CN114854622B - 一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株具有广谱抑菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌LPP95及其应用，LPP95保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 20211068。该植物乳杆菌LPP95具有广谱的抗菌活性，对多种霉菌和致病细菌均表现出较强的抑制能力，可用于食品、医药等领域以制备抗菌药物或食品发酵剂或防腐产品。本发明还利用LC‑MS系统对LPP95产生的抗菌物质进行了鉴定，共鉴定出11种抗菌物质，均为有机酸类小分子物质，其中(E)‑3‑吲哚丙烯酸首次在乳酸菌发酵上清液中发现且经实验证实其具有抗真菌作用。LPP95的发酵液具有良好的热稳定性以及不被蛋白酶降解失活，稳定性好。

Description

一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物 的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
真菌是一类生命力极强的腐败微生物，全世界每年大约有5％-10％的粮食、饲料、食品等产品受霉菌污染，所造成损失达数千亿美元。酸奶营养成分丰富，极易被人体吸收，越来越受到消费者的青睐，然而由于霉菌的污染，不仅影响了消费者对酸奶产品的可接受性，而且保质期较短以及后酸化成为限制酸奶发展的重要因素。馒头营养丰富，含水量较高，储存期间很容易受到细菌和霉菌的作用而腐败，货架期极短等因素都制约着馒头工业化生产的发展步伐。面包含有丰富的碳水化合物、蛋白质等营养物质，是霉菌生长的天然培养基。烘焙面包的高温可有效杀灭原料中绝大部分霉菌，但原料自带污染、制作过程灭菌不彻底、包装前冷却不充分、运输过程中的二次污染等，都可能引起面包被霉菌再次污染。面包的霉菌腐败一直备受食品生产企业和消费者的关注。此外，霉菌可产生霉菌毒素，能引起人和动物中毒，威胁人体健康，具有致癌致畸等危害。
目前，化学防腐剂的应用有效地控制了腐败变质，但化学防腐剂具有副作用，如致癌等，国家对有害食品添加剂发布禁令，限制或限量使用。因此，新型安全高效、环保、健康的天然抑菌物质逐渐替代传统的化学防腐剂。乳酸菌作为公认的安全级的可食用菌，而且发酵条件简单、操作方便、质量和数量可保证、安全环保，具有成为生物发酵剂同时能抗真菌的潜质。它们能产生多种抑菌物质，包括有机酸、乳酸菌素、二氧化碳、环状二肽等化合物，故能有效抑制致病菌和腐败菌的生长。
发明内容
本发明的一方面目的在于提供一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPP95，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO:M 20211068。
所述植物乳杆菌LPP95的抗菌代谢产物包括反式肉桂酸、柠檬酸、(E)-3-吲哚丙烯酸、 DL-4-羟基苯乳酸、反式-2-羟基肉桂酸、苹果酸、琥珀酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸。
本发明的另一方面目的在于提供一种菌剂，其活性成分包含前述的植物乳杆菌LPP95 或LPP95的发酵液。
所述菌剂为冷冻干燥粉剂、发酵液或发酵液浓缩液。
本发明的再一方面目的在于提供所述植物乳杆菌LPP95或前述的菌剂在制备食品发酵剂或食品添加剂中的应用。
在所述应用技术方案中，所述食品包括酸奶、发酵谷物、泡菜或饮料；优选所述发酵谷物包括馒头、包子、面包、蛋糕。
本发明的再一方面目的在于提供所述植物乳杆菌LPP95或前述的菌剂在制备食品防腐剂或食品抗菌剂或抗菌药物中的应用。
在上述应用技术方案中，所述应用方式为所述植物乳杆菌LPP95或所述菌剂抑制霉菌和致病细菌的生长。
所述霉菌为青霉、黑曲霉、葡枝根霉、黄曲霉、毛霉中的一种或多种，所述致病细菌为大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
本发明最后一目的是提供(E)-3-吲哚丙烯酸在制备抗真菌试剂中的应用。
在上述应用技术方案中，所述真菌为青霉。
本发明的有益效果在于：本发明筛选到的植物乳杆菌LPP95，经实验证实，LPP95菌体及其代谢物具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性，对青霉、黑曲霉、葡枝根霉、黄曲霉、毛霉、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均表现出较强的抑制能力，可用于食品、医药等领域以制备抗菌药物或食品发酵剂、防腐产品；经实验证实，LPP95的发酵液具有良好的热稳定性以及不被蛋白酶降解失活，蛋白酶对菌株LPP95的发酵液的抑菌活性没有显著性影响，稳定性好。本发明还利用LC-MS 系统对该菌株产生的抗菌物质进行了鉴定，共鉴定出11种抗菌物质，均为有机酸类小分子物质，其中(E)-3-吲哚丙烯酸首次在乳酸菌发酵上清液中发现且经实验证实其具有抗真菌作用。
附图说明
图1为植物乳杆菌LPP95对青霉菌的抑制活性；
图2为植物乳杆菌LPP95菌落形态图(A)、革兰氏染结果(B)及SEM图(C)；
图3为植物乳杆菌LPP95的API 50CH反应结果；
图4为植物乳杆菌LPP95的电泳图(A)和系统发育树(B)；
图5为植物乳杆菌LPP95溶血性检测结果(A：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)；B：植物乳杆菌LPP95)；
图6为植物乳杆菌LPP95的CFS对温度的耐受性；
图7为植物乳杆菌LPP95的CFS对不同酶的稳定性；
图8为植物乳杆菌LPP95的CFS对pH的敏感性；
图9为SEM观察植物乳杆菌LPP95的CFS处理后孢子表面形态变化；
图10为植物乳杆菌LPP95的CFS处理不同时间对AKP泄漏的影响；
图11为植物乳杆菌LPP95的CFS处理不同时间对核酸泄漏的影响；
图12为植物乳杆菌LPP95的CFS处理青霉孢子PI染色反映细胞膜完整性；
图13为接种植物乳杆菌LPP95的酸奶防霉加速实验第8天结果；
图14为接种植物乳杆菌LPP95的酸奶中的青霉在4℃下的生长情况(第28天)；
图15为植物乳杆菌LPP95对贮藏2d的酸奶储能模量(A)、损耗模量(B)和tan δ(C)的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；如无特殊说明，所用生物、化学试剂均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。
主要试剂来源或成分：
MRS固体培养基、PDB肉汤、PDA固体培养基、MRS肉汤、LB固体培养基均为本领域常规培养基/液。
青霉CCTCC AF 93302、黑曲霉CCTCC AF 91006、葡枝根霉CCTCC AF 206008、黄曲霉CCTCC AF 93328、毛霉CCTCC AF 93267、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌CCTCC AB 2014173、蜡样芽胞杆菌CMCC63301、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115，以上菌的标准菌株均可通过商购获得。
实施例1、抗真菌乳酸菌的筛选与鉴定
1实验材料
从重庆市居民家中自制泡菜中分离筛选得到的乳酸菌，命名为菌株LPP95。
菌株LPP95的保藏信息如下：
将菌株LPP95于2021年8月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2021年8月23日；保藏编号：CCTCC NO:M 20211068；分类命名为：植物乳杆菌LPP95(Lactobacillus plantarumLPP95)。
2实验方法
2.1青霉菌孢子悬浮液的制备
将青霉菌(Penicillium sp.)接种于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)固体培养基上 28℃培养5d，直至大量孢子生成，用含有0.05％吐温-80的无菌水冲洗平板表面，用无菌纱布过滤，收集的孢子悬浮液采用平板计数法计数后将浓度调节至106spores/mL，备用。
2.2抑制青霉乳酸菌的筛选
采用双层平板拮抗法进行抗青霉菌乳酸菌的筛选，取10μL已活化24h的乳酸菌发酵上清液点在MRS固体培养基平板中央，置于37℃恒温培养箱中培养24h，至长出菌苔。然后将含有浓度为106spores/mL青霉孢子液的PDA固体培养基均匀覆盖在含乳酸菌菌苔的MRS固体培养基的表面作为上层，待上层培养基凝固后于28℃培养48h，测量抑菌圈的直径。
2.2菌株的鉴定
2.2.1形态学鉴定
将菌株接种于MRS肉汤中，37℃、100r/min条件下培养24h，接种环沾取菌液划线于MRS固体培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养24h后观察菌落形态。另取1mL 菌液于4000r/min离心10min，弃去上清液，加入少量无菌生理盐水混合均匀制成菌悬液，用接种环沾取菌悬液均匀涂于载玻片上，通过革兰氏染色后在显微镜下观察菌株细胞形态，并拍照。取1mL菌液于3000r/min离心10min，弃去上清液，用0.1mol/LPBS(pH7.0) 洗涤3次后加入2.5％戊二醛固定液(电镜专用)于4℃固定过夜，随后用相同的PBS漂洗样品三次，每次15min；然后用1％的锇酸溶液固定样品2h；小心取出锇酸废液，用相同的PBS漂洗样品三次，每次15min；再用30％，50％，70％，80％，90％和95％这五种浓度的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min。然后用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V＝1：1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1h。最后临界点干燥，镀膜，在扫描电镜中观察。
2.2.2 API试剂盒鉴定
将菌株在37℃培养24h，于4000r/min、10min的条件下离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬为菌悬液。参考API试剂盒说明书进行操作。
2.2.3 16S rDNA基因序列分析
用天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA(模板)，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
PCR反应采用25μL体系：模板1μL；2×Taq PCRMaster Mix12.5μL；引物(27F、1492R)各1μL；无菌ddH2O补足25μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s； 55℃退火40s；72℃延伸1min，共30个循环；72℃终末延伸10min。反应结束后， PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送华大基因科技股份有限公司测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行比对分析。
系统发育树的构建：从Gene Bank中调取9株菌的序列作为参考序列，使用MEGA5.0 软件中邻接法(Neighbor-Joining)计算，对筛选所得的乳酸菌构建16S rDNA系统发育树，采用自举法(Bootstrap)进行自举数据集为1000的置信度检测。
2.3菌株的抑菌谱
2.3.1抑制真菌的抑菌谱
取10μL已活化24h的筛选菌株菌悬液(1.8×109cfu/mL)点在MRS固体培养基平板中央，置于37℃恒温培养箱中培养24h，至长出菌苔。分别将含有浓度为106spores/mL 青霉、毛霉、黑曲霉、葡枝根霉、黄曲霉的孢子悬浮液的PDA固体培养基均匀覆盖在上层，待上层培养基凝固后于28℃培养48h，测量抑菌圈的直径。
2.3.2抑制致病细菌的抑菌谱
取10μL已活化24h的筛选菌株菌悬液(1.8×109cfu/mL)点在MRS固体培养基平板中央，置于37℃恒温培养箱中培养24h，至长出菌苔。分别将含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌的LB固体培养基均匀覆盖在上层，待上层培养基凝固后于37℃培养48h，测量抑菌圈的直径。
2.4菌株的溶血活性的测定
将菌株划线至含有5％无菌脱纤维羊血的血琼脂平板，金黄色葡萄球菌作为阳性对照， 37℃培养48h，观察菌落周围是否出现溶血现象，并拍照记录。
3结果与分析
3.1菌株LPP95对青霉菌的抑制活性
结果如图1所示，菌株LPP95对青霉菌展现出强抑菌圈(抑菌圈直径大于25mm)，说明LPP95菌株对青霉具有很强的抑菌活性。
3.2菌株的鉴定结果
3.2.1形态学鉴定结果
如图2所示，菌株LPP95在MRS固体培养基上形成形态一致的单菌落，形状大多数呈圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑(图2A)。革兰氏染色后在显微镜观察到菌株细胞为蓝紫色、短杆状且细胞形态均一，判定为纯种革兰氏阳性菌(图2B)。扫描电镜下显示菌株LPP95为短杆状，细胞形态完整无缺，与光学显微镜观察结果一致(图2C)。
3.2.2生化特性鉴定结果
乳酸杆菌种水平的表型鉴定主要依据碳水化合物发酵试验。API 50CH试剂盒是菌株通过对49种不同碳水化合物的利用情况来进行鉴定。图3示出了菌株LPP95的API 50CH反应结果。表1示出了菌株LPP95对49种碳水化合物发酵试验结果。由图3和表1可知，在供试的49种碳源中，菌株LPP95可以利用其中21种碳水化合物。经API lab plus系统最终鉴定，编号为LPP95的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其ID值为 99.90％，T值为0.71，达到鉴定要求(ID值≥99.0％且T值≥0.5)。
表1 LPP95对49种碳水化合物发酵试验结果
注：“+”代表反应阳性；“－”代表反应阴性。
3.2.3 16S rDNA基因序列分析结果
图4A为菌株LPP95的PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。由图可知，PCR扩增后的条带大约在1500bp的位置，阴性对照无条带且扩增条带清晰明亮，说明PCR扩增成功，符合预期PCR扩增结果，可用于后期测序工作。PCR扩增产物经过测序后，将所得序列通过BLAST程序进行同源性对比分析，结果显示菌株LPP95的16S rDNA PCR扩增产物的序列(SEQ ID NO.1)与Gene Bank数据库中已知植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，登录号：MT604646.1)的同源性达100％。将菌株LPP95与Gene Bank中9株乳酸菌一起构建系统发育树，结果见图4B。菌株LPP95与植物乳杆菌以100％自举支持率聚在一起，说明菌株LPP95与植物乳杆菌的亲缘关系最近。
3.3植物乳杆菌LPP95的抑菌谱
利用双层平板拮抗法测定植物乳杆菌LPP95对青霉、黑曲霉、葡枝根霉、黄曲霉、毛霉这5种霉菌以及对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌这5种致病细菌的抑制活性。如表2所示，菌株LPP95对5种霉菌均具有显著的抑菌活性(抑菌圈直径>19.00mm)，其中对青霉的抑制活性最强。由表3可知，植物乳杆菌LPP95对5种致病细菌均具有较强的抑制活性(抑菌圈直径>20.00mm)，其中对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的抑制活性最强(抑菌圈直径>30.00mm)。
表2植物乳杆菌LPP95对真菌的抑制效果
表3菌株LPP95对常见致病菌的抑制效果
3.4植物乳杆菌LPP95的溶血性结果
溶血是指菌株分泌的溶血毒素导致细胞破裂溶解的现象，与菌株自身的致病性有关，血琼脂平板上的菌落周围形成草绿色溶血圈，为潜在性致病菌(α型溶血)；菌落周围形成无色透明的溶血圈，为强致病菌(β型溶血)；菌落周围显示正常血琼脂平板颜色，无溶血现象(γ型溶血)。由图5可知，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)划线的血琼脂平板 (图5A)上菌落周围形成完全透明的溶血圈(β型溶血)，植物乳杆菌LPP95划线的血琼脂平板(图5B)上菌落周围没有出现草绿色和透明圈，表明植物乳杆菌LPP95无溶血性。
实施例2、抑菌物质的特性、抑菌机理分析及其鉴定
1实验材料
实验菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPP95。
2实验方法
2.1乳酸菌无细胞发酵上清液(CFS)的制备
从平板上挑取单菌落接种到10mL的MRS肉汤中，37℃培养24h后，取5mL培养液于15mL离心管中4000r/min离心10min，加入5mL无菌生理盐水制成菌悬液，用无菌生理盐水将菌悬液OD600nm调至约1.27(1.8×1010cfu/mL)，然后用无菌生理盐水稀释十倍后按2％(v/v)的接种量接种到新的MRS肉汤中，37℃培养24h后取出，4℃6000 r/min离心15min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞发酵上清液(CFS)。
2.2不同温度对CFS抑制青霉菌活性的影响
将CFS在室温(约25℃)、60℃、80℃、100℃中处理2h，121℃处理30min，等温度降至室温后在96孔板中分别加入100μLPDB含青霉菌孢子悬浮液(106spores/mL) 及100μL不同温度处理后的发酵上清液，等量MRS肉汤作对照，28℃培养48h，分别测定0h和48h的OD600nm，按下列公式计算不同温度处理后的CFS的抑制率。
2.3不同蛋白酶对CFS抑制青霉菌活性的影响
将CFS的pH调至蛋白酶的合适pH，分别加入胃蛋白酶(pH2，1mg/mL)、胰蛋白酶(pH7，1mg/mL)、木瓜蛋白酶(pH7，1mg/mL)、蛋白酶K(pH7，1mg/mL)， 37℃水浴2h，再放于100℃的金属浴中5min使蛋白酶失活，等温度降至室温后将pH 调至起始的pH(3.94)。在96孔板中分别加入100μL PDB含青霉菌孢子悬浮液(106spores/mL)及100μL不同蛋白酶处理后的CFS，等量MRS肉汤作对照，28℃培养48h，分别测定0h和48h的OD600nm，按2.2公式计算不同蛋白酶处理后的CFS的抑制率。
2.4不同pH对CFS抑制青霉菌活性的影响
用5mol/LNaOH调节发酵上清液pH值至2、3、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在 96孔板中分别加入100μLPDB含青霉菌孢子悬浮液(106spores/mL)及100μL调节pH 后的CFS，等量MRS肉汤作对照，28℃培养48h，分别测定0h和48h的OD600nm，按 2.2公式计算调节pH后的CFS的抑制率。
2.5植物乳杆菌LPP95的CFS对青霉菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)的测定
使用96孔微量滴定板测定CFS对青霉菌的MIC。称取经真空冷冻干燥机冻干48h 后的CFS溶解于无菌水中，使得浓度为1000mg/mL，并用无菌水进行二倍梯度稀释，稀释至3.90625mg/mL。在96孔板中加入各浓度的CFS 100μL及100μL PDB含青霉菌孢子悬浮液(106spores/mL)，充分混匀后在28℃培养48h，测定600nm处的吸光度值。仅包括不同浓度的CFS和PDB培养基为对照组。从无明显生长的96孔板中取10μL培养基于PDA平板上在28℃培养48h观察青霉菌的存活情况，杀灭99.9％(即减少3个数量级)的青霉菌的浓度为最小杀菌浓度(MFC)。
2.6 CFS对青霉菌的抑菌机理的探究
2.6.1 CFS对青霉孢子细胞壁的影响
(1)SEM观察CFS处理后孢子表面形态变化
取0.5mL的青霉孢子悬浮液加到1.5mL离心管中，处理组加入0.5mL植物乳杆菌LPP95的CFS(终浓度为最小抑菌浓度)，对照组加入等体积的PBS，28℃处理48h，3000r/min离心10min，倒掉上清液，用0.1mol/LPBS(pH7.0)洗涤3次后加入2.5％戊二醛固定液(电镜专用)于4℃固定过夜，随后用相同的PBS漂洗样品三次，每次15min；然后用1％的锇酸溶液固定样品2h；小心取出锇酸废液，用相同的PBS漂洗样品三次，每次15min；再用30％，50％，70％，80％，90％和95％这五种浓度的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min。然后用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V＝1：1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1h。最后临界点干燥，镀膜，在扫描电镜中观察。
(2)CFS处理不同时间后AKP渗出的测定
1mL 106spores/mL的青霉孢子悬浮液加到10mL离心管中，处理组加入植物乳杆菌LPP95的CFS(终浓度为最小抑菌浓度)处理不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、36h、 48h)，对照组加入等体积的PBS，阴性对照为不加青霉菌孢子，8000r/min离心10min，取上清液采用AKP试剂盒按照说明书方法测定AKP酶活性。
2.6.2 CFS对青霉孢子细胞膜的影响
(1)CFS处理不同时间后核酸泄漏的测定
1mL 106spores/mL的青霉孢子悬浮液加到10mL离心管中，处理组加入植物乳杆菌LPP95的CFS(终浓度为最小抑菌浓度)处理不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、36h、 48h)，对照组加入等体积的PBS，阴性对照为不加青霉菌孢子，8000r/min离心10min，用紫外分光光度计测定上清液在260nm波长处的吸光度值(A260nm)。
(2)荧光显微镜观察CFS处理孢子PI染色反映细胞膜完整性
0.5mL的青霉孢子悬浮液加入到1.5mL离心管中，处理组加入植物乳杆菌LPP95的CFS(终浓度为最小抑菌浓度)，对照组加入等体积的PBS，处理不同时间后，4000r/min 离心10min，倒掉上清液，加入1mL 10μg/mL的PI染色液，混匀后室温避光染色30min， PBS洗涤多余的染液后重悬于100μLPBS中，置于荧光显微镜下观察，并拍照记录。
2.7 LC-MS测定CFS中的抑菌物质
2.7.1样品处理
将筛选菌株LPP95按2％(v/v)的接种量接种到的MRS肉汤中，37℃培养24h后取出，4℃6000r/min离心15min，取上清液于超低温冰箱中过夜冷冻后进行真空冷冻干燥48h后取出。精确称取20mg冻干后的CFS至2mL离心管中，加入一颗直径6mm 的研磨珠并加入400μL提取液(甲醇：水＝4:1(v:v))，含0.02mg/mL的内标(L-2- 氯苯丙氨酸)，冷冻组织研磨仪研磨6min(-10℃，50Hz)，低温超声提取30min(5℃， 40KHz)后静置于-20℃，30min，然后离心15min(13000g，4℃)，吸取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。样品进行6个生物学重复。
2.7.2色谱条件
使用ExionLC AD System(AB SCIEX)超高效液相色谱仪：色谱柱为ACQUITY UPLCHSS T3(100mm×2.1mm i.d.，1.8μm；Waters，Milford，USA)；流动相A为95％水+5％乙腈(含0.1％甲酸)，流动相B为47.5％乙腈+47.5％异丙醇+5％水(含0.1％甲酸)，按表4进行梯度洗脱，流速为0.40mL/min，进样量为10μL，柱温为40℃。
表4流动相洗脱程序
2.7.3质谱条件
使用AB SCIEX-Triple TOF 5600+(AB SCIEX)质谱仪：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。具体参数为：质量扫描范围m/z 500-1000Da，喷雾气50psi，辅助加热气50psi，气帘气30psi，离子源温度550℃，离子化电压(正极) 5000V，离子化电压(负极)-4000V，去簇电压80V，碰撞能40±20eV，循环时间510ms。
2.8主要抗霉菌化合物的抑菌活性的验证
称取适量主要抗霉菌化合物纯品，溶解于无菌水或DMSO中，能溶解于无菌水的抗菌化合物采用96孔微量滴定板测定其对青霉的抑菌活性，不能溶解于无菌水但能溶解于DMSO的抗菌化合物采用牛津杯法测定其对青霉的抑菌效果。
3结果与分析
3.1 CFS对温度的耐受性
如图6所示，植物乳杆菌LPP95的CFS经过60、80和100℃分别处理2h，121℃处理30min后的对青霉菌的抑制率与常温组的抑制率无显著差异(p>0.05)，表明温度对菌株LPP95的CFS的抑菌效果没有显著性影响。
3.2 CFS对不同蛋白酶的稳定性
植物乳杆菌LPP95的CFS经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后对青霉菌的抑制率如图7所示，不同酶处理后的CFS的抑制率与未处理的CFS相比无显著差异(p>0.05)，表明蛋白酶对菌株LPP95的CFS的抑菌活性没有显著性影响，稳定性好。
3.3 CFS对pH的敏感性
植物乳杆菌LPP95的CFS在不同pH下对青霉菌的抑制率如图8所示，pH在2.0-4.5之间对青霉菌的抑菌活性没有显著差异(p>0.05)。当pH为5时，抑菌活性显著降低 (p<0.05)，并且随着pH增加抑菌活性急剧下降，在pH大于6.5后无抑菌活性。
3.4 MIC和MFC
如表5所示，植物乳杆菌LPP95的CFS对青霉菌的最小抑菌浓度(MIC)为62.5 mg/mL，最小杀菌浓度(MFC)为125mg/mL，结果表明植物乳杆菌LPP95的CFS对青霉菌的生长具有较强的抑制作用。
表5植物乳杆菌LPP95的CFS对青霉菌的MIC和MBC
“-”：与对照组无显著差异
3.5 CFS对青霉孢子的抑菌机理
3.5.1 CFS对青霉孢子细胞壁超微结构的影响
如图9所示，对照组孢子形态规则、饱满、直径均一，CFS处理48h的处理组的孢子形态表现为皱缩、干瘪、形态不规则。说明CFS能够造成青霉孢子细胞壁损伤，破坏孢子正常形态。
3.5.2 CFS对青霉孢子细胞壁完整性的影响
AKP由细胞质产生，隐藏在周质空间。细胞壁受损会导致AKP从壁膜间隙释放到细胞外。因此测定青霉菌孢子细胞外的AKP含量可以反映细胞壁的完整情况。如图10所示，CFS处理孢子4h后，处理组孢子外AKP含量明显高于对照组，并且随着作用时间的增加，差距越来越大，结果表明植物乳杆菌LPP95的CFS能够破坏青霉菌细胞壁的完整性，导致AKP由周质空间泄漏到孢子细胞外。
3.5.3 CFS对青霉孢子细胞膜的影响
如图11所示，对照组细胞外的OD260nm基本维持不变，随着作用时间的增加，OD260nm稍有增加；而CFS处理260nm处吸光度值显著高于对照组，且随着作用时间的延长 OD260nm持续增加。260nm处吸光值与细胞外核酸含量呈正相关，说明青霉孢子在被CFS 处理后，细胞膜完整性遭到破坏，使得细胞内的核酸渗出细胞外。如图12A所示，CFS 处理0h时的青霉孢子和对照组均没有红色荧光，当CFS处理48h时的青霉孢子呈现明显的红色荧光，数量明显多于对照组(图12B)，说明CFS能够造成青霉孢子的细胞膜破损，使PI染液进入细胞内与DNA结合显示红色荧光。
3.6 LC-MS分析CFS中的抑菌物质
通过LC-MS分析植物乳杆菌LPP95的CFS中的代谢产物，来确定起抑菌作用的主要物质。分析植物乳杆菌LPP95的CFS中的代谢物及结合文献中已报道的抗真菌化合物，结果发现植物乳杆菌LPP95的CFS中共有11种化合物具有抑制真菌的作用(表6)。其中，反式肉桂酸、柠檬酸、(E)-3-吲哚丙烯酸、DL-4-羟基苯乳酸、反式-2-羟基肉桂酸、苹果酸的含量相对较高。另外，(E)-3-吲哚丙烯酸首次在乳酸菌发酵上清液中发现且具有抗真菌作用。
表6植物乳杆菌LPP95的CFS中抗真菌的主要代谢物
3.7 CFS中主要抗霉菌化合物的抑菌活性的验证
采用牛津杯法和96孔微量滴定板法测定CFS中主要抗霉菌化合物的抑菌活性，由于反式肉桂酸、(E)-3-吲哚丙烯酸和反式-2-羟基肉桂酸在水中溶解度低或不溶于水，故采用牛津杯法测定其抑菌活性，DMSO为溶剂(无抑菌圈)。柠檬酸、DL-4-羟基苯乳酸、苹果酸采用96孔微量滴定板法进行测定，测定结果如表7所示，6种化合物对青霉均具有一定的抑菌效果。
表7主要抗真菌化合物的抑菌活性
实施例3、植物乳杆菌LPP95对发酵酸奶品质及抑菌能力的影响
1实验材料
实验菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPP95。
2实验方法
2.1防霉加速实验
将纯牛奶在95℃中加热5min，冷却至42℃左右，然后加入0.02％(m/v)的酸奶发酵剂及7％的白砂糖，搅拌均匀后分装至无菌品评杯中，每杯50mL。分别接种不同浓度的植物乳杆菌LPP95(终浓度分别为5.4×106CFU/mL，5.4×105CFU/mL，5.4×104CFU/mL)，对照组只含发酵剂，然后分别加入10μL(终浓度约为4.4spores/mL)青霉孢子，放置于 42℃恒温培养箱中发酵，直至pH为4.5左右，取出置于4℃冰箱中冷藏24h进行后熟。随后将后熟完成后的酸奶(各三杯平行样)置于28℃环境中恒温放置，每天观察霉菌在酸奶中的生长情况并记录。若有1杯酸奶样品中有霉菌出现，则观察结果记录为1。最终选择最佳植物乳杆菌LPP95添加浓度进行后续实验。
2.2植物乳杆菌LPP95酸奶在4℃环境中对青霉的抑制活性测定
按照2.1制作酸奶，每杯加入10μL(终浓度约为4.4spores/mL)青霉孢子后进行发酵。发酵结束后将酸奶(各8杯平行样)放置4℃环境中，观察霉菌在酸奶中的生长情况并记录。若有1杯酸奶样品中有霉菌出现，则观察结果记录为1。
2.3植物乳杆菌LPP95最佳添加量的酸奶制作
将牛奶在95℃中加热5min，冷却至42℃左右，然后加入0.02％(m/v)的酸奶发酵剂及7％的白砂糖，搅拌均匀后分装至无菌品评杯中，每杯50mL。分别接种0.0％、3.0％植物乳杆菌LPP95(终浓度为5.4×106CFU/mL)，放置于42℃恒温培养箱中发酵，直至 pH为4.5左右，取出置于4℃冰箱中冷藏24h进行后熟并贮藏。分别在第2、7、14、21、 28天测定相关指标。
2.4颜色变化的测定
测量在直径为60mm的品评杯中进行，使用测色仪检测样品，系统自动处理数据显示明度(L*)、红绿颜色(a*)和黄蓝颜色(b*)。
2.5pH值测定
酸奶样品的pH值在室温下用pH计测定。
2.6可滴定酸度测定
称取10g酸奶样品与20mL煮沸冷却后蒸馏水混合均匀，加入2mL酚酞指示液，混匀后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定。根据氢氧化钠溶液的消耗量计算可滴定酸度。
2.7持水力的测定
称取酸奶样品20g到100mL离心管中，在4℃、4000r/min下离心20min，倒掉上清液后将离心管倒置5min。酸奶样品的持水力按以下公式进行计算：
式中：m1为离心后离心管和酸奶样品的总质量(g)；m2为离心管质量(g)；m为酸奶样品质量(g)。
2.8质构的测定
采用TA.XT Plus型质构仪对酸奶样品的硬度、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性进行分析，测定条件如下：探头型号为P/36R，直径为36mm；测试前下降速度为1.0mm/s，测试速度为1.0mm/s，测试后返回速度为1.0mm/s，触发力5g，形变量为50％，压缩之间停留时间为5s。
2.9流变性的测定
选用直径为50mm的平板探头，间隙为l mm，测试温度为25℃，应变设置为0.5％，频率范围为0.1～10Hz，测定储能模量G'、损耗模量G”、损耗角的正切值tanδ＝G”/G'随频率变化的情况。
2.10感官评价
酸奶在第2天和第28天进行感官评价，30名感官评价人员(男15名，女15名，年龄在20-43岁之间)根据消费酸奶的习惯和兴趣对酸奶的样品的外观、颜色、香气、质地、味道和总体接受度进行打分，总分为9分(1＝非常讨厌；5＝既不喜欢也讨厌；9＝非常喜欢)。
2.11数据统计与分析
采用Excel和SPSS20.0软件对数据进行整理与分析，结果以“平均值±标准偏差”表示，以p<0.05为显著性差异，绘图采用Graphpad prism 7软件，每个样品3组平行。
3结果与分析
3.1防霉加速实验
由表8可知，在第三天，只含发酵剂、植物乳杆菌LPP95接种量为5.4×105CFU/mL及5.4×104CFU/mL的酸奶出现明显的青霉污染，而植物乳杆菌LPP95接种量为5.4×106CFU/mL的一杯酸奶在第8天被青霉污染，第9天三杯均出现污染。如图13所示，在第9天，只接种发酵剂的酸奶表面长满青霉并伴有严重的乳清析出，而接种植物乳杆菌 LPP95(5.4×106CFU/mL)的酸奶表面仅有很小的一部分出现污染，而且酸奶光滑、质地均匀且无明显乳清析出。故选择植物乳杆菌LPP95的接种量为5.4×106CFU/mL进行后续实验。
表8植物乳杆菌LPP95在28℃下对酸奶中青霉的抑制效果
3.2植物乳杆菌LPP95对酸奶中青霉的抑制效果
由表9可知，酸奶在4℃贮藏时，第24天酸奶表面出现青霉污染，其中只接种发酵剂的酸奶有4杯，而接种植物乳杆菌LPP95的酸奶有3杯。在第25天只接种发酵剂的酸奶有6杯出现污染，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶有4杯；第26天和第27天，只接种发酵剂的酸奶有7杯有青霉的污染，而接种植物乳杆菌LPP95的酸奶有5杯存在青霉的污染；4℃贮藏第28天，只接种发酵剂的8杯酸奶全部出现青霉的污染，而接种植物乳杆菌LPP95的酸奶仍只有5杯存在青霉的污染，有3杯无青霉的污染。由图14可以看出，在第28天只接种发酵剂的酸奶表面有较大面积的菌丝和黄色代谢物(图14A)，而接种植物乳杆菌LPP95的酸奶表面仅有较小面积的污染或者点状的菌点(图14B)。
表9植物乳杆菌LPP95在4℃下对酸奶中青霉的抑制效果
3.3植物乳杆菌LPP95对酸奶颜色的影响
酸奶在4℃条件下冷藏28天的颜色参数变化如表10所示。添加植物乳杆菌LPP95的酸奶在4℃贮藏28天，与只含发酵剂酸奶相比，酸奶的三种颜色参数值无显著差异 (p>0.05)，说明添加植物乳杆菌LPP95后对酸奶的颜色无影响。
表10 4℃下酸奶贮藏期间颜色参数变化
/>
注：a、b在一行内，不同的上标小写字母表示同一贮存期不同酸奶之间存在显著差异(p<0.05)；A、B、C、D在同一列内，不同的上标大写字母表示每个样本在不同的贮存天数之间存在显著差异(p<0.05)。(下同)
3.4植物乳杆菌LPP95对酸奶pH值和可滴定酸度的影响
表11显示了酸奶在4℃条件下冷藏28天的pH和可滴定酸度的变化。在整个冷藏期间，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶的pH值和可滴定酸度与只含发酵剂的酸奶无显著性差异(p>0.05)；随着贮藏时间的增加，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶与只含发酵剂的酸奶的 pH值都有降低(p<0.05)，两组酸奶的可滴定酸度都有增加(p<0.05)。
表11 4℃下酸奶贮藏期间pH值和可滴定酸度变化
3.5植物乳杆菌LPP95对酸奶持水力的影响
酸奶在28天冷藏期间的持水力的变化如表12所示。在冷藏21天之前，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶的持水力与只含发酵剂的酸奶无显著性差异(p>0.05)；在第28天，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶的持水力显著大于只含发酵剂的酸奶(p<0.05)。在整个冷藏期间，只含发酵剂的酸奶在整个贮藏期间持水力没有明显变化(p>0.05)，而接种植物乳杆菌LPP95的酸奶在第28天持水力有显著增加(p<0.05)。综上说明添加植物乳杆菌LPP95 能提高酸奶的持水力。
表12 4℃下酸奶贮藏期间持水力变化
/>
3.6植物乳杆菌LPP95对酸奶质构的影响
酸奶在4℃条件下冷藏28天的质构(硬度、弹性、内聚性、胶着性、咀嚼性)变化如表13所示。在冷藏期间，接种植物乳杆菌LPP95的酸奶的硬度、弹性、咀嚼性与只含发酵剂的酸奶无显著性差异(p>0.05)。在酸奶冷藏的第14天到第28天，接种植物乳杆菌LPP95能显著提高酸奶的内聚性(p<0.05)。在酸奶冷藏的第28天，接种植物乳杆菌 LPP95的酸奶的胶着性显著大于只含发酵剂的酸奶(p<0.05)。由此说明接种植物乳杆菌 LPP95能提高酸奶的内聚性和胶着性，对酸奶的硬度、弹性、咀嚼性无影响。
表13 4℃下酸奶贮藏期间质构变化
3.7植物乳杆菌LPP95对酸奶流变学特性的影响
储能模量是样品受到剪切力之后产生形变而储存的能量，用于描述样品的弹性特征；损耗模量是样品受到剪切力之后抵抗形变阻力而损耗的能量，用于描述样品的的黏性特征；损耗角的正切值(tanδ)是损耗模量与储能模量的比值，tanδ越大表明体系的黏性比例越大，流动性越强，反之弹性比例大。通过流变仪测定接种植物乳杆菌LPP95对贮藏2d 酸奶储能模量、损耗模量和tanδ的影响，结果如如图15所示：所有酸奶样品的储能模量和损耗模量随着频率的增大而上升，而且储能模量均大于损耗模量，接种植物乳杆菌 LPP95酸奶样品的储能模量和损耗模量相对于只接种发酵剂的酸奶均有所增加(图15A，图15B)，表明接种植物乳杆菌LPP95能够增加酸奶的黏弹性。由图15C可知，tanδ均小于1，表明酸奶体系中弹性占优势，接种植物乳杆菌LPP95降低了酸奶的损耗角正切值，提高了体系的弹性特征。
3.8植物乳杆菌LPP95对酸奶感官品质的影响
酸奶在4℃条件下冷藏2天和28天的感官评价如表14所示。在第2天和第28天，添加植物乳杆菌LPP95的酸奶的外观、颜色、香气、质地、味道和总体接受度与只含发酵剂酸奶相比，均无显著性差异(p>0.05)，在28天的贮藏期间两种酸奶的感官品质均没有发生显著变化(p>0.05)，说明添加植物乳杆菌LPP95后对酸奶的感官品质无影响。
表14植物乳杆菌LPP95对酸奶感官品质的影响
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<110> 西南大学
<120> 一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物乳杆菌LPP95 16S rDNA
<400> 1
aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc 120
atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga ttagcttact 180
ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcacc 300
agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc atgtccccga 420
agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct gcagcactga 600
agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg gtatggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca gttacagacc agacagccgc 720
cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat ggagttccac 780
tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac ttcttcggtt gagccgaagg 840
ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa atccggacaa 900
cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960
aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt cttctttaac aacagagttt 1020
tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttt cgtccattgt 1080
ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg 1140
ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg tgagccgtta cctcaccatc 1200
tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga agccatcttt caaactcgga 1260
ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaggtgtta tcccccgctt 1320
ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact cactcaaatg taaatcatga 1380
tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgactg 1416

Claims (8)

1.一株具有广谱抑制霉菌和致病细菌活性且产多种抗菌代谢物的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPP95，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 20211068。
2.一种菌剂，其活性成分包含权利要求1所述的植物乳杆菌LPP95或LPP95的发酵液。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为冷冻干燥粉剂、发酵液或发酵液浓缩液。
4.权利要求1所述植物乳杆菌LPP95或权利要求2所述的菌剂在制备食品发酵剂或食品添加剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述食品包括酸奶、发酵谷物、泡菜或饮料。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵谷物包括馒头、包子、面包、蛋糕。
7.权利要求1所述植物乳杆菌LPP95或权利要求2所述的菌剂在制备食品防腐剂或食品抗菌剂或抗菌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用方式为所述植物乳杆菌LPP95或所述菌剂抑制霉菌和致病细菌的生长。
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