品发酵剂或在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
背景技术
当今世界，食品安全问题已经被大众认为是主要的公共卫生安全问题，然而，食品微生物污染问题是食品安全的主要问题之一。食品微生物的污染主要是细菌污染，特别是常见致病性的单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等细菌均能引起食源性疾病，这一问题已经引起了公共的注意，普通的化学药物治疗方法的有使致病菌产生抗药性和治疗效果不佳等缺陷，最近的研究表明乳酸菌能有效的抑制致病菌生长，因其具有稳定性、免疫性和安全性等优势，被认为是新型食品防腐剂和保健食品的研究热点。
如今，消费者对于食品的需求不仅局限在味道和眼前的营养，而是更希望他们能提供给身体超出基本营养价值以外有更针对性的健康益处。酸奶是益生菌的良好载体，不仅能提供给人们酸奶的营养，还能通过益生菌在肠道内定植来调整肠道菌群和产生特定的抑菌物质来抑制有害菌的存活。乳酸菌的抑制作用可能是由于产生酸性物质使不耐酸致病菌生长繁殖受到抑制；产生类似细菌素的小分子肽类使致病菌受到抑制作用；产生溶菌酶、过氧化氢等物质杀死潜在的病原菌。使用植物乳杆菌(L.plantarum)来抑制致病菌的的生长和调节肠道菌群，已经在体内和体外得到证明。本发明中的植物乳杆菌主要来至于传统发酵乳制品，其安全性是有保证的。
发明内容
本发明的另一目的在于提供一种新型乳杆菌菌株，其具有优异的作为益生菌基本性质的耐酸性、耐胆汁酸性、过氧化氢酶的稳定性、蛋白酶稳定性和温度稳定性。
本发明的另一目的是提供用于预防和治疗肠道疾病的含有新型植物乳杆菌的组合物。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌广谱抑菌活性的应用。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在农业生物农药和果蔬保鲜剂方面的应用。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在整肠中的应用，具有良好的益生特性。
本发明的另一目的是提供新型乳杆菌以作为发酵剂或添加剂在在酸奶或保健食品中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌的新菌株(L.plantarum)AB-1及其制备方法。该菌株(L.plantarum)AB-1已于2014年09月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9653。
本发明的植物乳杆菌AB-1是经过筛选的、从内蒙古巴彦淖尔盟发酵酸面团中分离得到、具有广谱抑菌活性的益生乳酸菌。
本发明的植物乳杆菌AB-1通过如下方法分离得到。
a.菌株培养及分离方法
将采集的酸面团先进行前处理，再将样品做梯度稀释后(10-4，10-5，10-6)涂布于含有放线菌酮(0.1wt％，OXID公司)和硫酸粘菌素(0.1wt％，OXID公司)的MRS琼脂平板培养基或者M17琼脂平板培养基(OXID公司)上，30℃厌氧培养48h～72h，挑取单菌落，转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，划线接种于MRS琼脂培养基(OXID)，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后，做进一步鉴定和保存。
其中MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 80 1ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g，蒸馏水1L，调节pH至6.2左右，琼脂15g，121℃、15min灭菌。
M17培养基的组成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、二钠甘油19g、琼脂11g、蒸馏水1L。
b.分子生物学鉴定
将冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养24h，经TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
其中，TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定。如上从酸面团采集到的菌株显示出了与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。将上述微生物鉴定为植物乳杆菌L.plantarum。植物乳杆菌L.plantarum的系统发育树状图见图3。
c.形态学特性
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1具有如下形态学特征：细胞呈直杆状，有圆形末端，长3.0-8.0μm，宽0.9-1.2μm，呈单个、成对，或短链状出现(见图1)，有些菌能减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。
d.菌落形态特性
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1在MRS培养基上生长形成乳白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1.5mm(见图2)。
植物乳杆菌(L.plantarum)AB-1抑菌性能测定
e.植物乳杆菌上清液的制备方法
以347株广泛采集的植物乳杆菌作为筛选本发明的具有抑制致病菌活性植物乳杆菌的来源并进行对比，该347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，该347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库。
把冻存管中的保藏液接种到5ml的MRS培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，连续活化两代，用活化第二代的植物乳杆菌MRS培养液以(1×109cfu/ml)以2％的比例(V/V)接种到全脂乳(11wt％全脂乳粉添加到89wt％无菌水中混匀后经巴氏杀菌)中，37℃恒温培养24h，取发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
f.琼脂打孔扩散法测定抑菌活性
将活化好的5株指示菌(单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌，均由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，面向公众开放)按2％(V/V)接入各自培养基中，37℃培养24h，使菌体充分富集，以MRS为培养基用平板计数法计数。得到计数结果后，将肠道致病菌菌液制成104、105、106、107的指示菌细胞悬液，以乳酸调节pH为4.0的MRS无细胞悬液为标准，利用琼脂打孔扩散法，确定抑菌圈最易观测的肠道致病菌的生长量作为指示菌悬液的最佳浓度，抑菌效果见表1。
表1 不同浓度指示菌的抑菌效果
将指示菌菌悬液稀释到106cfu/ml以1:100的量加到冷至45℃的灭菌MRS培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌全脂乳发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，选择对5株指示菌均有抑菌活性的植物乳杆菌作为复筛菌株。
g.菌株对甜瓜疫霉菌的抑制活性
将在PDA培养基上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应的复筛菌株植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，结果如图5所示。
h.菌株对甜瓜枯萎菌的抑制活性
将在PDA培养基上活化好的甜瓜枯萎菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应的复筛菌株植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小，结果如图5所示。
在复筛菌株中选取对甜瓜疫霉菌和甜瓜枯萎菌均具有良好抑菌效果的菌株，命名为植物乳杆菌L.plantarum AB-1。
i.菌株胃肠液耐受性
模拟胃肠液的制备方法：将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将PBS灭菌后，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液。
胃肠液耐受性：将步骤f中筛选出的复筛菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌体悬液加入到4.5ml pH 2.5模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数，每个样品做4个平行。
菌株存活率计算公式
N1――菌株处理后活菌数；
N0――菌株初始活菌数。
j.菌株胆盐耐受性
将活化好的菌株按1％(V/V)接种量接入含牛胆汁MRS培养基中(0.3wt％Oxgall+0.2wt％巯基乙酸钠)，以不加牛胆汁的MRS为对照。将菌株置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至OD值增加0.3个单位为止。试验菌株耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株OD值增加0.3个单位所需时间的差值即为延滞期(LT,lag time)。每个菌株均做三个平行试验。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1抑制肠道致病菌，改善宿主的肠内微生物环境，具有整肠效果。本发明的植物乳杆菌L.plantarumAB-1具有耐酸性、耐胆汁酸性、耐过氧化氢酶和蛋白酶的稳定性，能存活于包括人在内的动物的胃肠器官内，从而对宿主的健康有利的微生物。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1是具有益生菌活性的益生菌，当以干燥的细胞形态或发酵产物形态用于人或动物的情况下，能够对宿主的肠道菌群产生有利的影响。
本发明提供含有本发明植物乳杆菌的用于预防和治疗肠道疾病的组合物及其用途，能够用于预防或治疗包括人在内的哺乳动物的肠道疾病，优选为包括牛、马、猪等家畜。肠道危害细菌感染、以及炎症性肠道疾病等都包括在上述“肠道疾病”中，例如，包括由病原性微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、梭菌等)引起的感染性腹泻、肠胃炎、炎症性肠道疾病、神经性肠炎综合症、小肠细菌过度生长、急性腹泻等，但是并不限于这些。
上述用于预防和治疗肠道疾病的组合物中含有的植物乳杆菌L.plantarum AB-1能够以活菌体或死菌体方式存在，但是优选为以活菌体方式存在。一般活菌体具有治疗并改善由肠道菌群的异常发酵而引起的诸多症状的效果，用于人以及动物时，能够密集、停留在肠内的消化管道壁上，从而起到使有害菌不能够停留的作用，并且产生乳酸来降低肠内的pH值，抑制有害细菌的繁殖。并且，所用的活菌体生成细菌素和过氧化物，从而能够抑制病原菌的繁殖，对负责吸收营养成分的肠绒毛的活动起到帮助作用。此外，能够生成帮助吸收、利用营养素的物质，对于动物来说改善其饲料转化率，还能够产生一种能够中和病原菌产生的毒性物质的物质。
对于上述本发明的用于预防或治疗肠道疾病的组合物的给药方式没有特别限定，但是优选为经口给药。虽然给药量根据肠道疾病的种类、疾病程度、年龄、性别、人种、治疗或预防目的等有所不同，但是一般情况下以成人为基础。
制备成上述各个剂型时，可以加入各个剂型的制备所需的并在药剂学可接受的载体或添加剂来制备。制备成具有典型的用于经口给药的剂型时，上述载体可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂以及防腐剂中的一种或多种，作为添加剂可以使用选自香料、维生素类以及抗氧化剂
上述载体以及添加剂只要是药剂学上允许使用的均可，优选地，作为稀释剂具体有乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇等，作为润滑剂有硬脂酸镁或滑石粉，作为粘合剂有聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，优选地，作为崩解剂有羧甲基纤维素钙、羧基乙酸淀粉钠、波拉克林钾或交联聚维酮，作为甜味剂有白糖、果糖、山梨醇或阿斯巴甜，作为稳定剂有羧甲基纤维素钠、环糊精、白蜡或黄原胶，作为防腐剂有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。
k.菌株复配发酵特性研究
用活化第二代的植物乳杆菌MRS培养液(1×109cfu/ml)以2wt％的比例和保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌粉(重量比例为1:1)以0.03wt‰的比例混合后接种到100g的全脂乳(12wt％全脂乳粉、7wt％白砂糖和81wt％无菌水混匀后经匀质和巴氏灭菌)中，并且以未添加植物乳杆菌的普通发酵酸奶为对照，37℃静置培养6h，取发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。取上述无细胞发酵上清液做抑菌试验测定植物乳杆菌在发酵酸奶中的抑菌活性，筛选能在酸奶中也具有广谱抑菌活性的植物乳杆菌。
把上述植物乳杆菌的复配发酵酸奶进行发酵特性的研究，分别测定6h时的的pH值、滴定酸度(TA)、粘度值、游离氨基氮含量(OPA法)和感官评定，以此来评价和筛选对发酵酸奶的发酵特性有较小影响作用的菌株，从而筛选出适于酸奶发酵的植物乳杆菌。
l.蛋白酶对菌株复配发酵上清抑菌活性的影响
取2ml上述复配发酵酸奶的无细胞上清液，先用浓盐酸将上清液的pH调节到2.5，加入3mg/ml的胃蛋白酶，37℃水浴2h后70℃灭酶20min，再将pH调节到8.0，加入1mg/ml的蛋白酶，37℃水浴2h。经过处理，最后把上清液的pH调节到原来的值，用以上处理后的无细胞上清液液做抑菌试验，筛选上清液的抑菌活性具有较好的蛋白酶耐受性的菌株进入益生特性试验。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1适于参加酸奶复配发酵，能增强酸奶的发酵和感官特性。
本发明的含有植物乳杆菌L.plantarum AB-1的组合物可以作为食品使用。例如发酵乳制品及其他健康保健食品中，还包括人们每日经常摄取的一般的食品。用于保健功能性食品的情况下，可以和食品学上允许的载体或添加剂一起制备成本技术领域公知的常规保健功能性食品的剂型，作为所述保健功能性食品例如可以制备成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、液体剂、浸膏、茶、果冻或饮料等。上述食品学允许使用的载体或添加剂，根据需要制备的剂型可以选择使用在本技术领域允许使用的公知的任一载体或添加剂。
酸奶或者发酵乳制品是以乳为主要原料，通过添加白砂糖、增稠剂、稳定剂、发酵剂等配料，再经均质、杀菌、冷却、发酵、灌装、冷藏后熟等工艺加工而成的一种发酵型乳制品。
常规酸奶的制备过程中，为了使酸奶具有口感细腻、稠厚感适宜、风味优良等特性，通常在制备中添加稳定剂和增稠剂。纵观市场中的酸奶，在其配料表中都可找到稳定剂和增稠剂的身影，典型的稳定剂和增稠剂包括：明胶、果胶、羟丙基二淀粉磷酸酯、琼脂等。
根据本发明的具体实施方式，本发明的发酵乳制品及其他健康保健食品中含有植物乳杆菌L.plantarum AB-1。本发明的发酵乳制品及其他健康保健食品中含有还包括适量(常规用量)的发酵剂。优选地，所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等中的一种或几种的组合。当所述发酵剂为上述几种菌种的组合时，在能够顺利进行反应的前提下，本领域一般技术人员可以对各菌种的用量比例进行调配和选择。
根据本发明的具体实施方式，本发明植物乳杆菌L.plantarum AB-1可以与适量其他常规发酵剂复配，用于乳制品及其他健康保健食品的发酵。优选地，所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等中的一种或几种的组合。当所述发酵剂为上述几种菌种的组合时，在能够顺利进行反应的前提下，本领域一般技术人员可以对各菌种的用量比例进行调配和选择。
上述本发明的含有植物乳杆菌L.plantarum AB-1的组合物还可以作为饲料添加剂或饲料来使用。上述饲料添加剂还可以使用包括选自柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸；或膦酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐；或多元酚、儿茶酸、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或多种。作为饲料使用的情况下，可以将上述组合物制备成常规饲料形态，可以包括常规饲料成分。
甜瓜枯萎病是由甜瓜枯萎病菌属尖孢镰刀菌甜瓜专化型从根部侵染的系统性病害。而疫霉属真菌对农作物、果树、林木、观赏植物、草本植物和灌木都有相当大的危害，可侵染这些植物的根、根颈、叶、花、果实，引起根腐、根颈腐、果腐、溃疡、萎蔫和斑点等症状，给农业生产带来严重的损失。目前对植物霉菌病害依靠化学防治，常用杀菌剂如瑞毒霉、杀毒矾、甲霜灵等药物。这些药剂价格昂贵，长期大量施用对人和环境造成极大危害。因此开发环保、高效的生物农药具有重要意义。本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1能够抑制甜瓜疫霉菌活性和甜瓜枯萎病，为开发生物农药提供了可能。
因此，本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-1在开发生物农药中的应用。本发明提供植物乳杆菌L.plantarum AB-1和包含植物乳杆菌L.plantarum AB-1的组合物可用于抑制、阻止或消除甜瓜枯萎菌或甜瓜疫霉菌引起的植物疾病或危害。
本发明含有植物乳杆菌L.plantarum AB-1农药组合物可根据施用加工成各种剂型，如粉剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、乳剂、乳油、浓乳剂、乳膏、糊剂、胶体剂、熏烟剂、熏蒸剂、烟雾剂、油剂、颗粒剂、微粒剂等。
本发明的植物乳杆菌L.plantarum AB-1及与之相关的技术方案带来如下有益效果：
(1)所述植物乳杆菌L.plantarum AB-1能抑制五种致病菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单细胞李斯特氏菌)的生长；
(2)植物乳杆菌L.plantarum AB-1在模拟胃肠液中有较高的存活率；
(3)植物乳杆菌L.plantarum AB-1为胆盐抗性菌株；
(4)植物乳杆菌L.plantarum AB-1发酵上清经蛋白酶处理后保持抑菌活性；
(5)植物乳杆菌L.plantarum AB-1能抑制甜瓜疫霉菌和甜瓜疫霉菌的生长，阻止或消除甜瓜疫霉病和甜瓜枯萎病。
本发明筛选获得的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-1于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.9653。
附图说明
图1：L.plantarum AB-1菌落形态图片缺少附图1和2
图2：L.plantarum AB-1菌体显微镜图片(X1000)
图3：L.plantarum AB-1系统发育树状图
图4：L.plantarum AB-1在三种条件下的抑菌圈大小(mm)
图5：L.plantarum AB-1对甜瓜枯萎菌和甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小(mm)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。
本发明中的试验菌株：所用的347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离、鉴定并保存，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的传统发酵食品中，347株植物乳杆菌的16S核糖体RNA信息都已上传到NCBI数据库。
实施例1：L.plantarum AB-1在全脂乳中发酵时的抑菌活性测定
植物乳杆菌L.plantarum AB-1发酵上清液的制备方法；把冻存管中的植物乳杆菌保藏液接种到5ml的MRS培养基中，震荡混匀，37℃恒温培养24h，以2％(V/V)的接种量连续活化两代，用活化第二代的植物乳杆菌MRS培养液(1×109cfu/ml)以2％的比例接种到全脂乳(11wt％全脂乳粉和89wt％无菌水混匀后经巴氏杀菌)中，37℃恒温培养24h，取发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22um微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
指示菌：以本实验室保藏的大肠杆菌O157:H7(Escherchia coliO157:H7)、鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri CMCC 51592)、金黄色葡萄球(Staphylococcusaureus ATCC12600)、单细胞里斯特氏菌(Listeria monocytogenesATCC15313)等5株肠道致病菌为指示菌。
用不同的液体培养基活化指示菌，LB液体培养基用于肠杆菌O157:H7的活化和传代；NB液体培养基用于鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌的活化和传代；BHI液体培养基用于单细胞里斯特氏菌的活化和传代；TSB液体培养基用于金黄色葡萄球菌的活化和传代，以2％的接种量连续活化三代用于抑菌试验。
其中，LB液体培养基的组成是胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，调节pH至7.0左右，121℃、15min灭菌。
NB液体培养基的组成是蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，调节pH至7.4左右，121℃、15min灭菌。
BHI液体培养基的组成是合成的脑心浸提液培养基(OXID公司)37g/L，调节pH至7.4左右，121℃、15min灭菌。
TSB液体培养基的组成是胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，调节pH至7.3左右，121℃、15min灭菌。
体外抑菌试验-琼脂打孔扩散法：将指示菌菌悬液稀释到106cfu/ml以1:100的量加到冷至45℃的灭菌MRS培养基中，摇匀后定量加入20mL/平皿，冷却制成含菌平板，在每个平板上用8mm打孔器均匀打出6个小孔并标注菌号。每孔加入100μL相对应植物乳杆菌全脂乳发酵上清，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。L.plantarum AB-1的单菌全脂乳发酵上清液的抑菌效果见图4。
从图4中可知L.plantarum AB-1的全脂乳发酵上清液对5株指示菌都有抑菌活性，且对大肠杆菌O157:H7(Escherchia coli O157:H7)、鼠伤沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri CMCC 51592)和单细胞里斯特氏菌(Listeria monocytogenesATCC15313)的抑菌圈分别为20.65±2.40mm、25.96±1.73mm、18.04±1.10mm和27.86±0.99mm，表现出有最强的抑菌活性，对金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus ATCC12600)的抑菌活性较小，为12.33±0.14mm。L.plantarum AB-1的不仅能抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、单细胞里斯特氏菌)，还能抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌O157:H7、鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌)的生长，表现出较强的广谱抑菌活性。
347株植物乳杆菌的抑菌情况统计结果如表2，其中只有7株菌对全部5株指示菌表现出广谱抑菌活性的实验结果可知，L.plantarum AB-1在广泛采集的347株植物乳杆菌中属于优良的具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌。
表2 347株植物乳杆菌对五株指示菌的抑菌情况汇总
注:‘高’、‘低’和‘不抑制’分别表示的抑菌圈大小为>12mm,8-12mm和<8mm。
实施例2：L.plantarum AB-1在复配发酵酸奶中的应用
a.植物乳杆菌复配发酵
用如实施例1制备的活化第二代的植物乳杆菌MRS培养液(1×109cfu/ml)以2wt％的比例和保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌粉(比例为1:1)以0.03wt‰的比例混合后接种到100g的全脂乳(12wt％全脂乳粉、7wt％白砂糖和81wt％无菌水混匀后经匀质和巴氏灭菌)中，并且以未添加植物乳杆菌的普通发酵酸奶为对照，37℃静置培养6h，取发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。取上述发酵无细胞上清液做抑菌试验测定其在发酵酸奶中的广谱抑菌活性。
把上述植物乳杆菌的复配发酵酸奶进行发酵特性的研究，分别测定6h时的pH值、滴定酸度(TA)、粘度值、游离氨基氮含量(OPA法)和感官评定，以此来评价和筛选对发酵酸奶的发酵特性有较小影响作用的菌株，从而筛选出适于酸奶发酵的植物乳杆菌。
b.酸度测定
准确称量5.00g复配发酵乳样品，置于100mL三角瓶中，加入40mL去CO2水，再加入0.5mL的0.5wt％的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1min内不消失为止。消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液的毫升数除以样品g数，再乘以100，即得酸度(°T)。
c.游离氨基氮含量测定
将100mM的硼砂50mL、20％(wt/wt)的十二烷基硫酸钠5mL、80mg的邻苯二甲醛(溶解于2mL的甲醇)和200μLβ-巯基乙醇混合后用去离子水定溶至100mL配制成反应试剂后。取50μL的样品混合于2mL的反应试剂中，在室温下，反应两分钟后用UV-1700(岛津，日本)在340nm处进行检测。用酪蛋白胰蛋白酶胨作为标准品来确定游离氨基氮含量。
表3：L.plantarum AB-1复配发酵特性
L.plantarum AB-1的发酵特征如表3所示，与对照组无L.plantarumAB-1参与发酵的普通酸奶相比，L.plantarum AB-1参与的复配发酵酸奶的pH值较低为4.38±0.00，粘度为1060±200.16cp,表现出较好的增粘特性，滴定酸度高于对照组为83.52±4.59°T，游离氨基氮的含量与对照差异不显著(P>0.05)，感官评价得分与普通发酵酸奶差异不显著，对发酵乳的感官品质无不良影响，综上所述L.plantarum AB-1适于参与酸奶复配发酵。
实施例3：L.plantarum AB-1复配发酵酸奶上清液抑菌活性的测定
用琼脂打孔扩散法测定上述L.plantarum AB-1的复配发酵上清液的对于5株指示菌的抑菌活性，抑菌效果见图4，具有广谱抑菌活性的其它8株植物乳杆菌也利用相同的方法测定抑菌活性，如表4。
如图4所示，L.plantarum AB-1的复配发酵上清液对指示菌大肠杆菌O157:H7、鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、单细胞里斯特氏菌的抑菌圈分别为18.00±1.69mm、15.22±0.80mm、12.31±1.39mm和19.46±1.40mm，相比单菌发酵抑菌活性有一定的减弱，但对金黄色葡萄球的抑菌圈大小与单菌发酵时相比差异不显著(P>0.05)，L.plantarum AB-1在复配发酵中依然有广谱抑菌特性。
另外，由表4可知，L.plantarum AB-1的复配发酵乳上清液的抑菌活性较其它8株菌和普通酸奶的抑菌活性要高。
实施例4：L.plantarum AB-1复配发酵上清液的蛋白酶耐受性
取2ml上述L.plantarum AB-1的复配发酵酸奶的无细胞上清液，先以3mg/ml的量加入胃蛋白酶，37℃水浴2h后70℃灭酶20min，再以1mg/ml的量加入胰蛋白酶，37℃水浴2h。经过处理，用以上处理后的无细胞上清做抑菌试验，抑菌效果见图4，具有广谱抑菌活性的其它8株植物乳杆菌也利用相同的方法测定抑菌活性，如表4。
如图4所示，L.plantarum AB-1的复配发酵上清经胃蛋白酶和胰蛋白酶连续处理4h后依然对5株指示菌表现出抑菌活性，证明其能在蛋白酶存在的环境中发挥作用。对比其它8株具有抑菌活性的植物乳杆菌和普通酸奶的抑菌活性(表4)可知，L.plantarum AB-1的复配发酵上清的抑菌活性具有优良的胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性，具备在人体胃肠道内应用的潜力。
表4 具有广谱抑菌活性的9株植物乳杆菌与普通酸奶抑菌活性比较
注：普通酸奶为本实验中利用Hanshen公司的商业发酵剂YC-X11(Lactobacillusdelbrueckii/Streptococcus thermophilus＝1:1)发酵得到的酸奶。
以上数据均表示的是抑菌圈大小(mm)。
数据上大写的角标表示的是植物乳杆菌复配发酵乳上清抑菌活性和普通酸奶抑菌活性的差异性，相同的大写字母表示差异不显著(P>0.05)。
数据上小写的角标表示的是植物乳杆菌复配发酵乳上清抑菌活性和经蛋白酶处理后上清液抑菌活性的差异性，相同的大写字母表示差异不显著(P>0.05)
实施例5：L.plantarum AB-1胃肠液耐受性
将PBS灭菌后，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，加入3.0mg/ml胃蛋白酶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液；将PBS灭菌后，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆汁，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胰液。
将复筛菌株活化培养两代，离心洗菌两次，收集菌体，取0.5ml复筛菌液加入到4.5ml的pH 2.5模拟人工胃液中，37℃消化3h，同时分别于0h和3h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。之后，取0.5ml已消化3h的人工含菌胃液加入到4.5ml的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于4h和8h用MRS琼脂培养基倾注法计数测定活菌数。
菌株存活率计算公式
N1――菌株处理后活菌数；
N0――菌株初始活菌数。
L.plantarum AB-1对胃肠液中的存活率见表5，在模拟胃液(pH 2.5)条件下存活3h后的活菌数呈现下降的趋势，在3h时的存活率为76.55％，对模拟胃液有一定的耐受性。L.plantarum AB-1菌株从pH 2.5人工胃液中37℃保持3h后，转入pH 8.0的人工肠液中保持8h，其结果如表5所示。从图中看出在pH 8.0的人工肠液中该菌株存活率具有上升趋势，4h时的存活率为98.21±0.45％，保持至8h时该菌株存活率为98.71±0.58％，呈现出一定的增长(P<0.05)。证明L.plantarum AB-1有较好的胃肠液耐受性。
表5：L.plantarum AB-1在胃肠液中的存活率
实施例6：L.plantarum AB-1的胆盐耐受性
将活化好的L.plantarum AB-1的发酵液按1％接种量接入含牛胆汁MRS培养基中(0.3％Oxgall+0.2％巯基乙酸钠)，以不加牛胆汁的MRS为对照。将菌株置于37℃水浴培养，每小时取样于620nm测定其OD值，至OD值增加0.3个单位为止。试验菌株耐受胆盐的能力以延滞期的长短为评价标准，其中试验组与空白组菌株OD值增加0.3个单位所需时间的差值即为延滞时间(LT,lag time)。表6是L.plantarum AB-1和其它8株具有广谱抑菌活性植物乳杆菌胆盐耐受性比较。
由表6可知，L.plantarum AB-1的延迟时间为0.369±0.066h，根据Gilliland et al.(1984)的判定方法，菌株L.plantarum AB-1为胆盐耐受性菌株，对胆盐有较好的耐受性，与其他8株已经公开的植物乳杆菌相比，在具有广谱抑菌活性的9株菌中L.plantarum AB-1具有最好的胆盐耐受性。
表6：9株植物乳杆菌胆盐耐受性
注：数据上小写的角标表示的是不同的植物乳杆菌胆盐耐受性延迟时间之间的差异性，相同的大写字母表示差异不显著(P>0.05)。
实施例7：L.plantarum AB-1的抑制霉菌活性
将在PDA培养基上活化好的甜瓜疫霉菌用PBS缓冲液洗下来制成105cfu/mL的孢子菌悬液，把菌悬液按1％(V/V)的量接入PDA培养基中，震荡混匀，然后把含菌培养基倒到培养皿中，制成含菌平板。
在每个平板上用7mm打孔器均匀打出2个小孔并标注植物乳杆菌的菌号，每孔加入100μL相对应植物乳杆菌MRS发酵上清液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小见图5。
如图5所示，利用琼脂扩散法检测到L.plantarum AB-1对甜瓜枯萎和甜瓜疫霉菌的抑菌圈大小分别为15.54±2.80mm和15.44±3.05mm，在未公布的347株L.plantarum的抑霉菌数据中属于中等水平(在347株植物乳杆菌中，126株菌对甜瓜枯萎菌的抑菌圈小于L.plantarum AB-1，74株菌对甜瓜疫霉的抑菌圈小于L.plantarum AB-1)，此结果表明该菌株在抑制霉菌生长的方面具有一定的开发价值。

Claims (6)

1.一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB-1，该菌株于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9653。
2.含有如权利要求1所述的植物乳杆菌的组合物。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌抑制致病菌的应用，其特征在于所述制致病菌为：
(1)大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单细胞李斯特氏菌；和
(2)甜瓜枯萎菌和甜瓜疫霉菌。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌作为发酵剂或食品添加剂在食品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述食品是发酵食品。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌在植物生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
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