CN102224843A

CN102224843A - 基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂

Info

Publication number: CN102224843A
Application number: CN 201110114068
Authority: CN
Inventors: 余挺; 郑晓冬; 努尔哈音; 朱瑞瑜; 蓝天演; 钱成济
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2031-05-04
Also published as: CN102224843B

Abstract

本发明公开了一种基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂，该柑橘生物保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液、碳酸氢钠、生长素、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰~1×10¹²个罗伦隐球酵母细胞、1×10¹⁰~1×10¹²个粘红酵母细胞、1×10¹⁰~1×10¹²个红冬孢酵母细胞、5~50克碳酸氢钠、10~400mg生长素和1~100mg水杨酸，其余为水；罗伦隐球酵母保藏号为CGMCC NO.3590，红冬孢酵母保藏号为IMI394084，粘红酵母保藏号为CGMCC NO.3589。本发明的柑橘生物保鲜剂，能在不使用化学杀菌剂的前提下有效控制柑橘采后病害。

Description

基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂

技术领域

本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种用于防治柑橘果实病害的生物防腐保鲜技术。

背景技术

化学杀菌剂是目前控制柑橘果实采后腐烂的主要和最有效方法。但鉴于化学杀菌剂对食品安全和环境污染的不利影响，国内外对开发非杀菌剂型的保鲜技术都非常重视。特别是利用安全且有拮抗病原菌活性的酵母防治果实病害的技术被认为是最有希望的替代化学杀菌剂的方法之一。但现有生防酵母的对病害的控制效力与化学杀菌剂相比仍有较大差距。

罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株。中国发明授权专利《一种酵母拮抗菌的培养方法及其专用培养基》，专利号ZL200510090063.1，公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方；中国发明授权专利《酵母拮抗菌C.laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法》，专利号ZL200510090065.0，公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利《一种生物拮抗菌及其应用》，申请号200310115336.4，公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明申请专利《一种生物活性果蔬保鲜膜》，申请号200810128441.4，公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请专利《葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂》，申请号200910078858.9，公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法；中国发明申请专利《一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法》，申请号200910079774.7，公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。

粘红酵母(Rhodotorula glutinis)也是国内外研究较多的采后生防酵母菌株。中国发明申请专利《一种用于防治柑橘采后病害的酵母生物制剂制备方法》，申请号200410015947.6，公开了一种用于防治柑橘采后病害的酵母生物制剂制备方法。中国发明申请专利《一种活性粘红酵母粉的制备方法》，申请号201010242120.4，公开了一种活性粘红酵母粉发酵剂冻干菌粉末的制备方法。中国发明申请专利《一种用于防治水果采后病害的方法》，申请号200910233684.9，公开了一种用罗伦隐球酵母或粘红酵母与微波结合防治水果采后病害的方法。中国发明申请专利《提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法》，申请号201010240638.4，公开了一种用壳聚糖提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法。

酵母菌株Rhodosporidium p aludigenum Fell & Tallman是一株从海洋中分离得到的新型果实病害生防酵母。中国发明授权专利《一株水果蔬菜的生物保鲜剂及其制备方法》，专利号200610155209.0，公开了一种基于红冬孢酵母和尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠制备水果蔬菜的生物杀菌剂的方法。中国发明授权专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》，专利号ZL 200610155062.5，公开了一种用海洋酵母菌株Rhodosporidium p aludigenum Fell & Tallman抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国发明授权专利《一种海洋酵母的用途和相应微生物燃料电池及制备方法》。授权公告号CN101552340B，公开了一种利用红冬孢酵母制备微生物燃料电池的方法。中国发明申请专利《一种防治果蔬病害的生物保鲜剂及其制备方法》，申请号200910095643.8，公开了一种基于红冬孢酵母和羧甲基纤维素钠等物质防治果蔬病害的生物保鲜方法。中国发明申请专利《海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman的专用甘蔗糖蜜培养基》，申请号2010101485270，公开了一种海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman液体培养的方法。中国发明申请专利《海洋酵母Rhodosporidum paludigenum Fell&Tallman的真空冷冻干燥制》，申请号2010101400817，公开了一种红冬孢酵母活性干粉制备的方法。中国发明申请专利《一种诱导提高海洋红冬孢酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号201010551754.8，公开了一种利用几丁质物质诱导提高红冬孢酵母生防效力的方法。

诱导抗性是当前国内外关注的新型采后病害控制方法之一。研究表明，植物包括采后果蔬，经过预先接种或采用一些物理的、化学的因子处理后，可诱导产生抗病性，从而减少病害发生。能引起植物产生抗病性的因素根据其来源分为生物型和非生物型激发子。其中水杨酸是研究最为广泛的激发子之一，而细胞分裂素、生长素、赤霉素等植物激素对果实抗性影响的研究尚少。碳酸氢钠即小苏打，是公认安全物质，已广泛应用于日常水果一般性保鲜处理等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在不使用化学杀菌剂前提下能有效控制柑橘果实采后病害的生物防腐保鲜剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂，该柑橘生物保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液、碳酸氢钠、生长素、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰～1×10¹²个罗伦隐球酵母细胞、1×10¹⁰～1×10¹²个粘红酵母细胞、1×10¹⁰～1×10¹²个红冬孢酵母细胞、5～50克碳酸氢钠、10～400mg生长素(IBA)和1～100mg水杨酸(SA)，其余为水；

罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii ZJU 10；

红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman；

粘红酵母参椐的生物材料为ZJU 11，分类命名为粘红酵母Rhodotorula glutinis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3589。

作为本发明的基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂的改进：每1L保鲜剂中含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、1×10¹¹个粘红酵母细胞、1×10¹¹个红冬孢酵母细胞、5～50克碳酸氢钠、10～400mg生长素(IBA)和1～100mg水杨酸(SA)，其余为水。

本发明所选用的罗伦隐球酵母的保藏名称为：罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3590。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该罗伦隐球酵母在申请号为201010152108.4的专利中有明确告知。

本发明所选用的海洋酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman)被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(International Mycological Institute，CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址：英国TW20 9TY萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期：2006.4.19，保藏编号：IMI 394084。该菌株已经在申请号为200610155209.0的专利中被公开。

在本发明中，水杨酸为邻羟基苯甲酸，生长素为吲哚丁酸。

本发明的生物防腐保鲜剂只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，因此所用的酵母悬浮液是指经过菌种活化、并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液，其有效浓度为1×10⁷细胞/毫升～1×10⁹细胞/毫升。

酵母、碳酸氢钠和果实抗性激发子的复合处理是指将碳酸氢钠、果实抗性激发子成分直接添加到酵母菌菌悬液中而制成的生物防腐保鲜剂。碳酸氢钠的有效浓度为：每1L保鲜剂中含有5～50g的碳酸氢钠。果实抗性激发子是指水杨酸(SA)、生长素(IBA)，其有效浓度分别为，每1L保鲜剂中含有1～100mg的SA、10～400mg IBA。

本发明所设定的果实抗性激发子的有效浓度是指其使用量确保不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，并能发挥果实抗性激发子特定生理功能的浓度。

本发明的柑橘生物保鲜剂有效整合了3种生防酵母的活性、碳酸氢钠对病原菌的抑制活性、吲哚丁酸和水杨酸对果实抗性激发的活性，从而能显著抑制柑橘果实病害的发生和发展；由于能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母的使用量，从而显著降低成本。

本发明的柑橘生物保鲜剂具有安全高效、环境友好、病害防治效果突出等优点。使用本发明的生物防腐保鲜剂，能转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。

实际使用时，可任选以下任意一种处理方式对果实进行处理：

处理方式一：选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用自来水冲洗、并在室温(25℃左右)下放干。将果实在本发明的柑橘生物保鲜剂中浸泡3分钟后，取出放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温(25℃左右)下保持20～24小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

处理方式二：采前采用喷壶喷洒的处理方法，将本发明的柑橘生物保鲜剂喷在果实表面(湿润即可)，待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温(25℃左右)下保持20～24小时，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

具体实施方式

以下实施例中的果实为正常商业成熟度的柑橘(Citrus unshiu Marc.)果实，试验品种为早桔。选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用质量浓度为0.1％次氯酸钠溶液浸泡消毒1-2分钟后，用自来水冲洗，在室温下(20-25℃)放干后备用。

拮抗酵母为罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii ZJU 10)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis ZJU 11)，红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman)；病原菌为病原菌为指状青霉(Penecillium digitatum)。SA，分析纯AR，上海化学试剂采购供应五联化工厂；IBA，化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司；碳酸氢钠，分析纯试剂。

3种酵母悬浮液的制备方法分别如下：

以下所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，高压(1kg/cm2)121℃灭菌30分钟。

所用的NYDB种子培养基为：牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压(1kg/cm2)121℃灭菌30分钟。

罗伦隐球酵母、粘红酵母，红冬孢酵母分别在低温(4℃)下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为：

①、活化：先在NYDA培养基中28℃培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中28℃培养48小时)；将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中，28℃下培养24小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，28℃下培养24小时)；

②、液体培养：用步骤①活化所得的酵母按照5％(重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpm、28℃条件下培养24小时；

③、离心分离：将步骤②液体培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；

④、悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。

实施例1、基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂：

先分别单独活化、培养罗伦隐球酵母、粘红酵母，红冬孢酵母；将3种酵母的浓度分别调整到2×10⁹个细胞/ml，取0.5升体积的罗伦隐球酵母悬浮液，加入0.5升体积的粘红酵母悬浮液，搅拌混匀3分钟；然后加入0.5升体积的红冬孢酵母悬浮液，完毕后继续搅拌混匀3分钟，缓慢加入浓度为1000mg/L的SA溶液1000毫升，SA溶液加入完毕后搅拌混匀5分钟；然后缓慢加入浓度为1000mg/L的IBA溶液100毫升，搅拌混匀5分钟；缓慢加入浓度为80g/L的碳酸氢钠溶液2500毫升，溶液加入完毕后搅拌混匀5分钟加水稀释到10升备用。该最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

实施例2、调整实施例1中SA溶液、碳酸氢钠溶液和IBA溶液的用量；从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，50mg/L SA，200mg/L IBA，25g/L碳酸氢钠，其余为水。

实施例3、调整实施例1中SA溶液、碳酸氢钠溶液和IBA溶液的用量；从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，10mg/L SA，400mg/L IBA，50g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例1、取消实施例1中SA溶液、碳酸氢钠溶液和IBA溶液的使用，从而使最终所得的每L生物防腐保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞。

对比例2、取消实施例1中碳酸氢钠溶液的使用，该最终所得的每L生物防腐保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，其余为水。

对比例3、取消实施例1中SA的使用，从而使最终所得的每L生物防腐保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，10mg/LIBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例4、取消实施例1中IBA的使用，从而使最终所得的每L生物防腐保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母，1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/LSA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例5、取消罗伦隐球酵母的使用，调整粘红酵母的用量，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有2×10¹¹个粘红酵母、1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例6、取消罗伦隐球酵母的使用，调整红冬孢酵母的使用，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个粘红酵母、2×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例7、取消粘红酵母的使用，调整罗伦隐球酵母的用量，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有2×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/LSA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例8、取消粘红酵母的使用，调整红冬孢酵母的用量，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、2×10¹¹个红冬孢酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例9、取消红冬孢酵母的使用，调整罗伦隐球酵母的用量，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有2×10¹¹个罗伦隐球酵母、1×10¹¹个粘红酵母细胞，100mg/LSA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

对比例10、取消红冬孢酵母的使用，调整粘红酵母的用量，从而使最终所得的每L柑橘生物保鲜剂中分别含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母、2×10¹¹个粘红酵母细胞，100mg/L SA，10mg/L IBA，20g/L碳酸氢钠，其余为水。

为了证明本发明的生物防腐保鲜效果，发明人进行了如下实验：

实验、柑橘果实生物防腐保鲜剂的效果实验

用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。将上述不同的组合试剂50μl分别添加到不同的果实伤口处。病原菌接种在以上处理2小时后在每个伤口加入等量(30μl)的病原菌孢子悬浮液(Penecillium digitatum浓度为10⁴ spores/ml)。处理完毕后在常温(23～24℃)下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复12个果实，每处理重复3次。

表1.试验结果

从表1的结果可以看出，实施例～实施例3对柑橘果实病害能产生强烈的抑制，其效力已达到甚至超过杀菌剂对照的控制效果。从对比例1～10可以看出，当取消碳酸氢钠、SA、IBA或其中任何一种生防酵母的配方后，其对果实病害的控制效力均导致降低。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂，其特征是：所述柑橘生物保鲜剂由罗伦隐球酵母悬浮液、粘红酵母悬浮液、红冬孢酵母悬浮液、碳酸氢钠、生长素、水杨酸和水组成，每1L保鲜剂中含有1×10¹⁰～1×10¹²个罗伦隐球酵母细胞、1×10¹⁰～1×10¹²个粘红酵母细胞、1×10¹⁰～1×10¹²个红冬孢酵母细胞、5～50克碳酸氢钠、10～400mg生长素和1～100mg水杨酸，其余为水；

所述罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO.3590的罗伦隐球酵母Cryptococcus laurentii ZJU 10；

所述红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell& Tallman；

所述粘红酵母参椐的生物材料为ZJU 11，分类命名为粘红酵母Rhodotorula glutinis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号：CGMCC NO.3589。

2.根据权利要求1所述的基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂，其特征是：每1L保鲜剂中含有1×10¹¹个罗伦隐球酵母细胞、1×10¹¹个粘红酵母细胞、1×10¹¹个红冬孢酵母细胞、5～50克碳酸氢钠、10～400mg生长素和1～100mg水杨酸，其余为水。