CN107460134B - 一株控制梨果采后病害的季也蒙毕赤酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株控制梨果采后病害的季也蒙毕赤酵母，属于水果采后病害生物防治领域。该酵母经鉴定为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii），保藏编号为：CCTCC NO:M 2017270。使用时将季也蒙毕赤酵母活化、培养，离心得到菌体，菌体用无菌水稀释制备成1.0×108个/mL的菌悬液。用上述菌悬液浸泡梨果约1min。之后，梨果自然风干，放于塑料筐中，用保鲜膜密封后，置于室温条件下存放。经该酵母处理的梨果青霉病发病率和自然腐烂率均显著降低。因此，季也蒙毕赤酵母可以代替化学杀菌剂防治梨果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

一株控制梨果采后病害的季也蒙毕赤酵母
技术领域
本发明涉及一株季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1，该菌株可以控制梨果采后青霉病，属于水果采后病害生物防治领域。
背景技术
梨(Pear)属蔷薇科植物。梨果含有多种维生素、蛋白质、糖、脂肪、粗纤维、钙、磷、铁等矿物质，具有降血压、养阴清热、促进食欲、助消化、利尿通便和解热等功效，深受消费者喜爱。目前，中国是世界上梨果生产量及出口量最大的国家，2010/2011年度产量占世界总产量的70％，出口量占世界总出口量的30％。我国梨种植范围广，北起黑龙江，南至广东，西自新疆，东至海滨，种植的品种繁多。然而，梨果采后在贮藏、运输、销售过程中损失较为严重。导致梨果采后损失的因素很多，包括由于水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质劣变，由于采后逆境造成的生理代谢失调，由于采后成熟衰老造成果蔬的组织结构的崩溃以及由于病原物侵染造成的腐烂等。其中病原微生物的侵染造成的腐烂是主要原因，梨果主要病原菌为扩展青霉(Penicilliim expansum)和灰葡萄孢霉(Botryitis cinerea)。
目前，人们常采用一些化学方法、物理方法控制果实采后病害的发生。物理方法控制采后病害的一大优点是没有残留，而且大部分物理方法不会对环境造成污染。在物理防治方法中，热处理是研究最为广泛的方法。蒸汽加热、热水浸渍以及加压热气处理等，均能显著控制果实采后病害。热处理能增强SBC对柑橘的病害控制：50℃的SBC溶液对柑橘绿霉病和青霉病的控制效果要强于20℃的SBC溶液。除此之外，果实采后病害的物理防治方法还包括UV处理、微波处理等。但是，过高的剂量会对果实品质造成一定的损伤。自1960年开始，化学杀菌剂成为了降低水果采后病害最重要的手段。但是直到20世纪90年代中期，科研工作者才研制出了可有效控制由P.expansum引起的青霉病的杀菌剂benzimidazole。目前，美国用于控制水果采后青霉病的杀菌剂有captan，thiabendazole(TNZ)，fludioxonil，以及pyrimethanil，控制梨果采后病害使用的杀菌剂主要是thiabendazole。而在欧洲，这四种杀菌剂均被禁止使用。化学杀菌剂具有高效、低价、使用方便等特点，但它会造成环境污染、危害人畜健康，并引发病原菌的抗药性。与此同时，随着人们对环境、生态、健康的关注度持续上升，针对化学杀菌刹使用的政策将越来越严格。因而，积极寻找可替代化学杀菌剂的、高效、安全的果实病害防治方法显得尤为重要。
生物防治法利用拮抗微生物对水果采后病害进行控制，具有高效、对环境友好等优点，是最有希望取代化学杀菌剂的方法。目前，已研究可作为果蔬采后病害生防拮抗菌的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌因其遗传稳定，抑菌谱广、效价高等优势而成为主要的研究对象。酵母菌一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，且能在果实表面快速利用营养物质增殖和长时间存活，与霉菌竞争营养和空间，从而抑制其生长；酵母还耐受低温，对低温储运的水果病害的防治效果往往高于常温储运的水果，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容，因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。
水果采后拮抗酵母的首次报道是jannisiewicz于1987年研究了一株编号为F-43-31的酵母对苹果采后青霉病的防治作用。随后，拮抗酵母的研究陆续开始受到关注。目前，应用于水果采后病害生物防治的抗酵母约有40多种，主要来自7个属，分别为假丝酵母属(Candida spp.)、隐球酵母属(Cryptococcus spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、梅奇酵母属(Metschnikowia spp.)、红酵母属(Rhodotorula spp.)、丝孢酵母属(Trichosporonspp.)、克勒克酵母属(Kloechera spp.)。目前应用于水果采后生物防治的毕赤酵母属主要有四种，但还没有季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在梨果应用上的报道。
近几十年来，研究人员分离、鉴定了多种微生物，并评估了其生防效力。Benbow等在采收前一天利用Cryptococcu infcrmo-miniatus，C.laurentii和Rhodotorulaglutinis对梨果进行处理，结果表明，这三株菌均能有效地控制梨果的采后腐烂。马龙传用粘红酵母(1×108cells/mL)处理水晶梨(每个伤口接种30μl的酵母菌，2h后再接种20μl浓度为1×105spores/mL的P.expansun孢子悬浮液)，20℃培养7d的结果表明，处理组腐烂率(80％)、腐烂直径(1.2cm)显著低于对照组(100％，1.8cm)，说明该酵母能抑制梨果实青霉病的发生(Hongyin Zhang,Food Chemistry,2009,117.)。卢黄娉发现，海洋酵母(R.Paludigenum，1×108cells/mL)处理梨果(每个伤口接种30μl的酵母菌，2h后再接种30μl浓度为1×104spores/mL的P.expansun孢子悬浮液)，25℃培养，每天定时记录病害发生情况和病斑直径，结果发现，第6d梨果青霉病导致的腐烂率和平均病斑直径(40％，8mm)，显著低于对照组(100％，28mm)(卢黄娉等，中国食品学报，2016，16)。胡浩的研究表明：1×108cells/mL的西藏胶红酵母处理梨果(每个伤口处接种50μl的酵母，2h后，每个伤口处加入30μl浓度为1×104spores/mL的P.expansun孢子悬浮液)，在20℃储藏7d，梨果实青霉病导致的腐烂率和腐烂直径(40.4％、6.47mm)显著低于对照(100％、27.5mm)(专利申请号为CN 105112312A)。
本发明中的季也蒙毕赤酵母被认为是最安全的酵母之一，研究证明，该酵母能显著降低梨果采后病害的发生，降低水果的腐烂率，从而达到水果贮藏保鲜的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一株分离自梨果园的季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)Y1，该酵母能够高效控制梨果采后病害的发生，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。
本发明采用的技术方案
本发明所提供的防治梨果采后病害的酵母菌株Y1筛选分离自江苏省镇江市句容的梨果园，在NYDA固体培养基平板上28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定。
本发明所提供的防治梨果采后病害的酵母菌株，现保存位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017270，保藏日期为2017年5月17日，建议的分类命名为季也蒙毕赤酵母Y1Meyerozyma guilliermondii Y1。
利用季也蒙毕赤酵母Y1对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的方法，按照下述步骤进行：将季也蒙毕赤酵母Y1在NYDA培养基、28℃培养48h进行活化，然后在NYDB培养基、28℃发酵培养24h，离心洗涤得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0×108cells/mL的菌悬液；将梨果打洞后加入上述菌悬液，2h后接种扩展青霉孢子悬浮液，或用上述菌悬液浸泡梨果约1min；梨果置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，于室温下存放，即可达到对梨果采后病害防治及贮藏保鲜的效果。
其中所述的NYDA培养基为：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min。
其中所述的NYDB培养基为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水1000ml，pH自然，121℃灭菌30min。
本发明的优点：
(1)本发明所使用的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1为本实验室自主筛选分离，经急性毒性动物实验证明其对人体无害。
(2)本发明所使用的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1抑菌谱广，可以显著抑制梨果采后青霉病的发生，并且显著降低梨果采后自然腐烂率，从而降低梨果采后病害造成的损失。
(3)本发明所使用的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1目前尚未有在梨果上应用的报道，具有一定的新颖性。
本发明使用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1，可以代替化学杀菌剂防治梨果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人体的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明
图1为根据本发明中季也蒙毕赤酵母Y1 5.8S rDNA-ITS区序列构建的进化树。
图2为季也蒙毕赤酵母Y1对梨果青霉病的抑制效果。注：CK：无菌水处理组，即对照组；Y1：1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母Y1菌悬液处理组。不同字母代表差异显著(P<0.05)，A图为腐烂率，B图为腐烂直径。
具体实施方式
实施例1：季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)Y1菌株微生物学特性如下：
一)形态学特征
(1)NYDA培养基(牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min)上28℃培养48h，菌落呈圆形、边缘光滑、较湿润、易挑起。细胞形态呈椭圆形，单个分散。
(2)在NYDB液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。
二)分子生物学鉴定
对分离筛选出的酵母菌株Y1的5.8S rDNA-ITS区序列分析，在GenBank检索，确定为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。
本发明所提供的防治梨果采后病害的酵母菌株Y1，现保存位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO:M2017270，保藏日期为2017年5月17日，建议的分类命名为季也蒙毕赤酵母Y1Meyerozyma guilliermondii Y1。
实施例2：季也蒙毕赤酵母Y1安全性实验
一)实验方案
酵母菌泥的制备及总数测定
季也蒙毕赤酵母Y1(Meyerozyma guilliermondii Y1)接种在装有NYDB培养基的三角瓶中，放于摇床，28℃培养20h后，离心获得菌泥。用无菌水对菌泥做梯度稀释(10-4，10-5，10-6，10-7)，然后再吸取100μL稀释液进行均匀涂布(NYDA)，培养后统计实验结果。整个实验平行2次。每次小鼠灌胃的菌液均来自新鲜的菌泥稀释。
实验对象为ICR小鼠，由江苏大学动物实验中心提供，合格证编号NO.201613561，许可证号SCXK(苏)2013-0011，执行标准GB15193.3-1994。小鼠体重18g-22g，清洁级。在实验前，需要将小白鼠置于动物房环境中适应一段时间(3d)。将小白鼠分成10，21.5，46.4和100g/kg四个剂量组进行实验，每个剂量组10只小白鼠，雌雄各半。采用经口灌胃方式，按0.1mL/l0g体重(100g/kg剂量组按0.2mL/10g体重给受试物)。观察14d，整个实验过程中，观察小白鼠的日常状况，包括一般行为、外观改变以及是否有中毒或死亡现象。若出现死亡现象，必要时可延长到28d。求出半数致死量，并确定急性毒性分级。
二)实验结果
按照上述试验步骤,统计季也蒙毕赤酵母Y1安全性实验结果如下:
灌入季也蒙毕赤酵母Y1的小白鼠14d内未出现死亡。并且由表1可以看出，整个实验过程中小白鼠未出现中毒现象，且该实验小鼠雌、雄性经口LD 50均大于100g/kg体重，根据急性毒性分级标准可知，季也蒙毕赤酵母Y1属于安全无毒类酵母。
表1季也蒙毕赤酵母Y1对小鼠经口急性毒性实验结果
Figure BDA0001336088020000081
实施例3：季也蒙毕赤酵母Y1对梨果青霉病的控制效果
一)实验方案
季也蒙毕赤酵母Y1接种在装有NYDB培养基的三角瓶中，于摇床中180rpm、28℃培养20h后，离心获得菌体，用无菌水重悬并调节浓度至1×108cells/mL。扩展青霉(P.expansum)在PDA培养基上于28℃培养7d，以无菌水洗下孢子并调节孢子浓度为1×105spores/mL。
供试的果实经过精细挑选，选择果实均匀一致、表面无擦伤、无机械损伤和无病虫伤害的梨果，用灼烧过的打孔器在梨果果实表面赤道位置形成3个均匀分布且大小、深度一致的伤口(5mm×3mm)。每个伤口处等量加入30μL以下处理液：(1)1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母菌悬液；(2)对照等体积加无菌蒸馏水。2h后，向梨果伤口处分别接种30μL 1×105spores/mL的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实置于塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(湿度95％，20℃)。每处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过4d的培养，记录果实发病率，以此评价季也蒙毕赤酵母Y1对梨果青霉病的抑制效果。
发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
二)实验结果
按照上述试验步骤,统计水果的腐烂率结果如下：
如图2所示，对照组果实的发病率为100％，经季也蒙毕赤酵母Y1处理的梨果发病率为37.96％，处理组发病率显著低于对照组(P<0.05。与西藏胶红酵母(R.mucilaginosa)处理梨果的效力(专利申请号为CN 105112312A)相比，该申请中在降低季也蒙毕赤酵母Y1使用量，而提高扩展青霉的浓度的情况下，梨果发病率却略低，表明季也蒙毕赤酵母Y1对梨果采后青霉病具有更好的防腐保鲜效果。同时，经季也蒙毕赤酵母Y1处理的梨果的腐烂直径(10.6mm)也显著低于对照组(17.7mm)。表明季也蒙毕赤酵母Y1在20℃下能够有效控制由扩展青霉导致的梨果采后青霉病。
实施例4：季也蒙毕赤酵母Y1对梨果采后自然腐烂和贮藏品质的影响。
一)实验方案
将水果浸泡于以下处理液中约1min，自然晾干：(1)1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母菌悬液；(2)对照组为无菌水。将处理好的果实置于塑料筐用保鲜膜密封。恒温培养箱(湿度95％，20℃)中贮藏35d。35d后，测定果实的发病率和果实贮藏品质相关指标。每处理重复3次，整个实验重复2次。季也蒙毕赤酵母Y1对水果自然腐烂的抑制效果以发病率表示。
1、发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
2、贮藏品质测定方法如下：
(1)失重率：即计算处理前和处理后梨果重量的变化。失重率＝(处理前(g)-储藏后(g))/处理前(g)×100％。
(2)可溶性固形物：参照Larrigaudière等的方法，使用WYT手持糖度计进行观察测定，结果用g/100g样品来表示。此处理重复3次。
(3)可滴定酸度(％)：采用滴定法，参照治安等的方法，略有改善。随机挑选若干个梨果，称20g果实样品，加入40mL水进行匀浆，再加入适量的蒸馏水清洗至刻度为100mL烧杯中，置于温度设为80℃的恒温水浴锅中浸提30min，搅拌若干次，蒸馏水定容至刻度。过滤后取20mL滤液于100mL小烧杯中，加入酚酞指示剂2-5滴，用0.1mol/L NaOH溶液进行滴定，当溶液逐渐变成微红色且30s内不退色即为终点，记录所使用的NaOH体积，结果以苹果酸的百分数表示。此处理重复3次。
(4)褐变度：参照Lee(2002)的方法，稍作改动。随机挑选若干个梨果，称20g果实样品，加入40mL蒸馏水匀浆，均质液10000rpm，4℃下离心10min，取上清10mL加入95％乙醇15mL，然后10000rpm，4℃下离心10min，上清液420nm处测定吸光值，以此数值表示褐变程度。此处理3次重复。
(5)维生素C(Vc)含量：紫外快速测定法，略有改动。随机挑选若干个梨果，取10g果实样品加20mL1％HCl匀浆，装入50ml容量瓶并定容。10000rpm，室温下离心10min，上清液用于后续测验。取0.4mL上清液，加入有0.8mL10％HCl的10mL刻度试管中，加水稀释至刻度后摇匀。空白校正后，在243nm处测定上述溶液吸光值。另取0.4mL上清液，分别加入4mL蒸馏水和1.6mL NaOH(1mol/L)溶液至10mL至刻度试管，摇匀，静置15min后，加入1.6mL 10％HCl，混匀，加蒸馏水定容至刻度。空白校正用蒸馏水，在243nm处测定吸光度。制作Vc标准曲线，计算两次测得A243值，求其差值，计算样品中Vc的含量。每处理3次重复。
(6)硬度：参考Zhang等人方法，采用TA-XT2Plus质构分析仪测试，探头直径为5mm，测试深度为6mm，质构仪探头在测试前、中、后的运行速度都为1.0mm/s。探头插入梨果过程中所受的最大阻力(单位为N)被定义为果实的硬度。绕水果赤道处每120°测定1次。
二)实验结果
1、按照上述步骤试验，统计的实验结果如下：
从表2可以看出，在20℃贮藏35d之后，经季也蒙毕赤酵母Y1处理的梨果的自然腐烂率(8％)显著低于对照组(25％)。比用罗伦隐球酵母(1×108cells/mL)浸泡处理对梨果自然腐烂具有更好的控制效果，其酵母处理组为26.2％，对照组为43.3％(专利申请号为CN101697750A)。
2、统计的贮藏品质结果如下：
表2季也蒙毕赤酵母Y1对梨果贮藏品质的影响
Figure BDA0001336088020000111
注：CK：无菌水处理组，即对照组；Y1：1×108cells/mL的季也蒙毕赤酵母Y1菌悬液。不同字母代表差异显著(P<0.05)。
从表2可以看出，在20℃贮藏35d之后，经季也蒙毕赤酵母Y1处理的梨果的失重率、可溶性固形物、可滴定酸、褐变度与对照相比均无明显差异，而硬度和Vc含量具有显著提高。表明季也蒙毕赤酵母Y1对梨果采后自然腐烂具有显著的抑制效果，但对其品质无显著不良影响。
实施例4：季也蒙毕赤酵母Y1的保存
首选培养基为NYDA培养基，也可以使用马铃薯琼脂培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，自来水1000毫升，pH 7.0～9.0。季也蒙毕赤酵母Y1在上述培养基斜面26℃～28℃，培养36h，于4℃低温保藏。

Claims (1)

1.季也蒙毕赤酵母Y1对梨果采后青霉病及自然腐烂的防治及贮藏保鲜方法，所述 季也蒙毕赤酵母的 保藏编号为：CCTCC NO: M 2017270，建议的分类命名为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）Y1 ；
按照下述步骤进行：将季也蒙毕赤酵母Y1在NYDA培养基、28℃培养48 h进行活化，然后在NYDB培养基、28℃发酵培养24 h，离心得到菌体，用无菌水稀释制备成1×108 cells/mL的菌悬液；用上述菌悬液浸泡梨果约1 min；之后，梨果自然风干，放于塑料筐中，用保鲜膜密封后，置于室温条件下存放；
其中所述的水果为梨果；
其中所述的NYDB培养基为：酵母膏5 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，蒸馏水1000 ml，pH自然，121℃灭菌30min；
其中所述的NYDA培养基为：牛肉膏8 g，酵母浸出物5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，121℃湿热灭菌20 min。
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