CN104161116B - 诱导果实抗性控制病害的制剂及相应的诱导法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂：质量浓度为0.5～10％的罗伦隐球酵母干粉悬液。罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii ZJU10。本发明还同时提供了利用上述制剂诱导果实抗性控制病害的方法：果实在质量浓度为0.5～10％的罗伦隐球酵母干粉悬液中浸泡后，于温度25℃/4℃、湿度90％条件下，诱导处理24小时。

Description

诱导果实抗性控制病害的制剂及相应的诱导法

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过罗伦隐球酵母干粉诱导果实抗性的生物保鲜技术。

背景技术

水果在采后由于腐烂而导致的损失非常巨大，据资料显示，我国每年果蔬腐烂超过8000万吨，损失率高达30％，造成的经济损失达千亿元。病原真菌侵染是造成梨果实采后腐烂的主要原因，如Penicilliumexpansum侵染造成的青霉病，不仅导致水果在数量上的严重损失，而且P.expansum分泌的棒曲霉素会引起严重的食品安全问题。

目前，化学杀菌剂仍然是控制水果采后病害的主要措施。中国发明专利(申请号200910028802.2，柑橘保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括甲基托布津，多菌灵。中国发明专利(申请号200910028804.1，柑橘长效保鲜剂)提供了可控制柑橘病害的化学杀菌剂，包括2,4-D钠盐，托布津。中国发明专利(申请号201110209305.X，《一种柑橘保鲜剂及其制备方法、应用》)提供了可控制柑橘病害的多种化学杀菌剂，包括醚菌酯、唑菌胺脂、肟菌酯、烯肟菌酯等。然而，化学杀菌剂具有一定的毒副作用，其残留问题日益严重，容易对人体健康及环境安全产生严重的危害；同时会导致病原微生物耐药性的产生，从而影响病害防治效果。因此，寻找新型的、安全有效的病害控制方法来代替杀菌剂日益成为人们关注的焦点。

植物在长期进化过程中形成了多种保护机制对抗微生物的侵染，其中包括诱导抗性，经外源因子诱导后可以表现出来，从而对多种病原微生物形成抗病性。大量研究表明许多生物、物理和化学激发子都能诱导果实采后抗性，如热处理、紫外线、钙处理、植物天然抑菌物质、生物防腐剂等。其中，酵母激发子具有无毒、生物可降解和性价比高等优良特点。中国发明授权专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》，公开号CN101412972A，公开了一种用海洋酵母菌株RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国发明专利(申请号200910095643.8，一种防治果蔬病害的生物保鲜剂及其制备方法)，提供了一种基于红冬孢酵母和羧甲基纤维素钠等物质防治果蔬病害的生物保鲜方法。中国发明专利(申请号201010240638.4，提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法)提供了一种用壳聚糖提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法。

罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株。中国发明授权专利《罗伦隐球酵母专用培养基及其用途》，公开号CN102199552A，公开了一种罗伦隐球酵母专用的培养基配方；中国发明授权专利《酵母拮抗菌C.laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法》，公开号CN1733898，公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明授权专利《基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂》，公开号CN102224843A，公开了一种基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂；中国发明授权专利《柑橘果实生物防腐保鲜方法》，公开号CN102652517A，公开了一种利用茉莉酸甲酯熏蒸和罗伦隐球酵母菌悬液浸泡的柑橘果实生物防腐保鲜方法；中国发明专利(申请号201210190959.7，提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法)提供了一种利用海藻糖提高罗伦隐球酵母控制苹果采后青霉病及展青霉素效力的方法；中国发明专利(申请号200810128441.4，一种生物活性果蔬保鲜膜)提供了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种不使用化学杀菌剂的条件下，采用生物激发子抑制果实采后病害的保鲜技术及所用的制剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于诱导果实抗性控制病害的制剂：

质量浓度(质量分数)为0.5～10％的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液。

作为本发明的用于诱导果实抗性控制病害的制剂的改进：

罗伦隐球酵母干粉的制备方法为：

将活化后的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)接到NYDB培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤，以除去培养基(培养介质)，从而获得酵母细胞；用无菌水调整至浓度为1×10⁹cells/mL的细胞悬浮液，在-80℃预冻6h，然后进行真空冷冻干燥；得罗伦隐球酵母干粉。

作为本发明的用于诱导果实抗性控制病害的制剂的进一步改进：干燥温度-45℃，真空度0.54mPa，干燥时间24h。

作为本发明的用于诱导果实抗性控制病害的制剂的进一步改进：罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCCNO.3590的罗伦隐球酵母CryptococcuslaurentiiZJU10。

本发明还同时提供了一种利用上述制剂诱导果实抗性控制病害的方法：果实在质量浓度(质量分数)为0.5～10％的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液中浸泡(一般浸泡10～20min)后，于温度25℃、湿度(相对湿度)90％条件下，诱导处理24小时。

作为本发明的诱导果实抗性控制病害的方法的改进：罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液的质量浓度为0.5％、1％。

本发明还同时提供了另一种利用上述制剂诱导果实抗性控制病害的方法：果实在质量浓度(质量分数)为0.5～10％的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液中浸泡(一般浸泡10～20min)后，于温度4℃、湿度(相对湿度)90％条件下，诱导处理24小时。

作为本发明的诱导果实抗性控制病害的方法的改进：罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液的质量浓度为1％。

在本发明中，病害例如为扩展青霉(Penicilliumexpansum)。

本发明属于通过罗伦隐球酵母干粉诱导果实抗性的生物保鲜技术。

备注说明：

罗伦隐球酵母干粉为采用真空冷冻干燥方法制备而得，具体如下：

罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)在低温(4℃)下保存在NYDA培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，活化时取出在28℃下于NYDA培养基中培养48小时，重复传代培养2次后，用接种环将活化好的酵母接到NYDB培养基(牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，用水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min)中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤2次，以除去培养介质，获得酵母细胞，用无菌水调整至浓度为1×10⁹cells/mL的细胞悬浮液，在-80℃预冻6h，然后将培养皿放在真空冻干机(美国Savant公司)中进行干燥；得罗伦隐球酵母干粉。

所述的真空冷冻干燥条件可采用一般的微生物制品真空冷冻干燥条件，如干燥温度-45℃，真空度0.54mPa，干燥时间24h。

将上述罗伦隐球酵母干粉与一定的水混合后，即得所需浓度的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液。

例如：质量浓度(质量分数)为0.5％的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液为：将罗伦隐球酵母干粉与水按照1:199的重量比混合后而得。

本发明的优点是：(1)本发明中的罗伦隐球酵母干粉资源丰富、成本低廉、性价比高，具有生物可降解性；(2)诱导抗性是植物受病虫害侵染后产生的一种自然反应，可以对病虫害产生持久和系统的广谱抗性；(3)能显著降低果实的采后病害，对环境和人体健康无任何毒害作用，具有经济实用、安全高效、环境友好等特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为常温下罗伦隐球酵母干粉不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响对比图；

其中图(a)为伤口处理发病率，图(b)为伤口处理病斑直径。

图2为冷藏条件下罗伦隐球酵母干粉不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响对比图；

其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

图3常温下酵母干粉整果处理对梨果实青霉病抗性的影响对比图；

其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

图4冷藏条件下酵母干粉整果处理对梨果实青霉病抗性的影响对比图；

其中图(a)为发病率，图(b)为病斑直径。

具体实施方式

实验1酵母干粉不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉(Penicilliumexpansum)，25℃活化7天备用。

2、处理：

(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(质量％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

(2)用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小(5mm)和尽可能相同的深度(2mm)的伤口5个。每个伤口处分别加入等量(50μL)的质量浓度分别为0.5％、1％、5％、10％的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)干粉悬液，在25℃恒温、恒湿条件(相对湿度为90％)下诱导24小时，以加入等量的无菌水作为对照。

(3)在伤口处接入1×10⁴spores/ml扩展青霉Penicilliumexpansum菌悬液30μL，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时后观察并记录结果，对不同浓度酵母干粉的效力进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

酵母干粉不同诱导浓度对梨果实青霉病抗性的影响如图1所示。

3、结果：

如图1所示，各浓度处理组与对照组相比，梨果实青霉病的发病情况均明显减弱，其中以浓度为1％和5％的处理组效果最为明显。在接入病原菌后第3天，5％的酵母干粉可以完全抑制梨果实青霉病害的发生。之后对照组发病速度较快，到接入病原菌后第5天，发病率已达到94.4％，而此时1％和5％酵母干粉处理组的发病率仅为44.4％和47.8％，分别比对照组降低了50％和46.6％，在病斑直径上也都比对照组减少了10mm左右，有效地减缓了青霉病的发生和发展。

因此，本发明1～5％的酵母干粉是诱导梨果实抗性的最适处理浓度。

实验2冷藏条件下酵母干粉对梨果实青霉病抗性的影响

将实验1中的诱导温度由25℃改成4℃，检测时间由“接入病原菌后第3天”改成“接入病原菌后第20天”；其余等同于实验1。

结果：

如图2所示，在接种扩展青霉Penicilliumexpansum后第20天，各浓度的酵母干粉都对梨果实青霉病的发病情况有显著的抑制作用。相比与对照组66.7％的发病率，0.5％、1％、5％和10％酵母干粉处理组的发病率分别下降了22.3％、27.8％、38.9％和38.9％，抑制效果明显。在病斑直径上也有类似的结果，其中5％酵母干粉处理组病斑直径为1.94mm，比对照组的5.33mm减少了3.39mm，有效地控制了青霉病害。

实验3酵母干粉整果处理对梨果实青霉病抗性的影响

1、实验材料：

果实为梨，品种为水晶梨。

病原菌：扩展青霉(Penicilliumexpansum)，25℃活化7天备用。

2、处理：

(1)水果预处理：选取外观整齐、无病虫害、无机械损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(质量％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出，再用自来水冲洗干净，洗去残余次氯酸钠，晾干备用。

(2)将梨果实置于0.5％、1％、5％、10％的酵母干粉悬液中浸泡10分钟，取出自然晾干，以无菌水作为对照，在25℃恒温、恒湿(90％的相对湿度)条件下诱导24小时，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口。

(3)在伤口处接入1×10⁴spores/mL扩展青霉Penicilliumexpansum菌悬液30μL，处理完毕后在常温下(25℃)贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理，定时观察并记录结果，对不同浓度酵母干粉的效力进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果为一组重复，3个重复，实验重复两次，以相同结果为准。

3、结果：

如图3所示，在接种扩展青霉Penicilliumexpansum后第3天，0.5％、1％、5％和10％的酵母干粉悬液整果处理后，都能不同程度地降低梨果实青霉病的发病率，其中5％和10％的抑制效果较小，而0.5％和1％的抑制效果较大，相比对照发病率分别下降了16.7％和22.2％，结果具有显著性。在病斑直径上则是各浓度都有显著的抑制效果。

实验4冷藏条件下酵母干粉整果处理对梨果实青霉病抗性的影响

将实验3中的诱导温度由25℃改成4℃，检测时间由“接种扩展青霉后第3天”改成“接种扩展青霉后第9天”；其余同实验3。

结果：

如图4所示，在接种扩展青霉Penicilliumexpansum后第9天，0.5％的酵母干粉悬液整果处理不能降低青霉病的发生率，而1％、5％和10％的酵母干粉可以有效地降低发病率，其发病率相比对照分别下降了38.8％、22.2％和22.2％，结果具有显著性；在病斑直径上也有类似的结果，其中1％酵母干粉的效果最为明显。

对比实验1、取消实验3的步骤2(2)中的“诱导处理24小时”；自然晾干后直接在果实上打孔并加入扩展青霉Penicilliumexpansum菌悬液。即，将步骤2(2)改成“将梨果实置于0.5％、1％、5％、10％的酵母干粉悬液中浸泡10分钟，取出自然晾干，以无菌水作为对照，用消过毒的打孔器在每个果实的表面形成统一大小的伤口”。

其余同实验3。

结果：

如表1所示，整果浸泡后直接接入扩展青霉Penicilliumexpansum，同样在接种后第3天，在发病率上，各浓度的酵母干粉悬液对梨果实青霉病没有抑制作用；在病斑直径上，也只有5％和10％这两种浓度有较小的抑制作用。总体上来说，其抑制效果远不如实验3。

表1常温下酵母干粉整果处理对梨果实青霉病的影响

处理号	处理	发病率(％)	病斑直径(mm)
				1	对照：无菌水	100±0.0	11.2±0.5
2	0.5％酵母干粉悬液	100±0.0	11.4±0.1
				3	1％酵母干粉悬液	100±0.0	10.3±0.5
4	5％酵母干粉悬液	100±0.0	9.2±0.3
				5	10％酵母干粉悬液	100±0.0	9.6±0.3

对比实验2、取消实验4中的“诱导处理24小时”；即，自然晾干后直接在果实上打孔并加入扩展青霉Penicilliumexpansum菌悬液。其余同实验4。

结果：

如表2所示，整果浸泡后直接接入扩展青霉Penicilliumexpansum，同样在接种后第9天，在发病率上，只有5％和10％的酵母干粉悬液对梨果实青霉病有微弱的抑制作用，但结果无显著差异；在病斑直径上，各处理组结果和对照组之间都没有显著差异。总体上来说，其抑制效果远不如实验4。

表2低温下酵母干粉整果处理对梨果实青霉病的影响

处理号	处理	发病率(％)	病斑直径(mm)
				1	对照：无菌水	100±0.0	9.3±1.6
2	0.5％酵母干粉悬液	100±0.0	9.2±0.7
				3	1％酵母干粉悬液	100±0.0	10.5±0.8
4	5％酵母干粉悬液	94.4±5.6	7.5±0.8
				5	10％酵母干粉悬液	94.4±5.6	6.9±0.8

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：果实在质量浓度为0.5～10％的罗伦隐球酵母干粉悬液中浸泡后，于温度25℃、湿度90％条件下，诱导处理24小时；

所述罗伦隐球酵母干粉的制备方法为：

将活化后的罗伦隐球酵母接到NYDB培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤，以除去培养基，从而获得酵母细胞；用无菌水调整至浓度为1×10⁹cells/mL的细胞悬浮液，在-80℃预冻6h，然后进行真空冷冻干燥，干燥温度-45℃，真空度0.54mPa，干燥时间24h，得罗伦隐球酵母干粉；

罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCCNO.3590的罗伦隐球酵母CryptococcuslaurentiiZJU10。

2.根据权利要求1所述的诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：罗伦隐球酵母干粉悬液的质量浓度为0.5％、1％。

3.制剂诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：果实在质量浓度为0.5～10％的罗伦隐球酵母干粉悬液中浸泡后，于温度4℃、湿度90％条件下，诱导处理24小时；

所述罗伦隐球酵母干粉的制备方法为：

将活化后的罗伦隐球酵母接到NYDB培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时，收集培养液，在4000rpm、4℃条件下离心15min，用无菌蒸馏水洗涤，以除去培养基，从而获得酵母细胞；用无菌水调整至浓度为1×10⁹cells/mL的细胞悬浮液，在-80℃预冻6h，然后进行真空冷冻干燥，干燥温度-45℃，真空度0.54mPa，干燥时间24h，得罗伦隐球酵母干粉；

罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCCNO.3590的罗伦隐球酵母CryptococcuslaurentiiZJU10。

4.根据权利要求3所述的诱导果实抗性控制病害的方法，其特征是：罗伦隐球酵母干粉悬液的质量浓度为1％。