CN105494630A - 一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法。本发明公开了一株具有很强抑菌能力的植物乳杆菌WLPL04保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？NO:M？2015501，将其用于制成风味酸奶的方法。本发明植物乳杆菌分离于健康妇女母乳，为革兰氏阳性菌，有优异的抑菌能力，优秀的耐酸耐胆盐性，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的对小肠上皮细胞的粘附，改善宿主胃肠道健康。同时，在酸奶制备中也可抑制酵母菌霉菌的污染，从而保证酸奶的质量。

Description

一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域，公开一种新型的抑菌性很好的植物乳杆菌及其制备风味酸奶的应用。

背景技术

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是一类厌氧，不产孢子的革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色不透明，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌与人类的生活密切相关，被广泛用于乳制品、肉类、蔬菜以及果汁中，能通过胃肠道并定植于肠道发挥益生作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑菌性能优良的植物乳杆菌。

本发明从健康的妇女母乳中分离出植物乳杆菌，具有良好的益生性能，极强的抑菌性，良好的耐酸耐胆盐性，耐胃肠液和抗药性；同时可以抑制致病菌对小肠结肠细胞的粘附，从而使致病菌无法在小肠内定殖，减少肠炎疾病的发生，促进肠道健康，发挥益生菌的优良性能。

本发明抑菌植物乳杆菌WLPL04(LactobacillusplantarumWLPL04)，于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，编号：CCTCCNO:M2015501。

本发明抑菌植物乳杆菌WLPL04可以在MRS琼脂平板培养基上生长，为革兰氏阳性杆菌，属于兼性厌氧生长，不产芽孢。为维持时间稳定地保存本发明植物乳杆菌的优良性能，将其保存在含有15％甘油的混合保存液中，于-80℃冻存，或将其保存在20％的脱脂乳中进行冻干保存。

为了对微生物进行鉴定和分类，对本发明所述用植物乳杆菌进行了16SrRNA碱基序列分析，结果为，与植物乳杆菌标准菌株(LactobacillusplantarumstrainWCFS1)显示出最高的同源性(99％)，显示出与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。因此，将此微生物鉴定为植物乳杆菌，并命名为植物乳杆菌WLPL04。于2015年8月31日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015501。植物乳杆菌WLPL04的测序结果显示的碱基序列如下：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCT。

本发明的植物乳杆菌WLPL04作为益生菌，不仅具有极强抑菌性，且有良好的耐酸耐胆盐性，能抑制致病菌在肠道上的定殖，促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。

进一步的，本发明公开了：

酸奶发酵剂，其特征在于包括植物乳杆菌WLPL04；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501。

所述酸奶发酵剂，还包括保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌；按质量比植物乳杆菌WLPL04：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1:2:3。

利用本发明发酵剂制备酸奶，能改善酸奶的口感，抑制酵母和霉菌的生长，从而延缓酸奶的变质。

一种酸奶的制备方法，包括如下步骤：

水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；冷却：室温下冷却至45℃；接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；发酵：置于38℃发酵10小时。

益生菌风味酸奶的制备工艺，包括如下步骤：

1)将100g红枣汁或核桃汁或水蜜桃汁或草莓汁或花生乳与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀；

2)杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物；

3)接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

4)发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵；

5)后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h即得终产品。

所述红枣汁的制备：红枣预先煮好清洗干净去核，按质量红枣：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，红枣汁冷藏备用。

所述核桃汁的制备：选择质量较好的核桃仁放入150℃的烘箱中烘烤15-30min至呈现暗红色、去除生异味、散发出焦香气为止，然后在7％氢氧化钠溶液中煮沸15min除去核桃仁上的褐色皮层后待用；核桃仁放入榨汁机中，放入五倍质量的水，制备核桃汁。

所述水蜜桃汁的制备：选择质量好的水蜜桃清洗干净去核，按质量水蜜桃：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，水蜜桃汁冷藏备用。

所述草莓汁的制备：选择质量好的草莓清洗干净，按质量草莓：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，草莓汁冷藏备用。

所述花生乳的制备:选择子粒饱满,新鲜的花生仁,剔除霉烂变质及其它杂质。置于120℃烘箱,烘烤20min,产生花生香味并去皮。将去皮的花生仁在0.1％的NaHCO₃溶液中浸泡1h～2h,以去除有害成分和软化组织,加水磨浆(花生与水的质量比例为1:10),过滤制得花生乳。

进一步的，利用本发明酸奶可以制成酸奶饮料：

一种芒果果粒酸奶饮料的制备方法，包括如下步骤：

(1)水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

(2)杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

(3)冷却：室温下冷却至45℃；

(4)接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

(5)发酵：置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶；

(6)芒果果粒的制备：选择质量好的芒果清洗干净，芒果去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用；

(7)发酵奶的处理：将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用；

(8)胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用；

(9)酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的芒果果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值；

(10)均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)；

(11)杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)；

(12)冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

步骤(9)用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。

一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法，包括如下步骤：

(1)水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

(2)杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

(3)冷却：室温下冷却至45℃；

(4)接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

(5)发酵：置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶；

(6)胡萝卜汁的制备：选择新鲜的胡萝卜切去根须及蒂把，以清水去掉泥沙，用4％磷酸钠、0.5％磷酸氢二钠与0.5％焦磷酸钠组成复合磷酸盐去皮液在沸腾条件下热烫胡萝卜2min-3min，再经快速流动的冷水冲洗，完全脱去胡萝卜表皮；胡萝卜汁中-胡萝卜素的含量是影响产品质量的重要因素，为提高胡萝卜中-胡萝卜素的溶出率，将脱皮后的胡萝卜切成1cm²-1.5cm²的小块，放入84℃质量分数为1.4％柠檬酸溶液中，热烫18min；将煮制好的胡萝卜放入一定比例的水中，打浆，胡萝卜浆经过60目筛过滤后备用；

(7)发酵奶的处理：将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用；

(8)胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用；

(9)酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的胡萝卜汁混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值；

(10)均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)；

(11)杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)；

(12)冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

步骤(9)用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。

一种猕猴桃果粒酸奶饮料的制备方法，包括如下步骤：

(1)水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

(2)杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

(3)冷却：室温下冷却至45℃；

(4)接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

(5)发酵：置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶；

(6)猕猴桃果粒的制备：选择质量好的猕猴桃清洗干净，去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用；

(7)发酵奶的处理：将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用；

(8)胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用；

(9)酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的猕猴桃果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值；

(10)均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)；

(11)杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)；

(12)冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

步骤(9)用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。

一种草莓果粒酸奶饮料的制备方法，包括如下步骤：

(1)水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

(2)杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

(3)冷却：室温下冷却至45℃；

(4)接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

(5)发酵：置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶；

(6)草莓果粒的制备：选择质量好的草莓清洗干净，草莓去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用；

(7)发酵奶的处理：将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用；

(8)胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用；

(9)酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的草莓果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值；

(10)均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)；

(11)杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)；

(12)冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

步骤(9)用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。

有益效果：本发明植物乳杆菌WLPL04相比常规植物乳杆菌具有极强的体外抑菌性能，良好的耐酸耐胆盐能力，对胃肠液的耐受能力，以及抑制致病菌在肠道定殖的能力。本发明所述植物乳杆菌对抗生素具有一定的耐受性，其生长代谢产物能抑制肠道致病菌的生长。从另一个侧面来说，本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物，还可以用于食品和饲料的防腐。

附图说明

图1植物乳杆菌WLPL04的生长曲线及产多糖曲线

图2植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌标准株1.1856发酵上清液对致病菌的抑菌圈直径

图3植物乳杆菌WLPL04体外模拟胃肠道转运后的存活率

图4植物乳杆菌WLPL04对低酸高胆盐耐受性

图5植物乳杆菌WLPL04抑制致病菌对Caco-2细胞的粘附

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发明，而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。

实施例1：植物乳杆菌WLPL04的分离与鉴定

植物乳杆菌WLPL04是从健康妇女的母乳中分离。将母乳以10^-1的梯度稀释，涂布于MRS(加溴甲酚紫作为指示剂)琼脂平板上，厌氧培养24h，挑取使培养基变黄的单菌落，在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后，平板培养，用接种环挑取单一的菌落作为模板，进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序。

将16SrRNA碱基序列分析测序碱基序列与数据库进行比对分析，所分离菌菌株的碱基序列与植物乳杆菌标准菌株(LactobaccillusplantarumWCFS1)具有很高的同源性(99％)，因此被确认为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌WLPL04，于2015年8月31日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015501。

如图1生长曲线所示，植物乳杆菌WLPL04具有好的生长性能，生长速度快，10h时进入稳定期，稳定期长，胞外多糖产量高，24h时胞外多糖产量最高。

实施例2：发酵上清液的抑菌能力

将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37℃厌氧发酵18h，活化两次。离心得上清液。将牛津杯置于MRS琼脂平板上，加入200uL发酵上清液。厌氧培养24h，用卡尺测定其抑菌圈的直径。

实验结果：

如图2所示植物乳杆菌WLPL04的发酵上清液对七种食源性致病菌都具有抑制作用。对铜绿假单胞菌的抑制效果最明显。抑菌圈直径分别为，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，33.07±0.15mm)，单增李斯特菌(L.monocytogenes，27.00±0.10mm)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium，24.63±0.42mm)，大肠杆菌(E.coliO157:H7，17.50±0.40mm)，宋内氏志贺氏菌(S.sonnei，22.77±1.16mm)，蜡样芽胞杆菌(B.cereus，12.60±0.46mm)，和金黄色葡萄球菌(S.aureus，14.30±0.17mm)。植物乳杆菌标准株1.1856的发酵上清液对七种食源性致病菌抑制作用如下：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，15.93±1.04mm),单增李斯特菌(L.monocytogenes，19.03±0.15mm)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium，10.57±0.49mm)，大肠杆菌(E.coliO157:H7，10.63±0.15mm)，宋内氏志贺氏菌(S.sonnei，13.03±0.12mm)，蜡样芽胞杆菌(B.cereus，9.13±0.06mm)，和金黄色葡萄球菌(S.aureus，8.93±0.06mm)。从结果可以看出，植物乳杆菌WLPL04发酵上清比植物乳杆菌标准株1.1856发酵上清的抑菌能力显著更强。

实施例3：耐酸耐胆盐评价

将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37℃厌氧发酵18h，活化两次。以1％接种量分别接种于pH为6.5,4.5,3.5和2.5及胆盐浓度为0％,0.15％,0.30％,0.45％的MRS液体培养基中，测定初始活菌数以及随后的3h，6h，12h和24h的活菌数。

实验结果：

如图3所示，植物乳杆菌在pH4.5,3.5MRS中培养3,6,12,or24h后生长良好，但是在pH2.5MRS培养6h后活菌数下降2.34logcfu/mL。胆盐情况下，植物乳杆菌WLPL04的活菌数变化稳定，24h时，活菌数会降到10⁴。这说明植物乳杆菌WLPL04耐酸耐胆盐性良好。

实施例4：体外模拟胃肠液转运

将植物乳杆菌接种于模拟胃液，pH调为3.0，孵育90min，计数活菌数和存活率，将培养液离心用生理盐水洗一次后加入模拟十二指肠液，孵育10min，计数活菌数和存活率，将培养液离心用生理盐水洗一次，离心加入模拟肠液，分别孵育60min和120min，计数活菌数和存活率。

实验结果：

见图4，结果表明，植物乳杆菌WLPL04在经胃液，十二指肠液连续孵育后菌体数量级分别下降了0.40logcfu/mL和1.07logcfu/mL，经肠液孵育2h后，菌体活菌数增加到1.30×10⁸cfu/mL，高于益生菌在胃肠道中定植和发挥益生功能的最低要求溶度(10⁶cfu/mL)。综合耐酸耐胆盐性实例和模拟胃肠转运实例，可得出植物乳杆菌WLPL04具有好的耐受性，在低pH和胆汁中能存活，顺利通过胃和十二指肠，保持足够高的活力到达小肠。

实施例5：抑制致病菌对Caco-2粘附

将瓶中培养好的Caco-2细胞接入到6孔细胞培养板中培养至长成单层细胞，进行试验。采用竞争、排斥和置换试验来研究乳杆菌对病原菌的黏附抑制作用。竞争试验：每孔中加入800μL的DMEM培养液(不含抗生素)，同时加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×10⁷cfu/孔)和100μL的病原菌(5×10⁷cfu/孔)；排斥试验：每孔中加入900μL的DMEM培养液，先加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×10⁷cfu/孔)，培养90min后，再100μL的病原菌(5×10⁷cfu/孔)继续培养90min；置换试验:每孔中加入900μL的DMEM培养液,加入100μL的病原菌(5×10⁷cfu/孔)，再加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×10⁷cfu/孔)继续培养90min。试验结束后，计数活菌和抑制粘附率。

实验结果：

见图5，结果表明，竞争实验中植物乳杆菌WLPL04对致病菌金黄葡萄球菌(S.aureusCMCC26003),大肠杆菌(E.coliO157:H7)and鼠伤寒沙门杆菌(S.typhimuriumATCC13311)粘附抑制率分别为40.30％,35.51％和8.10％；抑制试验中，植物乳杆菌WLPL04对致病菌粘附抑制率分别为42.60％，62.50％和59.81％；替代实验中植物乳杆菌WLPL04对致病菌粘附抑制率分别为52.88％，75.23％和39.97％。植物乳杆菌WLPL04能够抑制食源性致病菌对肠细胞的粘附，从而抑制致病菌在小肠的定殖，维持肠道健康。

实施例5：酸奶的制作工艺

水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

冷却：室温下冷却至45℃；

接种：接种分为三组，

一组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3)，不添加植物乳杆菌；

二组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉，两者比例为2:3)+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；植物乳杆菌WLPL04为抑菌性能好的植物乳杆菌WLPL04，于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，编号：CCTCCNO:M2015501；

三组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3)+1g植物乳杆菌ATCC1.1856冻干粉；

发酵：置于38℃的恒温酸奶机中发酵10小时得凝固型酸奶。

为方便后续检测，将酸奶置于4℃贮存20天；进行理化指标的测定和感官评定。

1)酸度的测定

称取5.00g样品，置于150ml锥形瓶中，加40ml经煮沸放冷的水，混匀，加入2-3滴酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色30秒内不褪色，记录消耗的NaOH体积，乘以20，即为酸乳的酸度(°T)。分别于第1天，第10天和第20天测定酸度的变化，每个样品每次重复测定三次，取平均值。

结果表明，用植物乳杆菌WLPL04发酵酸奶能减缓其贮藏过程酸度的变化速度，增强其在贮藏过程中的稳定性。

2)黏度的测定

将酸奶样品在4℃贮藏，分别于第1天，第10天和第20天测定黏度值的变化。测量时样品先经回温后，再用NDJ-9S黏度计进行测量，采用2号转子，转速6r/min，测定温度18℃--23℃，重复测定3次，取平均值。

结果表明，用植物乳杆菌WLPL04可提高酸奶的粘度。对比酸奶在4℃条件下储存10d和20d后的粘度值，发现在贮藏期间酸奶黏度值均略有下降，但变化并不显著。说明仅从粘度这一指标来看，植物乳杆菌WLPL04对酸奶贮藏特性有积极影响。

3)持水率(WHC)测定

离心管重w₀，放入酸奶样品重W1于离心管中，以4000r/min离心10min，静置10min后除去析出乳清(上清液)，并称质量记为w₂。按下式计算持水率。分别于第10天和第20天测定持水率的变化，每个样品每次重复测定三次，取平均值。

结果表明，用植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌ATCC1.1856都可提高酸奶的持水性。但是添加了植物乳杆菌WLPL04作为发酵剂的酸奶具有相对更高的持水率。酸奶持水能力对酸奶货架期内的产品质量影响很大,特别是对那些与口感密切相关的质构指标，稳定的持水能力有助于稳定产品质量。

4)感官评定

由10名从事食品行业的专业人员，6名消费者共同从色泽(10分)、组织状态(50分)、风味(40分)三个方面进行评定，并对组织状态中的黏稠度(20分)做单独评定，所给出的评议是在相互隔离的情况下进行，避免了测评人员的相互影响，如表1。

表1感官评定和粘稠度评定评分参考表

如表2所示，植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌ATCC1.1856都可以明显提高酸奶的感官品质，其中组织状态变化显著，风味略有变化，色泽保持不变。植物乳杆菌WLPL04的添加量为1％(1g：100ml)时，酸奶的组织细腻、凝块细小、均匀滑爽，无气泡、无乳清析出，酸甜适度、发酵香味和奶香味浓厚，感官品质最好，对比于传统酸奶发酵剂或植物乳杆菌ATCC1.1856，添加植物乳杆菌WLPL04作为辅助发酵剂，不仅能够改善酸奶的风味质构，还能提高酸奶的贮存特性。

表2感官评价结果

实例6：WLPL04在酸奶发酵过程中对酵母及霉菌的抑制作用

称取25g发酵酸奶样品至盛225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。

1、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中，另换一支1ml无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液按上部操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管。

2、根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

3、及时将15ml～20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

4、培养待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，并在观察期内记录霉菌及酵母菌数。

5、菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位(colonyformingunits，CFU)表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

实验结果表明，与添加商业生物保鲜菌(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)比WLPL04对酵母的抑制率分别为4.76％，4.94％，6.85％,添加WLPL04能明显抑制酵母生长且抑制效果优于商业生物保鲜菌酸奶。添加WLPL04可抑制43.67％霉菌，高于商业添加菌的抑制率(38.67％)。以上实验结果表明，植物乳杆菌WLPL04可以改善酸奶的口感，抑制酵母和霉菌的生长，从而延缓酸奶的变质。

实施例7益生菌风味红枣酸奶的制备工艺

取实施例5所优化的菌种组合(第二组：按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1:2:3)进行酸奶发酵，步骤如下：

1、红枣汁的制备：红枣预先煮好清洗干净去核，按质量红枣：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，红枣汁冷藏备用。

2、将制得的100g红枣汁与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀。

3、杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物。

4、接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀。

5、发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵。

6、后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h，待酸奶进一步生成，香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。

实施例8益生菌风味核桃酸奶的制备工艺

取实施例5所优化的菌种组合(第二组：按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1:2:3)进行酸奶发酵，步骤如下：

1、核桃汁的制备：选择质量较好的核桃仁放入150℃的烘箱中烘烤15-30min至呈现暗红色、去除生异味、散发出焦香气为止，然后在7％氢氧化钠溶液中煮沸15min除去核桃仁上的褐色皮层后待用。核桃仁放入榨汁机中，放入五倍质量的水，制备核桃汁。

2、将制得的100g核桃汁与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀。

3、杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物。

4、接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀。

5、发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵。

6、后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h，待酸奶进一步生成，香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。

实施例9益生菌风味水蜜桃酸奶的制备工艺

取实施例5所优化的菌种组合(第二组：按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1:2:3)进行酸奶发酵，步骤如下：

1、水蜜桃汁的制备：选择质量好的水蜜桃清洗干净去核，按质量水蜜桃：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，水蜜桃汁冷藏备用。

2、将制得的100g水蜜桃汁与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀。

3、杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物。

4、接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀。

5、发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵。

6、后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h，待酸奶进一步生成，香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。

实施例10益生菌风味草莓酸奶的制备工艺

取实施例5所优化的菌种组合(第二组：按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1:2:3)进行酸奶发酵，步骤如下：

1、草莓汁的制备：选择质量好的草莓清洗干净，按质量草莓：水＝1：1的比例投入到榨汁机中榨汁，之后用纱布过滤，除去杂质和纤维素，草莓汁冷藏备用。

2、将制得的100g草莓汁与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀。

3、杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物。

4、接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀。

5、发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵。

6、后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h，待酸奶进一步生成，香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。

实施例11益生菌风味花生乳酸奶的制备工艺

取实施例5所优化的菌种组合进行酸奶发酵，步骤如下：

1、花生乳的制备:选择子粒饱满,新鲜的花生仁,剔除霉烂变质及其它杂质。置于120℃烘箱,烘烤20min,产生花生香味并去皮。将去皮的花生仁在0.1％的NaHCO₃溶液中浸泡1h～2h,以去除有害成分和软化组织,加水磨浆(花生与水的质量比例为1:10),过滤制得花生乳。

2、将制得的100g花生乳与100g鲜牛奶混匀，加入14g的白砂糖进行调配、混匀。

3、杀菌：将混合液加热至90℃-100℃，维持5-10min，杀死其中的有害微生物。

4、接种：灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃，在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌：嗜热乳杆菌：植物乳杆菌WLPL04＝2:3:1)，混合均匀。

5、发酵：将装好的酸奶放入恒温箱，42℃下发酵7h，酸奶完全凝固时终止发酵。

6、后熟：将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h，待酸奶进一步生成，香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。

实施例12芒果果粒酸奶饮料的制备工艺

取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料，步骤如下：

1、芒果果粒的制备：选择质量好的芒果清洗干净，芒果去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用。

2、发酵奶的处理：将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用。

3、胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用。

4、酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的芒果果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低，一般以30℃以下较为适宜)。

5、均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。

6、杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)。

7、冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

实施例13胡萝卜汁酸奶饮料的制备工艺

取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料，步骤如下：

1、胡萝卜汁的制备：选择新鲜的胡萝卜切去根须及蒂把，以清水去掉泥沙，用4％磷酸钠、0.5％磷酸氢二钠与0.5％焦磷酸钠组成复合磷酸盐去皮液在沸腾条件下热烫胡萝卜2min-3min，再经快速流动的冷水冲洗，完全脱去胡萝卜表皮。胡萝卜汁中-胡萝卜素的含量是影响产品质量的重要因素，为提高胡萝卜中-胡萝卜素的溶出率，将脱皮后的胡萝卜切成1cm²-1.5cm²的小块，放入84℃质量分数为1.4％柠檬酸溶液中，热烫18min。将煮制好的胡萝卜放入一定比例的水中，打浆，胡萝卜浆经过60目筛过滤后备用。

2、发酵奶的处理：将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用。

3、胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用。

4、酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的胡萝卜汁混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低，一般以30℃以下较为适宜)。

5、均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。

6、杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86～88℃、15分钟)。

7、冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

实施例14猕猴桃果粒酸奶饮料的制备工艺

取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料，步骤如下：

1、猕猴桃果粒的制备：选择质量好的猕猴桃清洗干净，去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用。

2、发酵奶的处理：将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用。

3、胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用。

4、酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的猕猴桃果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低，一般以30℃以下较为适宜)。

5、均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。

6、杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86～88℃、15分钟)。

7、冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

实施例15草莓果粒酸奶饮料的制备工艺

取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料，步骤如下：

1、草莓果粒的制备：选择质量好的草莓清洗干净，草莓去皮破碎成4-6mm的果块，冷藏备用。

2、发酵奶的处理：将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用。

3、胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用。

4、酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的草莓果粒混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低，一般以30℃以下较为适宜)。

5、均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。

6、杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86～88℃、15分钟)。

7、冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

Claims (2)

1.一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)水化：将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合，在40-50℃下水化45min；

(2)杀菌：在65℃预热5min，然后在98℃下热处理10min；

(3)冷却：室温下冷却至45℃；

(4)接种：接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉；所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉，两者质量比例为2:3；所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2015501；

(5)发酵：置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶；

(6)胡萝卜汁的制备：选择新鲜的胡萝卜切去根须及蒂把，以清水去掉泥沙，用4％磷酸钠、0.5％磷酸氢二钠与0.5％焦磷酸钠组成复合磷酸盐去皮液在沸腾条件下热烫胡萝卜2min-3min，再经快速流动的冷水冲洗，完全脱去胡萝卜表皮；胡萝卜汁中-胡萝卜素的含量是影响产品质量的重要因素，为提高胡萝卜中-胡萝卜素的溶出率，将脱皮后的胡萝卜切成1cm²-1.5cm²的小块，放入84℃质量分数为1.4％柠檬酸溶液中，热烫18min；将煮制好的胡萝卜放入一定比例的水中，打浆，胡萝卜浆经过60目筛过滤后备用；

(7)发酵奶的处理：将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳，均质压力为15-18Mpa)，最后称取100g发酵奶液，备用；

(8)胶液的配制：量取300mL、70-80℃的纯净水，然后加入21g的白砂糖，0.09g的山梨酸钾，0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂，混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分，然后立即冷却至30℃以下，备用；

(9)酸化：称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀，加入120g的胡萝卜汁混匀，然后加入300mL、35℃纯净水，再用柠檬酸调pH值；

(10)均质：将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL，调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)；

(11)杀菌：将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86～88℃、15分钟)；

(12)冷却，成品：使产品冷却至容器中心温度40℃以下，冷藏备用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(9)用柠檬酸调pH值，充分搅拌，将整个溶液的调整为3.8-4.2。