CN111202064B - 厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌毒素抑制技术领域，具体公开了厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用。本发明经研究发现厚朴酚可以抑制交链孢菌合成交链孢酚、交链孢酚单甲醚和细交链格孢酮酸，并进一步提出了抑制交链孢菌合成真菌毒素的抑制剂及其制备方法与应用。本发明的抑制剂以厚朴酚为活性成分，辅以助溶剂、表面活性剂与水制备而成。本发明能够有效地抑制果蔬采后主要致病菌交链孢毒素的侵害，显著降低果蔬中真菌毒素交链孢毒素累积，进而减少果蔬腐败损失和提高产品安全性，且对人体健康无害、不会造成环境污染，具有很高的食品安全性，可作为传统合成类杀菌剂和化学防腐剂的替代品，具有广阔的应用前景。

Description

厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用
技术领域
本发明涉及真菌毒素抑制技术领域，具体地说，涉及厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用。
背景技术
果蔬是人类赖以生存的物质基础，为人类健康提供了丰富的营养。然而，由微生物侵染造成的采后果蔬腐烂占20％～25％，目前生产上多采用低温进行病害防控，但交链孢属真菌可在低温生长繁殖，是引起果蔬采后发病的主要致病菌之一。交链孢菌不仅造成严重的经济损失，且其产生的真菌毒素交链孢毒素引发人群食管癌的风险较大。早在1992年，食管癌高发已证明与食物中交链孢毒素污染较重密切相关。欧洲食品安全局已于2011年和2016年进行两次风险评估，结果表明随膳食摄入的交链孢毒素对公众健康存在潜在风险。
目前，多利用化学合成杀菌剂和农药控制果蔬由交链孢菌引起的采后病害和毒素累积，但是长期和大量使用合成杀菌剂可使交链孢菌产生抗药性而降低果蔬病害和毒素的控制效果，同时残留的合成杀菌剂可能对消费者的健康和环境产生不良影响。更为重要的是，已有研究显示，部分杀菌剂在降低病害的同时却刺激了毒素产生。针对目前常用的13种杀菌剂的筛选研究结果也发现，多菌灵可刺激交链孢毒素的累积。因此，亟需开发天然、绿色、无公害的新型果蔬采后病害和毒素控制技术。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种厚朴酚的新应用。具体地，本发明提供了一种厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用，其中，所述真菌毒素为交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)和细交链格孢酮酸(TeA)。
其中，厚朴酚的浓度>95％。
厚朴酚是传统中药厚朴提取物的主要成分之一，具有抗氧化、抗菌消炎等多种功效。但至今，该物质在毒素合成控制领域的应用未有报道。本发明经研究发现，厚朴酚在抑制交链孢菌合成的交链孢酚、交链孢酚单甲醚和细交链格孢酮酸时，效果显著。为厚朴酚拓展了应用领域。
本发明的目的还在于提供一种绿色、安全、无毒的果蔬采后毒素抑制剂及其制备方法与应用。
为此，本发明提供了一种抑制交链孢菌合成真菌毒素的抑制剂，所述真菌毒素为交链孢酚、交链孢酚单甲醚和细交链格孢酮酸；所述抑制剂的活性成分为厚朴酚。
本发明中，按质量份数包括：厚朴酚0.1～1.5份、助溶剂10～80份、表面活性剂0.5～5份、水1000份。
优选地，本发明中，厚朴酚：助溶剂：表面活性剂的质量比为1:100:4，此配方可获得更好的综合效果。
本发明中，所述助溶剂选自甲醇或乙醇中的一种或两种的混合物；优选所述助溶剂为乙醇，以利于提高产品安全性；和/或，所述表面活性剂为吐温20。
本发明的抑制剂对交链孢菌产生的真菌毒素的抑制率为37％～100％。
本发明还提供了一种制备上述抑制剂的方法，具体为：将厚朴酚溶解在助溶剂中后，加入表面活性剂充分混合，然后在搅拌下缓慢加入水。
本发明在加入表面活性剂充分混合后将形成均匀透明的溶液，然后在搅拌下慢慢加入水混匀后，将形成稳定的乳状液，利于提升厚朴酚的生物利用度。
本发明另提供了上述抑制剂或方法在控制交链孢菌引起的果蔬采后病害或毒素累积中的应用。
本发明中，所述应用的具体方式为：在果蔬采收前6～8d，优选7d，对所述果蔬进行所述抑制剂的喷施处理；或在果蔬采收后，将所述果蔬浸泡在所述抑制剂中2～30min后，捞出晾干。
本发明中，所述果蔬包括果实，所述果实具体可为樱桃、番茄。
本发明的有益效果至少在于：
1)本发明的植物源抑制剂，能够有效地抑制果蔬主要真菌毒素交链孢毒素的累积，进而减少果蔬腐败损失和提高产品安全性；
2)本发明的植物源抑制剂，其主要成分为来源于《可用于食品保健的物品名单》中厚朴的主要成分-厚朴酚，对人体健康无害且不会造成环境污染，具有很高的食品安全性，可作为传统合成类杀菌剂和化学防腐剂的替代品，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的抑制剂的外观图；
图2为本发明实施例1中不同浓度厚朴酚对互隔交链孢菌在PDB培养基上菌丝干重和毒素产生的影响，其中图2A为厚朴酚对交链孢菌菌丝干重的影响，图2B为厚朴酚对交链孢菌产生AOH毒素的影响，图2C为厚朴酚对交链孢菌产生AME毒素的影响，图2D为厚朴酚对交链孢菌产生TeA毒素的影响，图中，不同小写字母(a,b，bc和c)表示处理间具有显著差异(p<0.05)；
图3为本发明实施例2中厚朴酚对交链孢菌丝和孢子形态的影响的扫描电镜图片，其中图3A-图3C为扫描电镜下不同浓度厚朴酚培养后交链孢菌孢子形态图，图3D-图3F为扫描电镜下不同浓度厚朴酚培养后交链孢菌菌丝形状图；
图4为本发明实施例3中对樱桃果实上交链孢病斑形态及毒素产生的影响，其中图4A为樱桃果实上交链孢菌病斑形态图，图4B为樱桃果实贮藏8d后交链孢毒素含量；
图5为本发明实施例4中对番茄果实上交链孢病斑形态及毒素产生的影响，其中图5A为番茄果实上交链孢菌病斑形态图，图5B为番茄果实贮藏6d后交链孢毒素含量；
图6为本发明对比例1中含不同浓度厚朴酚的抑制剂对樱桃果实的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中交链孢菌为购买的标准菌株互隔交链孢Alternaria alternataATCC 66981。
实施例1
制备交链孢菌的孢子悬浮液，浓度为1×108个mL-1。取200μL的孢子悬浮液加入20mL含有0、6.25、12.5、25和37.5μM厚朴酚的PDB马铃薯液体培养基中，使液体培养基中孢子浓度为1×106个mL-1。将培养液于25℃，180rpm的摇床中震荡培养6d，过滤并保留滤液。取滤液500μL，加入乙腈500μL，30s充分震荡混匀，取1mL过0.2μM滤膜至进样瓶待测交链孢毒素含量。同时将过滤后的菌丝放入60℃烘箱干燥，测定不同厚朴酚处理对菌丝干重的影响。
本实施例对菌丝干重和TeA、AOH和AME毒素的水平进行了测试，测试结果见图2，其中图2A为厚朴酚对交链孢菌菌丝干重的影响，图2B为厚朴酚对交链孢菌产生AOH毒素的影响，图2C为厚朴酚对交链孢菌产生AME毒素的影响，图2D为厚朴酚对交链孢菌产生TeA毒素的影响。如图2所示，尽管6.25～12.5μM厚朴酚处理对交链孢菌的菌丝干重无显著影响，但可显著抑制交链孢菌产TeA、AOH和AME三种毒素。与未添加厚朴酚的对照相比，6.25μM厚朴酚在不影响交链孢菌生长的条件下，可使菌产AOH、AME和TeA毒素的抑制率分别达到50.0％、71.5％和37.0％。随着厚朴酚浓度的提升，抑制交链孢毒素合成能力增强。25μM厚朴酚处理可使交链孢菌产TeA、AOH和AME毒素的水平分别下降约83％、88.3％和98.8％，增加至37.5μM厚朴酚时，几乎可完全抑制交链孢菌产三种交链孢毒素。
实施例2
制备交链孢菌的孢子悬浮液，浓度为2×105个mL-1。取5μL的孢子悬浮液加入含有0、12.5和25μM厚朴酚的PDA培养基中，在25℃培养3d后，插入破碎并灭菌后的盖玻片。生长48h后取出，用水和0.1％的磷酸缓冲液各清洗两次。将清洗好的覆有菌丝的盖玻片经固定、脱水、冷冻干燥等步骤后，将干燥好的样品表面镀上一层金属膜，并置于扫描电镜下观察，观察结果见图3。其中图3A-图3C为扫描电镜下不同浓度厚朴酚培养处理后交链孢菌孢子形态图，图3A、图3B、图3C分别对应0、12.5和25μM厚朴酚培养结果，图3D-图3F为扫描电镜下不同浓度厚朴酚培养后交链孢菌菌丝形状图，图3D、图3E、图3F分别对应0、12.5和25μM厚朴酚培养结果。从图3可以看出，与对照(不加厚朴酚)相比，厚朴酚处理后孢子表面有凹陷；菌丝体不规则生长且萎缩，粗细不均匀，出现萎缩，变皱。可能归结于厚朴酚破坏了交链孢菌的细胞壁或细胞膜，导致内容物流出，最终导致细胞死亡，菌丝生长和孢子萌发受到阻滞。
实施例3
本实施例提供本发明的抑制剂，并进一步检测其对樱桃果实真菌毒素累积的抑制效果。
抑制剂包括厚朴酚、助溶剂、表面活性剂和水。所述助溶剂为乙醇。所述表面活性剂为吐温20。
所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：将厚朴酚溶解在助溶剂中后，加入表面活性剂充分混合成为均匀透明的溶液，在搅拌下慢慢加入水，混匀后形成稳定的乳状液(抑制剂外观参见图1)。
根据组成配比(按质量份数比)不同，将所述抑制剂分为四组分别进行对交链孢菌的抑制效果的检测，并设一组对照组。每组抑制剂成分及组成配比(按质量份数比)如下：
第4-1组：厚朴酚0.10份、乙醇10份、吐温20 0.5份、水1000份；
第4-2组：厚朴酚0.25份、乙醇25份、吐温20 1.0份、水1000份；
第4-3组：厚朴酚1.0份、乙醇80份、吐温20 5.0份、水1000份；
对照组：厚朴酚0份、乙醇10份、吐温20 0.1份、水1000份。
分别制备上述各组抑制剂并于樱桃果实收获前7d喷施于果树上，用法同常规化学杀菌剂。7d后收获果实，并向樱桃果实表面穿刺并注射20μL，1×105个孢子每mL的交链孢菌孢子悬浮液，自然晾干后贮藏。贮藏结束后，观察樱桃果实病斑形态，同时测定病斑处毒素含量，明确厚朴酚对交链孢毒素累积的抑制效率，具体测试结果见图4。
如图4所示，樱桃果实上交链孢菌病斑形态图见图4A。经检测，贮藏8d后AOH毒素含量分别比对照组减少了44.1％、65.6％和57.4％；AME毒素含量分别比对照组减少了30.4％、50.7％和43.5％；TeA毒素含量分别比对照组减少了55.1％、77.5％和69.3％(参见图4B)。其中，以第4-2组效果最为显著。
实施例4
本实施例提供本发明的抑制剂，并进一步检测其对番茄果实采后黑斑病和真菌毒素累积的抑制效果。
抑制剂包括厚朴酚、助溶剂、表面活性剂和水。所述助溶剂为乙醇。所述表面活性剂为吐温20。
所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：将厚朴酚溶解在助溶剂中后，加入表面活性剂充分混合成为均匀透明的溶液，在搅拌下慢慢加入水，混匀后形成稳定的乳状液。
根据组成配比(按质量份数比)不同，将所述抑制剂分为四组分别进行对交链孢菌的抑制效果的检测，并设一组对照组。每组抑制剂成分及组成配比(按质量份数比)如下：
第5-1组：厚朴酚0.25份、乙醇25份、吐温20 1.0份、水1000份；
第5-2组：厚朴酚0.50份、乙醇50份、吐温20 2.0份、水1000份；
第5-3组：厚朴酚1.50份、乙醇80份、吐温20 5.0份、水1000份；
对照组：厚朴酚0份、乙醇25份、吐温20 0.1份、水1000份。
分别制备上述各组抑制剂并将采收后的番茄果实浸泡10min。向浸泡后的番茄果实表面穿刺并注射20μL，1×105个孢子每mL的交链孢菌孢子悬浮液，自然晾干后贮藏。贮藏结束后，观察番茄果实病斑形态，同时测定病斑处毒素含量，明确厚朴酚对交链孢毒素累积的抑制效率，具体测试结果见图5。
如图5所示，番茄果实上交链孢菌病斑形态图见图5A。经检测，贮藏6d后AOH毒素含量分别比对照组减少了47.3％、59.4％和52.0％；AME毒素含量分别比对照组减少了29.7％、46.4％和37.7％；TeA毒素含量分别比对照组减少了55.1％、63.9％和58.8％(参见图5B)。其中，以第5-2组效果最为显著。
对比例1
本对比例采用与实施例3相同的方法制备抑制剂，区别仅在于：抑制剂成分及组成配比(按质量份数比)如下：
第6-1组：厚朴酚2.0份、乙醇80份、吐温20 5.0份、水1000份；
第6-2组：厚朴酚2.5份、乙醇85份、吐温20 5.0份、水1000份；
对照组(采用本发明实施例3的第4-2组作为对照)：厚朴酚0.25份、乙醇25份、吐温20 1.0份、水1000份。
分别制备上述各组抑制剂并于樱桃果实收获前7d喷施于果树上。7d后收获果实，贮藏8d后发现，厚朴酚浓度超过本发明保护范围(第6-1组、第6-2组)会对樱桃果实产生不同程度的药害，且药害程度随厚朴酚应用浓度的提高而变得更严重，而采用本发明实施例的抑制剂(对照)，不会产生药害(参见图6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.厚朴酚在抑制交链孢菌合成真菌毒素中的应用，其中，所述真菌毒素为交链孢酚、交链孢酚单甲醚和细交链格孢酮酸。
2.一种抑制交链孢菌合成真菌毒素的抑制剂在控制交链孢菌引起的果蔬采后毒素累积中的应用；所述真菌毒素为交链孢酚、交链孢酚单甲醚和细交链格孢酮酸；所述抑制剂的活性成分为厚朴酚。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂按质量份数包括：厚朴酚0.1～1.5份、助溶剂10～80份、表面活性剂0.5～5份、水1000份。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，厚朴酚：助溶剂：表面活性剂的质量比为1:100:4。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述助溶剂选自甲醇或乙醇中的一种或两种的混合物；和/或，所述表面活性剂为吐温20。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述助溶剂为乙醇。
7.根据权利要求3、4或6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的制备方法为：将厚朴酚溶解在助溶剂中后，加入表面活性剂充分混合，然后在搅拌下缓慢加入水。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的制备方法为：将厚朴酚溶解在助溶剂中后，加入表面活性剂充分混合，然后在搅拌下缓慢加入水。
9.根据权利要求2、3、4、6或8所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方式为：在果蔬采收前6～8d，对所述果蔬进行所述抑制剂的喷施处理；或在果蔬采收后，将所述果蔬浸泡在所述抑制剂中2～30min后，晾干。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方式为：在果蔬采收前6～8d，对所述果蔬进行所述抑制剂的喷施处理；或在果蔬采收后，将所述果蔬浸泡在所述抑制剂中2～30min后，晾干。
11.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方式为：在果蔬采收前6～8d，对所述果蔬进行所述抑制剂的喷施处理；或在果蔬采收后，将所述果蔬浸泡在所述抑制剂中2～30min后，晾干。
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采后厚朴提取物处理对桃果实抗病性的影响;张莉 等;《食品工业科技》;20101231(第10期);第137页 *

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