CN113462586B - 汉逊德巴利酵母y3进行草莓果实采后软腐病的生物防治及草莓果实贮藏保鲜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于果蔬采后生物防治技术领域，涉及汉逊德巴利酵母Y3进行草莓果实采后软腐病的生物防治及草莓果实贮藏保鲜的方法。汉逊德巴利酵母Y3，保藏编号为CCTCC NO:M 2021610。步骤为：将酵母活化培养，离心得到菌体，用无菌生理盐水配制成1×108cells/mL的酵母菌悬液，将草莓果实在酵母菌悬液中浸泡后，自然晾干，即实现草莓果实采后软腐病的生物防治及草莓果实的贮藏保鲜；本发明安全环保，可明显抑制草莓果实采后软腐病的发生，降低草莓果实采后自然腐烂率；同时对采后草莓果实的主要品质指标无不良影响，并且能够延缓草莓果实的品质衰败。
Description
技术领域
本发明属于水果采后病害生物防治领域，尤其涉及汉逊德巴利酵母Y3进行草莓果实采后软腐病的生物防治及草莓果实贮藏保鲜的方法。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa Duchesne)是蔷薇科(Rosaceae)、草莓属(Fragaria)，为多年生草本植物，其果实鲜美红嫩多汁，含有特殊的浓郁水果芳香，包括人体必需的维生素、矿物质、微量元素等，以及类黄酮，酚酸类等生物活性物质，具有“水果皇后”美称，是一种深受消费者喜爱的经济型水果之一。
我国是草莓的原产地之一，现如今随着人们物质生活的提升，人们在饮食上的需求也更加注重营养构成和风味，而草莓作为一种营养成分全面，色泽和香气都令人感官愉悦的季节性水果，其市场需求也逐渐增加，种植面积也随之逐年扩大。但因草莓果实组织娇嫩、果肉质软、果皮薄，采摘后不耐贮存，在其贮藏、运输以及销售过程中极易受到机械损伤和真菌侵染而发生采后病害。其中，真菌性病害引起的腐烂变质是草莓采后损失的主要原因。在真菌性病害引起的腐烂变质中以由匍枝根霉引起的软腐病害较为严重。
目前可以通过物理防治、化学防治等传统方法来防治草莓采后软腐病。由于化学杀菌剂具有抑菌效果好，成本低廉等优点，因此该方法成为主要控制草莓采后软腐病的方法。然而，长期大量使用化学杀菌剂不但会导致病原菌产生耐药性而降低杀菌效果,而且频繁地使用高浓度化学杀菌剂会增加草莓果实上的农药残留量，严重威胁人们的健康和破坏生态平衡。物理方法主要通过低温贮藏、气调贮藏、热处理、辐照处理等，这些方法通过改变采后草莓的代谢环境、外部环境等方式实现对软腐病的防治。但物理防治方法因对设备要求高，成本较大等弊端而限制了其在现实中的应用。
因此，开发方便、安全、无毒、高效、对环境友好型的草莓采后软腐病控制新技术成为当前国际上的研究热点。其中利用生物拮抗菌防治是目前被证明安全有效的新方法。迄今为止，国内外已经筛选出了许多对水果采后病原真菌具有明显抑菌效果的细菌、霉菌和酵母菌，其中拮抗酵母菌由于拮抗效果好、不产生真菌毒素、不产抗生素、营养需求简单、对环境友好等优势成为安全、高效的草莓采后病害防治新手段。
然而，目前大多数拮抗酵母菌有抑菌谱窄、使用效果不稳定等不足之处，导致多数拮抗酵母菌的生物防治效果仅在少数果实上得到验证，并且效果有待提高。
发明内容
针对上述技术难题，本发明的目的在于提供一株分离自草莓果实表面的能够高效控制草莓果实采后软腐病的汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3，能够有效控制草莓果实采后软腐病的发生，减少草莓采后软腐病造成的食用损失和商业损失，具有潜在的商业应用价值。
为了实现以上目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所提供的防治草莓果实采后软腐病的酵母菌株是从草莓果实表面分离得到的，在NYDA固体培养基平板上28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定。该汉逊德巴利酵母Y3的保藏信息具体如下：保藏号为CCTCC NO:M 2021610；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期：2021年5月26日；建议的分类名为：汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)Y3。
汉逊德巴利酵母Y3进行草莓采后软腐病防治和贮藏保鲜的方法，按照以下步骤进行：
首先用液体培养基将汉逊德巴利酵母进行活化培养，经活化培养后离心得到菌体，将菌体用无菌生理盐水配制成浓度为1×108cells/mL的酵母菌悬液，用无菌打孔器对草莓果实进行打孔，在每孔分别注入一定体积的汉逊德巴利酵母菌悬液，自然晾干后再于每孔分别接种与酵母菌悬液等体积的匍枝根霉孢子悬浮液，浓度为1×104spores/mL，由此验证汉逊德巴利酵母可实现对由匍枝根霉引起的草莓果实软腐病的有效防治；
或者将采摘后保持自然状态的草莓果实浸入浓度为1×108cells/mL的酵母菌悬液，浸泡后取出，放入干净的塑料筐中自然晾干后，保鲜膜密封贮藏；即可实现对草莓采后软腐病的防治及贮藏保鲜。
所述液体培养基发酵培养的条件为：28℃、180r/min条件下培养24h。
所述NYDA固体培养基的成分如下:牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。
所述液体培养基是NYDB培养基，成分如下:牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。
所述的离心条件为：离心力为7000g，时间5min；所述打孔的孔径为3mm，深度3mm。
所述在孔中注入的汉逊德巴利酵母菌悬液和匍枝根霉孢子悬浮液的体积均为30μL。
所述浸泡的时间为30-40s。
本发明的优点：
1.本发明所提供的汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3为本实验室从草莓果实上筛选得到，对人体安全无害。
2.本发明所提供的汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3在培养基中生长良好，易于培养、性状稳定，单独使用一定浓度该菌悬液就能有效防治草莓采后软腐病，取得了意想不到的显著效果，拥有广阔的市场前景。
3.本发明所提供的汉逊德巴利酵母可以代替化学杀菌剂防治草莓采后软腐病，能避免使用化学杀菌剂对人体和环境的危害，因此具有显著的社会和生态效益。
附图说明
图1中(a)和(b)分别为匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的ITS区及P区核酸序列系统发育进化树图。
图2为酵母菌Y3对草莓果实采后软腐病的抑制效果；注CK为对照组无菌生理盐水；Y3为浓度1×108cells/mL的酵母Y3菌悬液；不同字母代表差异显著。
图3为本发明汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3的ITS区核酸序列系统发育进化树图。
具体实施方式
通过以下实施实例更加详细地说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1：
本发明所提供酵母菌株是从镇江句容果园采摘的草莓果实表面分离得到的；具体的汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3及软腐病的病原菌匍枝根霉(R.stolonifer)的获取方法步骤如下：
1.从草莓果实上分离纯化出疑似酵母单菌落，记为酵母Y3；
随机取样称取20g草莓果实，加入到150mL无菌水中震荡洗脱，并进行梯度稀释，分别得到10-1、10-2、10-3、10-4溶液。分别从稀释溶液中吸取100μL涂布于孟加拉红培养基上，28℃培养24h，挑取优势酵母单菌落，在NYDA培养基上分离纯化。将分离纯化后的菌株接种到NYDB培养基里28℃，180r/min培养20-24h，用50％甘油于-80℃冰箱保藏备用。
其中，孟加拉红培养基的成分如下：孟加拉红36.6g，蒸馏水1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。
2.从草莓果实上分离纯化出疑似匍枝根霉
切取腐烂的草莓果实，加入到150mL无菌水中震荡洗脱，并进行梯度稀释，分别得到10-1、10-2、10-3、10-4的溶液。分别从稀释溶液中吸取100μL涂布于孟加拉红培养基上，25℃培养36h，挑取疑似匍枝根霉在PDA培养基上分离纯化。用无菌生理盐水将分离纯化后的疑似匍枝根霉洗脱成菌悬液，用50％甘油于-80℃冰箱保藏备用。
其中，PDA培养基的成分如下：200g土豆去皮煮沸20min,葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。
3.疑似匍枝根霉的分子生物学鉴定
对分离筛选出的疑似匍枝根霉以真菌通用引物和根霉特异性引物分别扩增ITS区核酸序列和特异性P区核酸序列，将产物的测序结果输入https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，从NCBI数据库中下载同源序列，通过MEGA6软件构建系统发育进化树如图，确定筛选到的菌株为匍枝根霉。
4.拮抗匍枝根霉(R.stolonifer)酵母菌的筛选
(1)酵母Y3菌悬液的制备
将酵母Y3从-80℃冰箱取出，用NYDB培养基活化两次，活化条件均为28℃、180r/min条件下培养24h；活化培养后离心收集菌体，用无菌生理盐水洗2遍；用血球计数板计数，配制成浓度为1×108cells/mL的酵母菌悬液。
(2)匍枝根霉(R.stolonifer)孢子菌悬液的制备
将病原菌匍枝根霉先在PDB培养基中活化培养，活化培养后离心收集菌体，用无菌生理盐水配制成浓度为1×104cells/mL匍枝根霉孢子悬浮液待用。
其中，PDB培养基的成分如下：200g土豆去皮煮沸20min，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，115℃高压蒸汽灭菌20min。
(3)拮抗匍枝根霉(R.stolonifer)酵母菌株的筛选
挑选大小均匀、无机械损伤，成熟度基本一致的成熟草莓果实放入干净塑料筐中备用。用无菌打孔器在草莓果实赤道处打1个孔，伤口直径为3㎜×3㎜。每个伤口加入30μL酵母菌悬液和无菌生理盐水，自然晾干后接种30μL匍枝根霉孢子菌悬液，待自然晾干后密封，置于20℃恒温恒湿培养箱，放置3天后记录草莓果实的发病率，以此评价拮抗酵母的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率＝发病的果实数/果实总数×100％。
(4)拮抗匍枝根霉(R.stolonifer)酵母菌株的筛选结果
如图2所示，室温存放3d，无菌水对照组的腐烂率为75.13％，说明匍枝根霉侵染草莓果实能力很强；经本发明筛选的酵母Y3处理的草莓，与对照组相比腐烂率降低60％以上，说明酵母Y3可以显著抑制草莓采后软腐病的发生。
实施例2：
汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3及匍枝根霉的微生物学特性；
1.分子生物学鉴定
(1)酵母Y3的分子生物学鉴定
对分离筛选出的酵母Y3以真菌通用引物扩增ITS区核酸序列，将产物的测序结果输入https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，从NCBI数据库中下载同源序列，通过MEGA6软件构建系统发育进化树如图3，确定筛选到的酵母Y3为汉逊德巴利酵母；本发明所提供的防治草莓果实采后病害的酵母Y3，现保存位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021610，保藏日期为2021年5月26日，建议的分类命名为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)Y3。
2.汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3形态学特征
(1)在NYDB液体培养基中培养24h后，菌液变浑浊，镜检酵母细胞呈球形和椭球形，出芽生殖。
(2)在NYDA培养基(牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，琼脂20g，115℃高压蒸汽灭菌20min)上28℃培养48h，菌落呈白色、圆形，菌落边缘光滑整齐无褶皱。
3.匍枝根霉(R.stolonifer)的形态学特征
在PDA培养基(200g土豆煮沸20min，葡萄糖20g，琼脂20g)上培养36h，菌落生长旺盛，菌丝疏松，呈白色细长状，菌丝顶端有黑色孢子。
实施例3：
汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3的安全性研究；
1.试验方案
供试动物为清洁级为SPF级的ICR小鼠，购买于常州卡文斯实验动物有限公司，选择体重范围在18g-22g的小鼠共40只，雌雄各半。试验前，将小鼠放置在江苏大学实验动物中心检疫3天。试验小鼠共分为4组，每组10只，雌雄各5只。4组小鼠分为0g/kg，10g/kg，21.5g/kg和46.4g/kg四个剂量组进行实验。采用经口灌胃方式，按0.4mL/20g体重进行实验。观察14d，整个实验过程中，观察小鼠的日常状况是否有中毒死亡现象。若出现小鼠，必要时可将试验延长到28d。计算半数致死量，并进行毒性分级。
2.实验结果
按照上述试验步骤，统计汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3安全性实验结果如下：
由表1可以看出，灌入汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3的小白鼠14d未出现死亡，且LD 50值大于5000mg/kg体重，根据急性毒性分级标准可知，汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3属于安全无毒类酵母。
表1汉逊德巴利酵母Y3的急性经口毒性实验结果
实施例4：
汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3对草莓果实自然腐烂率及其储藏品质的影响
将汉逊德巴利酵母从-80℃冰箱取出，用NYDB培养基活化两次，于28℃、180r/min条件下培养24h，离心收集菌体,用无菌生理盐水洗2遍，用血球计数板计数配成配制成浓度为1×108cells/mL的汉逊德巴利酵母菌悬液。将保持自然状态的草莓果实放入酵母菌悬液中，浸泡30秒后取出，放入干净塑料筐中自然晾干后，保鲜膜密封于20℃贮藏，实现对草莓采后软腐病的防治及贮藏保鲜。其中保持自然状态的草莓果实是指采摘后的草莓不做任何处理。
经存放5d后，记录腐烂率，并测量失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定性酸、抗坏血酸、褐变度等品质指标。
其中，腐烂率计算公式为：腐烂率＝腐烂草莓数量/草莓总个数×100％。实验重复三次。
失重率计算公式为：失重率＝(起始重量-贮藏后重量)/起始重量×100％。实验重复三次。
硬度：使用TA-XT2i物性仪测定。选用P5探针，参数设定：“压力测量”模式，测试前，测试中，测试后探针的运行速度分别为4mm/s，1mm/s，5mm/s，测试深度为6mm。选定草莓赤道处每120°的三个点进行测试，探头插入草莓时所受到的最大阻力记为硬度(N)。实验重复三次。
可溶性固形物(TSS)：室温下用手持糖度计测定TSS含量(g/100g)。实验重复三次。
可滴定酸(TA)：从每个处理中随机抽取6个草莓，从中取20g果肉组织加入2mL蒸馏水研磨成匀浆，定容至200mL得到提取液。在20mL提取液中加入两滴1％的酚酞，用0.1MNaOH滴定。为使滴定结果准确0.1M NaOH可以适当稀释。结果以柠檬酸百分含量表示。实验重复三次。
抗坏血酸(VC)：用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定抗坏血酸含量(mg/100g)。实验重复三次。
褐变度：从6个草莓果实上称取20g果肉，加40mL蒸馏水迅速研磨，1000r,4℃条件下离心10min，取10mL上清液加入15mL95％乙醇，取上清液于420nm处测定其吸光度值，以此表示褐变度。实验重复三次。
试验结果如下：
按照上述步骤试验，测定草莓果实的腐烂率和各项贮藏品质。结果如表1所示，在20℃贮藏5d后，与对照组相比，汉逊德巴利酵母处理草莓果实后的自然腐烂率显著降低，取得了意想不到的显著效果；同时失重率及VC的损失也显著延缓，其他和品质相关的指标未有显著性差异，证明该酵母对草莓品质指标没有任何不良影响并且会在一定程度上延缓草莓果实品质衰败。
表1汉逊德巴利酵母(D.hansenii)Y3对草莓果实贮藏品质的影响
注：CK：无菌生理盐水处理组，即对照组；Y3：浓度为1×108cells/mL的汉逊德巴利酵母Y3菌悬液处理组。不同字母代表差异显著(P<0.05)。
汉逊德巴利酵母菌株(Debaryomyces hansenii)Y3的保存：可以选择使用NYDA培养基在4℃冰箱保藏，也可以选择将酵母于-80℃下长期保存于50％甘油管中。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (7)
1.汉逊德巴利酵母用于草莓果实采后软腐病的生物防治及草莓果实贮藏保鲜的用途，其特征在于，按照以下步骤进行：
首先用液体培养基将汉逊德巴利酵母进行活化培养，经活化培养后离心得到菌体，将菌体用无菌生理盐水配制成浓度为1×108cells/mL的酵母菌悬液，用无菌打孔器对草莓果实进行打孔，在每孔分别注入一定体积的汉逊德巴利酵母菌悬液，自然晾干后再于每孔分别接种与酵母菌悬液等体积的匍枝根霉孢子悬浮液，浓度为1×104spores/mL，实现对由匍枝根霉引起的草莓果实软腐病的有效防治；
或者将采摘后保持自然状态的草莓果实浸入浓度为1×108cells/mL的酵母菌悬液，浸泡后取出，放入干净的塑料筐中自然晾干后，保鲜膜密封贮藏；即可实现对草莓采后软腐病的防治及贮藏保鲜；
汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)Y3，保藏编号为：CCTCC NO:M2021610。
2.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述活化培养的条件为：28℃、180r/min条件下培养24h。
3.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述液体培养基是NYDB培养基，成分如下:牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌20min。
4.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的离心条件为：离心力为7000g，时间5min。
5.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述打孔的孔径为3mm，深度3mm。
6.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述在孔中注入的汉逊德巴利酵母菌悬液和匍枝根霉孢子悬浮液的体积均为30μL。
7.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的时间为30-40s。
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