CN109380502A - 一种黑莓果实抑菌保鲜剂及黑莓果实保鲜方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑莓果实抑菌保鲜剂，该抑菌保鲜剂为阿魏酸、那他霉素的混合溶液，溶剂采用无菌水，混合溶液中阿魏酸浓度为0.256mg/mL，那他霉素浓度为0.03125μg/mL。本发明采用植物源和微生物源的阿魏酸和那他霉素，对黑莓制腐菌具有良好的抑制作用，且两者联用具有协同抑菌作用，可以达到低剂量高效的抑菌效果，在安全的前提下大大节约了成本。

Description

一种黑莓果实抑菌保鲜剂及黑莓果实保鲜方法
技术领域
本发明属于食品保鲜技术领域，具体涉及一种用于黑莓果实的抑菌保鲜技术。
背景技术
黑莓(Blackberry)为蔷薇科悬钩子属(Rubus L.)植物，原产于北美东部和欧洲中部，已有100多年的栽培历史。黑莓其具有生态适应性强、易栽培、成林快、产出较早的特征，于1986年由江苏省中国科学院植物研究所引入中国，从1994年开始推广种植。黑莓果实营养丰富且兼具药用功能，除含有糖、多种有机酸、膳食纤维、维生素和矿物质之外，还含有大量的多酚、花色苷和鞣花单宁等具有抗氧化、抗癌症、和抗心血管疾病等功能的成分。随着人们对健康饮食的日益重视，黑莓果实以其独特的风味和丰富的营养与药用功效彰显出广阔的发展前景。
黑莓属于浆果，外果皮、中果皮、内果皮均肉质化，成熟果实柔软多汁，受其自身的生物学特性和生理特性的限制，其耐藏性和流通性远逊于苹果、梨、柑橘等水果，采后果实的色泽、质地、风味等品质随着贮藏时间的延长而逐渐降低。此外，黑莓果实成熟时间为6-8月，正值高温季节，空气温度和湿度较大，采后果实各种生理代谢加快，常温条件下易受真菌感染而腐烂，夏季采后常温保质期仅为4h左右，存放在0℃的货架期仅为2-3d，堪称最不耐贮藏的果实，采后腐烂率可高达40％，因此，采后处理是保持黑莓营养品质和商品属性的必要措施。尽管市场对黑莓消费需求量日趋增多，但国内市场上仍少见黑莓鲜果供应，目前国内生产的黑莓果实主要用于加工用途，制成饮用产品或提取多酚类等功能成分加以利用。
目前物理保鲜技术在草莓、葡萄等果蔬中已得到广泛应用，并取得了很好的效果。在黑莓保鲜方面，国外已进行了果实采后处理及包装方式的研究，通过采用气调、真空包装，低温以及不同的包装材料以延长黑莓零售的货架期，然而利用生物保鲜技术延长黑莓货架期的报道较少。引起采后果蔬腐烂的致病菌多种多样，不同果蔬易感染的微生物也不尽相同，致腐菌的繁殖除了导致黑莓腐烂外，还可能分泌大量有害的次生代谢产物，对食品安全造成严重威胁，目前针对引起黑莓腐败变质的微生物而采取的天然防腐措施尚缺乏研究，而筛选具有协同抑菌效果的天然保鲜剂的复配组合不仅可以降低单一抑菌剂的使用量，降低成本，而且能够增强单一抑菌剂的抑制效果，达到低剂量高效抑菌的目的，对提高黑莓的贮藏保鲜期及其产业发展具有现实意义。
1-MCP处理可以抑制与果实软化相关的细胞壁酶的活性，延迟芒果的成熟，紫外照射可以抑制细胞壁PME2.1,Cel1,PGcat和Exp1基因的表达，抑制果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的活性，从而抑制西红柿果实的软化，延长了货架期。用添加了β-葡聚糖的Cryptococcus podzolicus处理苹果，提高了与果实抗病性相关的PPO、POD、PAL和CAT酶的活性，降低了MDA酶的活性，诱导果实产生了抗病性，减少了果实扩展青霉的发生。采后处理诱导果蔬产生抗病性在草莓上也取得了一些进展，BHT可以提高Cryptococcus laurentii对草莓黑腐病的抗性，可能是通过提高PPO、POD和CAT酶的活性来实现的。有研究表明采后处理诱导植物产生抗病性与其诱导次生代谢物质的形成和抗病相关基因的表达也有关。不同的采后处理对某种果实抗病性的影响不尽相同，而同一种采后处理对特定的微生物的作用方式也可能不同，因此采后处理在抑制特定微生物方面的有效抑制剂有待研究，本发明是在有效抑制黑莓致腐菌的基础研发出具有低剂量高效的黑莓鲜果保鲜技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能有效对黑莓进行鲜果贮藏、防止发霉腐烂的保鲜剂。
为了达到上述目的，本发明提供了一种黑莓果实抑菌保鲜剂，该抑菌保鲜剂为阿魏酸、那他霉素的混合溶液，溶剂采用无菌水，混合溶液中阿魏酸浓度为0.256mg/mL，那他霉素浓度为0.03125μg/mL。
本发明还提供了上述黑莓果实抑菌保鲜方法，该方法通过将黑莓果实浸入抑菌保鲜剂中处理5～20min，沥干，晾干后进行贮藏。
其中，贮藏采用低温贮藏，温度控制在2±0.5℃，相对湿度控制在90～95％。
进一步的，黑莓果实在进行抑菌保鲜剂处理前，先进行预冷处理，预冷处理温度为0～5℃，处理时间为4～8小时。
进一步的，黑莓果实在进行预冷处理前，先进行筛选处理：选择成熟度相对一致、大小均一、无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗。
进一步的，黑莓果实在进行抑菌保鲜剂处理后，分包装进行低温贮藏；分包装的规格大小为：100～250克/盒，每盒两层果实。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明采用植物源和微生物源的阿魏酸和那他霉素，对黑莓制腐菌具有良好的抑制作用，且两者联用具有协同抑菌作用，可以达到低剂量高效的抑菌效果，在安全的前提下大大节约了成本。
采用本发明抑菌剂进行抑菌保鲜，并结合本发明抑菌保鲜方法，能很好的保持黑莓果实硬度，同时降低果实失重率，降低果实腐烂率，较好的保持果实品质，延长贮藏期。
附图说明
图1为本发明抑菌剂筛选实施例中分离菌株的菌落和扫描电镜图；
图1中，a:M菌株菌落，b:M菌株菌丝(200х)，c:M菌株分生孢子(4.00Kх)，d:G菌株菌落，e:G菌株菌丝及分生孢子(200х)，f:G菌株分生孢子(4.00Kх)；
图2为分离菌株ITS区扩增产物电泳图；
图3为以ITS-r DNA基因序列为分子标记的M菌株系统进化树；
图4为以ITS-r DNA基因序列为分子标记的G菌株系统进化树；
图5为不同处理方法对黑莓果实硬度变化的对比图；
图6为不同处理方法对黑莓果实失重率变化的对比图；
图7为不同处理方法对黑莓果实腐烂率变化的对比图；
图8为不同处理方法对黑莓果实TSS(可溶性固形物)变化的对比图；
图9为不同处理方法对黑莓果实TA(可滴定酸)变化的对比图；
图10为不同处理方法对黑莓果实花色苷变化的对比图。
图中，CK0：贮藏初期，CK、CK1：采用比较例一般贮藏方法进行贮藏，A：采用本发明实施例1阿魏酸处理组，B：采用本发明实施例1那他霉素处理组，A+B：采用本发明实施例1阿魏酸和那他霉素的复合处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术。
实施例中选用的黑莓品种为“Hull(赫尔)”，采至江苏省溧水白马镇。
抑菌剂筛选实施例
(1)黑莓果实致腐病原真菌的分离纯化与鉴定：分离纯化黑莓果实致腐菌并进行鉴定。
1)病原真菌的分离纯化
对具备典型症状的病样用水冲洗，从病原交界处剪取病样材料，在无菌条件下分别将材料置于PDA和LB平板培养基上，每皿接种一片，至于适宜的条件下培养。挑取菌落边缘菌丝多次转入培养基上进行纯化，观察菌落生长状态、产孢情况等特征。
2)病原真菌的致病性检测
病原真菌孢子悬浮液的制作：将分离纯化得到的病原真菌培养皿中培养3-5d，以适量无菌水洗下菌苔，将混有病菌菌丝和孢子的液体用4层纱布过滤，滤液中加入0.05％的吐温-80，振荡后得到孢子悬浮液。采用血球计数板计数，调整为实验浓度1×105cfu/mL，4℃保存待用。
病原真菌的接种：无菌条件下，用移液器的枪头在黑莓果蒂处打孔，将各病原真菌的孢子液接种到果蒂打孔处，每种病原真菌一次接种6颗黑莓，接种后移入灭菌培养皿中，封口膜封口，25℃恒温培养3-5天，重复3次。观察、记录接种后的黑莓果实发病速度和状态，判断菌株对黑莓的致病能力。根据柯赫法则，比较发病黑莓上分离的菌株与所接种菌株的菌落形态是否一致，若一致，确定为黑莓的潜伏侵染病原真菌，其中2株(菌株M和G)对黑莓果实具有致病性，接种后导致黑莓果实霉变，菌株接种果实3天后的腐烂率达到100％，判定这2种真菌为黑莓潜伏侵染病原真菌。
3)病原真菌的形态学鉴定
将纯化的2株黑莓病原菌培养5-10天，观察菌落形态。挑取少量孢子或菌丝，扫描电镜下观察各菌株分生孢子及孢子梗的形状、孢子纵横隔膜数目等，查阅文献，参照《真菌鉴定手册》与《真菌病害诊断》，初步鉴定病原菌的种属(如图1所示)。
4)病原真菌的分子生物学鉴定
取适量菌体，液氮研磨至细粉，用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取DNA，-20℃保存待用。采用通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌核糖体DNA转录间隔区(Internal TranscribedSpacer，ITS)。扩增产物通过电泳检测目的条带(如图2所示，MK：Marker DL1k)。其余产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列在NCBI数据库中进行BLAST同源性检索，采用MEGA 5.1软件对同源序列与目的序列进行比对，构建系统进化树，分析亲缘关系(如图3和图4所示)，经比对M与Aspergillus japonicus序列同源性达到98％和G与Gilbertellapersicaria序列同源性为100％，与形态学鉴定结果一致。
(2)天然抑菌剂对黑莓致腐菌的抑制作用。
1)最小抑菌浓度(MIC)的测定
菌液制备：取分离纯化得到的Aspergillus japonicus和Gilbertellapersicaria菌种划线接种到PDA培养皿上，25～28摄氏度培养1～2d，以5mL灭菌生理盐水洗下菌苔，制成浓度为个1×105/mL菌悬液。
采用微量二倍稀释法测定。取无菌96孔聚苯乙烯微孔板，用微量移液器在每孔中加入稀释好的抑菌剂，浓度由高到底，真菌每孔100μL至第10孔，第11孔中加无菌培养液(和无菌水作为空白对照，第12孔中加菌悬液和无菌水作为对照。第1～10孔依次加入上述制备好的菌液，每孔100μL，加液完成后加盖上板，轻微振荡混匀，置于28℃恒温培养箱中培养46h后观察结果。每种抑菌剂做3个平行。在每孔中加入显色剂MTT后继续培养2h，将微孔板放在白色背衬下观察，孔内液体显示颜色表示菌体生长没有被抑制，孔内液体无色表示菌体生长被抑制。菌体生长完全被抑制所对应的抗菌药物最低稀释度即为该抑菌剂的MIC，结果见表1。
表1抑菌剂对两种供试真菌的最小抑菌浓度(μg/ml)
从上表可以看出，那他霉素、壳聚糖、阿魏酸对两种黑莓病原真菌均具有一定的抑制作用。
2)体外联合抑菌能力的判定
根据单药抑菌实验结果，按棋盘实验法(checker-board titration)略作改良进行测定。取无菌96孔聚苯乙烯微孔板，用微量移液器在第1～8列沿X轴方向(从左到右)每列孔中依次加入：2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC的A抑菌剂50μL以同样方法在第A～F行沿Y轴方向(从上到下)每行孔中依次加入2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC的B抑菌剂50μL，将其混合均匀。依次加入上述制备好的菌液100μL，加液完成后加盖上板，轻微振荡混匀，置于恒温培养箱中28℃培养真菌48h后观察结果。那他霉素、阿魏酸和壳聚糖按上面方法两两配对，所得分级抑菌浓度指数结果见表2。
其中，分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)为抗菌药药效学参数之一，是两种抗菌药的联合药效(两种抗菌药同时使用时，可出现协同、颉颃、无关和拮抗四种情况)指标。FICI指数的计算方法：FICI＝A药联用时的MIC/A药单用时的MIC+B药联用时的MIC/B药单用时的MIC，FICI≤0.5，是协同作用；0.5<FICI≤1，是部分协同或相加作用；1<FICI≤2，是无关作用；FICI>2时是拮抗作用。
表2那他霉素、阿魏酸和壳聚糖体外联合抑菌能力判定结果(分级抑菌浓度指数)
从上表可知，阿魏酸和那他霉素联用对两种分离菌株均具有协同抑制作用。且阿魏酸和那他霉素的联用浓度分别为各自最小抑菌浓度的1/4和1/32，且效果比单独使用好得多，因此大大减少了抑菌剂的使用量。
实施例1(抑菌保鲜贮藏方法)
一种黑莓果实的抑菌保鲜方法及保鲜剂，按以下步骤进行：
(1)黑莓果实的采收与处理：选择成熟度相对一致(8～9成熟)，大小均一，无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗；
(2)黑莓果实的预冷处理：将挑选好的黑莓果实放入深度为10cm的塑料筐内，移入预冷间，分层摆放在不锈钢架上，温度为0℃条件下强制通风预冷处理4小时，黑莓果实核心温度预冷处理至约2℃；
(3)黑莓果实采用阿魏酸和那他霉素分别处理及联合使用：将预冷处理后的黑莓果实浸入含配置好的溶液中处理5-10min，沥出，晾干。
(4)黑莓果实分包装、低温贮藏：将保鲜剂溶液处理后的黑莓果实按125克/盒分装，盖紧盒盖，置相对湿度90～95％的冷库内于温度2±0.5℃下冷藏。贮藏期间，保持冷库内均衡的温湿度环境，每隔2天检查果实发霉腐烂情况，直至贮藏结束。
比较例一般贮藏方法：
选择成熟度相对一致(8～9成熟)，大小均一，无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗；置5℃预冷间放置12小时；将黑莓果实按125克/盒分装，盖紧盒盖，置相对湿度90～95％的冷库内，于温度2±0.5℃下冷藏。
按照下述方法对实施例1和比较例的黑莓果实分别进行检测，在贮藏12天时取样，其中，
(1)果实硬度测定：采用CatNo.9200(KM-1)型质构仪测定果肉硬度，探头直径为5.0mm，下压距离为5.0mm，下压速度为1mm/s。
(2)失重率的测定：果实的失重率＝(贮藏前的重量-贮藏后的重量)/贮藏前的重量×100％。
(3)果实腐烂率测定：果实腐烂率(％)＝腐烂果实数/总果实数×100％，烂果是指果实表面至少有一处发生汁液外漏、软化或腐烂现象。
(4)可溶性固形物含量测定：将果实挤汁、匀浆，用数显糖度计测定果实可溶性固形物含量。
(5)可滴定酸含量测定：将果实挤汁、匀浆，以自动滴定仪测定可滴定酸含量，结果以苹果酸百分数表示。
(6)果实花色苷含量测定：采用pH示差法进行测定，以矢车菊-3-葡萄糖苷计。
测定结果如图5至10所示。可以看出，随着贮藏时间的延长，黑莓果实硬度逐渐下降，本发明方法能很好的维持果实硬度(如图5所示)，贮藏至12d，果实硬度是一般贮藏方法的1.32倍，与贮藏初期无明显差异；果实的失重率降低，本发明方法果实的失重率为8.37％(如图6所示)，一般贮藏方法的失重率达到了9.13％；同时果实腐烂率降低，一般贮藏方法果实腐烂率达到9.67％，而本发明方法果实腐烂率仅为1.00％(如图7所示)，因此本发明方法维持了果实品质，延长了贮藏期。本发明方法能较好的维持果实TSS和TA含量(如图8、9所示)，在12d时，较一般贮藏方法略有升高和下降，果实商品性较好。本发明方法还能有效抑制果实花色苷的降解，在12d时，采用本发明方法果实花色苷含量较对照高24.25％(如图10所示)。
实施例2
一种黑莓果实的抑菌保鲜方法及保鲜剂，按以下步骤进行：
(1)黑莓果实的采收与处理：选择成熟度相对一致(8～9成熟)，大小均一，无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗；
(2)黑莓果实的预冷处理：将挑选好的黑莓果实放入深度为10cm的塑料筐内，移入预冷间，分层摆放在不锈钢架上，温度为2℃条件下强制通风预冷处理6小时，黑莓果实核心温度预冷处理至约4℃；
(3)黑莓果实采用阿魏酸和那他霉素联合使用：将预冷处理后的黑莓果实浸入含配置好的溶液中处理10-15min，沥出，晾干。
(4)黑莓果实分包装、低温贮藏：将保鲜剂溶液处理后的黑莓果实按125克/盒分装，盖紧盒盖，置相对湿度90～95％的冷库内于温度2±0.5℃下冷藏。贮藏期间，保持冷库内均衡的温湿度环境，每隔2天检查果实发霉腐烂情况，直至贮藏结束。
经实验检测可达到实施例1的技术效果，此处不再一一赘述。
实施例3
一种黑莓果实的抑菌保鲜方法及保鲜剂，按以下步骤进行：
(1)黑莓果实的采收与处理：选择成熟度相对一致(8～9成熟)，大小均一，无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗；
(2)黑莓果实的预冷处理：将挑选好的黑莓果实放入深度为10cm的塑料筐内，移入预冷间，分层摆放在不锈钢架上，温度为5℃条件下强制通风预冷处理8小时，黑莓果实核心温度预冷处理至约5℃；
(3)黑莓果实采用阿魏酸和那他霉素联合使用：将预冷处理后的黑莓果实浸入含配置好的溶液中处理15-20min，沥出，晾干。
(4)黑莓果实分包装、低温贮藏：将保鲜剂溶液处理后的黑莓果实按125克/盒分装，盖紧盒盖，置相对湿度90～95％的冷库内于温度2±0.5℃下冷藏。贮藏期间，保持冷库内均衡的温湿度环境，每隔2天检查果实发霉腐烂情况，直至贮藏结束。
经实验检测可达到实施例1的技术效果，此处不再一一赘述。

Claims (6)

1.一种黑莓果实抑菌保鲜剂，其特征在于：所述抑菌保鲜剂为阿魏酸、那他霉素混合溶液，溶剂采用无菌水，混合溶液中阿魏酸浓度为0.256mg/mL，那他霉素浓度为0.03125μg/mL。
2.黑莓果实抑菌保鲜方法，其特征在于：将黑莓果实浸入抑菌保鲜剂中处理5～20min，沥干，晾干后进行贮藏。
3.根据权利要求2所述的黑莓果实抑菌保鲜方法，其特征在于：所述贮藏采用低温贮藏，温度控制在2±0.5℃，相对湿度控制在90～95%。
4.根据权利要求3所述的黑莓果实抑菌保鲜方法，其特征在于：所述黑莓果实在进行抑菌保鲜剂处理前，先进行预冷处理，预冷处理温度为0～5℃，处理时间为4～8小时。
5.根据权利要求4所述的黑莓果实抑菌保鲜方法，其特征在于：所述黑莓果实在进行预冷处理前，先进行筛选处理：选择成熟度相对一致、大小均一、无机械伤、无病虫害的黑莓果实，去除果梗。
6.根据权利要求5所述的黑莓果实抑菌保鲜方法，其特征在于：所述黑莓果实在进行抑菌保鲜剂处理后，分包装进行低温贮藏；所述分包装的规格大小为：100～250克/盒，每盒两层果实。
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