CN103766474B - 樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂，每L生物防腐保鲜剂由1×10¹⁰～1×10¹²个粘红酵母细胞、400～600mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；所述粘红酵母为粘红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJU11，保藏号为CGMCC NO.3589；所述鼠李糖脂是糖脂含量为70%～90%的浓缩鼠李糖脂。使用上述樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂，不但能延缓樱桃番茄果实的腐败，还能保证樱桃番茄果实的品质。

Description

樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂及其用途

技术领域

本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，具体的是一种樱桃番茄果实生物防腐保鲜技术。

背景技术

樱桃番茄形态优美，味道可口，含有丰富的营养物质，是深受大众欢迎的水果型蔬菜，在中国大部分省区均有栽培。因樱桃番茄水分含量高、鲜嫩皮薄、极易损伤，贮藏期间易受病原菌侵染导致采后腐烂，在贮藏和运输过程中损失现象极其严重，影响其市场供应，也严重损害农民的经济收益。目前控制樱桃番茄采后腐烂最有效的措施是低温贮藏并结合使用化学杀菌剂，但是低温贮藏需要较大的投资而且容易造成冷害，另一方面频繁使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性，并且化学药剂残留超标会危害人类健康。因此，目前许多研究都在致力于寻求安全、无毒和高效的病害防治技术。

生物防治技术是近年来新发展的一种采后保鲜技术，因其无毒、无害、无环境污染而深受人们的重视。近几年的研究中，许多生物拮抗菌在采后病害防治方面显示出其有效性和使用方便的优势，其中以假丝酵母属(candida)、隐球酵母属(cryptococcus)、毕赤酵母属(pichia)、红酵母属(rhodotorula)、梅奇氏酵母属(metschnikowia)为主。但是在商业条件下，单独使用拮抗菌进行抑菌，抑菌效果不够理想及缺乏一致性会限制其使用。其主要原因是拮抗菌的生长和在果蔬表面的繁殖等都受到诸如温度、湿度、雨水、风力等环境条件的影响，使其生防效果不够稳定，譬如生防菌在较低或较高的温度下的生防效力会大大下降，应用于实际生产中风险较大。此外，相对于化学杀菌剂，拮抗菌的生产成本比较高，这些因素都影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的应用。

粘红酵母（Rhodotorula glutinis）已被证明能有效控制水果采后病害。中国发明申请专利《一种用于防治柑橘采后病害的酵母生物制剂制备方法》，申请号：200410015947.6，公开了一种用于防治柑橘采后病害的酵母生物制剂制备方法。中国发明申请专利《提高粘红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法》，申请号：201010240638.4，公开了一种利用壳聚糖等物质提高粘红酵母对果实病害防治效力的方法。中国发明申请专利《柑橘生物防腐保鲜剂》，专利号：ZL201110113838.8，公开了一种由罗伦隐球酵母、粘红酵母、红冬孢酵母、水杨酸、生长素、氯化钙组成的保鲜剂对柑橘进行生物防治。中国发明申请专利《基于酵母、碳酸氢钠和激发子活性的柑橘生物保鲜剂》，专利号：ZL201110114068.9，公开了一种由罗伦隐球酵母、粘红酵母、红冬孢酵母、碳酸氢钠、生长素和水杨酸组成的柑橘生物保鲜剂。另外，该酵母对苹果、柑橘、草莓等果实灰霉、青霉采后病害的控制已有报道（孙萍等，2003；王雷等，2008）。

上述专利中涉及的粘红酵母（Rhodotorula glutinis）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年1月20日，保藏号为CGMCC NO.3589。

鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌产生的阴离子生物表面活性剂，它兼具良好的化学和生物特性，无毒、可生物降解并且安全可靠，在石油开采、环境污染治理、化妆品、医药等领域都有着一定的应用。Kim等（2000）发现从铜绿假单胞菌B5分离出的鼠李糖脂，对于疫霉属枯萎病和炭疽病有抵抗作用，辣椒和黄瓜在喷洒过含有鼠李糖脂的溶液后，可以很好的抵御病原菌的侵染。Lotfabad等（2013）人发现从两株本土的Pseudomonas aeruginosa MRo1和MASH1中分离出的鼠李糖脂不仅表现出良好的表面活性，对于革兰氏阳性菌具有很好的抑制效果。Sotirova等(2012)发现鼠李糖脂与硫代磺酸酯（MTS）的结合使用有协同增效作用，可以降低硫代磺酸酯的杀菌浓度却得到一样的杀菌效果。Varnier等（2009）首次发现鼠李糖脂不仅具有直接抑菌功能，还可以作为一种MAMPs，诱导果实产生抗性，使其在采前对病原菌侵染的抵抗力大大增强。

Sha等（2012）人将鼠李糖脂的发酵产物与分离纯化后的高纯度鼠李糖脂进行比较，发现粗产物与纯化物的抑菌效果相当，因此不需要增加繁琐的操作去提高纯度，成本得到降低，这使得鼠李糖脂的商业化应用成为了可能。

专利号为201010136140.3的发明《一种鼠李糖脂的制备方法及其应用》提供了利用保藏号为CCTCC No:M209237的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211制备鼠李糖脂的方法。

参考文献具体如下：

1、Kim,B.S.,Lee,J.Y.,&Hwang,B.K.In vivo control and in vitro antifungal activity ofrhamnolipid B,a glycolipid antibiotic,against Phytophthora capsici and Colletotrichum orbiculare.Pest Management Science,2000,56(12),1029-1035.（Kim,B.S.,Lee,J.Y.,Hwang,B.K.糖脂类抗生素——鼠李糖脂B，对疫霉菌和炭疽菌体内和体外的抑制活性，虫治理科学，2000,56(12),1029-1035）；

2、孙萍，郑晓冬，张红印，吴忠民，唐平，蒋伟.粘红酵母与金属离子结合使用对柑橘采后青霉病的抑制效果，果树学报，2003，20(2)；

3、王雷，张华，张红印，姜松，冯志彬.粘红酵母对水果采后病害生物防治的研究进展，食品保鲜，2008，29（8）；

4、Varnier,A.L.,Sanchez,L.,et al..Bacterial rhamnolipids are novel MAMPs conferringresistance to Botrytis cinerea in grapevine.Plant,Cell and Environment,2009,32,178-193.（Varnier,A.L.,Sanchez,L.等，细菌产生的鼠李糖脂是一种新型的可以抵抗灰葡萄孢菌的微生物相关分子模式，植物，细胞和环境，2009,32,178-193）；

5、Sha,R.,et al.Producing cell-free culture broth of rhamnolipids as a cost-effective fungicideagainst plant pathogens.Journal of Basic Microbiology,2012,52(4),458-466.（Sha,R.等，从无细胞培养液中制取的鼠李糖脂是一种经济的对抗植物病原菌的杀真菌剂，基础微生物学杂志，2012,52(4),458-466）；

6、Sotirova,A.,Avramova,T.,Stoitosca,S.,Lazarkevich,I.,Lubenets,V.,Karpenko,E.,&Galabova,D.The Importance of Rhamnolipid-Biosurfactant-Induced Changes in BacterialMembrane Lipids of Bacillus subtilis for the Antimicrobial Activity of Thiosulfonates.CurrentMicrobiology,2012,65,534-541.（Sotirova,A.,Avramova,T.,Stoitosca,S.,Lazarkevich,I.,Lubenets,V.,Karpenko,E.,&Galabova,D.鼠李糖脂通过改变枯草芽孢杆菌细胞膜成分对硫代亚磺酸酯抑菌活性的重要性，现代微生物学，2012,65,534-541）；

7、Lotfabad,T.B.,Shahcheraghi,F.,&Shooraj,F.Assessment of antibacterial capability ofrhamnolipids produced by two indigenous Pseudomonas aeruginosa strains.Jundishapur Journal ofMicrobiology,2013,6,29-35.（Lotfabad,T.B.,Shahcheraghi,F.,Shooraj,F.对两种本土的铜绿假单胞杆菌产生的鼠李糖脂抑菌能力的评估，微生物杂志，2013，6，29-35）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于拮抗酵母和微生物表面活性剂结合施用的樱桃番茄果实生物防腐保鲜方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂，每L生物防腐保鲜剂由1×10¹⁰～1×10¹²个粘红酵母细胞、400～600mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

所述粘红酵母为粘红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJU11，保藏号为CGMCC NO.3589；

所述鼠李糖脂是糖脂含量为70%～90%的浓缩鼠李糖脂。

即，鼠李糖脂为保藏号为CCTCC No:M209237的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaZJU-211菌种发酵并经分离纯化后所得的含糖脂70%～90%的浓缩鼠李糖脂。该浓缩鼠李糖脂按照专利号为201010136140.3的发明《一种鼠李糖脂的制备方法及其应用》制备而得。

即，本发明的每1L樱桃番茄生物防腐保鲜剂中的有效成分由以下含量的组分组成：

粘红酵母1×10¹⁰～1×10¹²个，

鼠李糖脂200～500mg。

作为本发明的樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂的进一步改进：每1L生物防腐保鲜剂中含有1×10¹¹个粘红酵母细胞、500mg鼠李糖脂，其余为水。所述鼠李糖脂例如为含糖脂78%的浓缩鼠李糖脂。

本发明还同时提供了上述樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂的用途：延缓樱桃番茄果实的腐败，且保证樱桃番茄果实的品质。

品质包括硬度、糖度、抗坏血酸。

本发明的生物保鲜剂只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，因此所用的粘红酵母悬浮液是指经过菌种活化、并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬浮液，其有效浓度为1×10⁷～1×10¹⁰细胞/毫升。

粘红酵母和鼠李糖脂的复合处理是指将鼠李糖脂用水稀释至一定的浓度后直接添加到酵母菌菌悬液中，最后用水定容从而制成的生物保鲜剂。

粘红酵母悬浮液的配制过程如下：

以下所用的NYDA培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水定容至1000ml，高压（0.1MPa，121℃，30分钟）灭菌。

所用NYDB液体培养基为：牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压（0.1MPa，121℃，30分钟）灭菌。

粘红酵母CGMCC NO.3589在低温（4℃）下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为：①、活化：粘红酵母CGMCC NO.3589先在NYDA培养基中28℃培养48h，然后重复传代培养2次（每次均为在NYDA培养基中28℃培养48h）；

②、液体培养：将上述重复传代2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB液体培养基中，于200rpm、28℃培养24h，然后在相同条件下重复培养1次（即将NYDB液体培养基中培养所得的酵母用无菌移液器接种到NYDB液体培养基中于200rpm、28℃培养24h）；

③、离心分离：将步骤②所得的培养所得物于3000rpm条件下离心分离10min，用无菌蒸馏水洗2次，去除培养基质；

④、酵母细胞悬浮和确定浓度：用无菌蒸馏水悬浮粘红酵母细胞，用血球计数板确定酵母细胞的浓度，并用无菌蒸馏水调整到所需的浓度。

一般而言，可最终每1L粘红酵母悬浮液中含有1×10¹⁰～1×10¹³个粘红酵母细胞。

本发明的特点之一为：本发明所设定的鼠李糖脂的有效浓度能确保其使用量不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，但对病原菌起抑制作用并能激发果实抗性。

本发明的生物保鲜剂能显著抑制樱桃番茄果实病害的发生和发展；由于能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母的使用量，从而显著降低成本。

本发明所用的鼠李糖脂具有成本低、可生物降解、安全无毒、效果好等优点，对于环境及人体健康没有任何危害作用。

使用本发明的生物保鲜剂能转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续发展等具有重要意义。

本发明的生物保鲜剂，是将果实用粘红酵母（Rhodotorula glutinis）悬浮液和鼠李糖脂复合进行处理而得；其可以进行常温或低温贮藏。

本发明的优点为：

1、本发明的前提是发现鼠李糖脂在低浓度时对粘红酵母无抑制作用，即不影响酵母的生防效果，反而有促进作用。

2、本发明生物防腐保鲜剂除了对于樱桃番茄果实采后病原菌有很好的抑制作用外，对果实品质也有保证，即在延缓樱桃番茄腐败的同时，还保持了其商品价值。

实际使用时，可任选以下任意一种处理方式对果实进行处理：

处理方式一：选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的樱桃番茄，用自来水冲洗、并在室温（25℃左右）下放干（即，果实表面无水分）。将果实在本发明的生物防腐保鲜剂中浸泡3分钟后，取出放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温（25℃左右）下保持20～24小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

处理方式二：采前采用喷壶喷洒的处理方法，将本发明的生物防腐保鲜剂喷在果实表面（湿润即可），待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温（25℃左右）下保持20～24小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施案例。

以下案例中的果实为正常商业成熟度的樱桃番茄果实。选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用质量浓度为0.1%次氯酸钠溶液浸泡消毒1-2分钟后，用自来水冲洗，在室温下（20-25℃）放干后备用。

拮抗酵母为粘红酵母（Rhodotorula glutinis ZJU11，CGMCC NO.3589）；病原菌为链格孢(Alternaria alternata)；鼠李糖脂（保藏号为CCTCC No:M209237）为膏状产品。

称取一定质量的鼠李糖脂膏状物溶于水中，充分震荡，形成浓度为100g/L的鼠李糖脂溶液。

实施例1、生物防腐保鲜剂

先将粘红酵母浓度调整到1×10⁹个细胞/ml，得粘红酵母悬浮液；然后依次进行以下步骤：

（1）取1升体积的粘红酵母悬浮液，适当混匀；

（2）缓慢加入浓度为100g/L的鼠李糖脂溶液50毫升，搅拌混匀5分钟；鼠李糖脂为含糖脂78%的浓缩鼠李糖脂（按照专利号为201010136140.3的实施例2制备而得）；

（3）加水稀释定容到10升备用。该最终所得的每1L生物防腐保鲜剂中分别含有1×10¹¹个粘红酵母细胞，鼠李糖脂500mg，其余为水。使用前需要适当摇匀。

实验1、为了证明本发明的生物防腐保鲜效果，发明人进行了如下实验：

樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂的效果实验：

先用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口；接着将不同组合的试剂30μl分别添加到不同的果实伤口处；然后进行病原菌接种：在以上处理2小时后在每个伤口加入等量的（10μl）病原菌孢子悬浮液（Alternaria alternata，浓度为10⁴spores/ml）。处理完毕后在常温下（20-25℃）贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理重复20个果实，每处理重复3次。第3-5天观察结果。

具体处理安排如下：

处理1：水，即对照。

处理2：每L处理液由500mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

处理3：每L处理液由1×10¹¹个粘红酵母细胞，以及作为余量的水组成；

处理4：每L处理液由1×10¹¹个粘红酵母细胞、200mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

处理5（即实施例1）：每L处理液由1×10¹¹个粘红酵母细胞、500mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

处理6：每L处理液由1×10¹¹个粘红酵母细胞、800mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

处理7：每L处理液由1×10¹²个粘红酵母细胞，以及作为余量的水组成；

处理8：每L处理液由1×10¹¹个粘红酵母细胞、500mg月桂酸单甘酯，以及作为余量的水组成；

处理9：每L处理液由1×10¹¹个红冬孢酵母细胞、500mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

表1、樱桃番茄果实生物防腐保鲜实验结果

从表1可以看出，处理5（处理液所含成分浓度分别为鼠李糖脂500mg/L，粘红酵母1×10⁸细胞/毫升）能显著抑制樱桃番茄果实病害，其效果甚至优于1×10⁹细胞/毫升浓度的酵母单独处理。当鼠李糖脂浓度为500mg/L时与粘红酵母的结合处理效果最佳，优于200mg/L和800mg/L的浓度。

实验2：生物防腐保鲜剂对樱桃番茄贮藏品质的影响

樱桃番茄采摘后直接用以下处理浸泡果实1min：

（1）无菌水；

（2）鼠李糖脂浓度为500mg/L、粘红酵母浓度为1×10⁸细胞/毫升的酵母悬浮液（实施例1所得）。

（3）鼠李糖脂浓度为200mg/L、粘红酵母浓度为1×10⁸细胞/毫升的酵母悬浮液（实施例1所得）。

（4）鼠李糖脂浓度为800mg/L、粘红酵母浓度为1×10⁸细胞/毫升的酵母悬浮液（实施例1所得）。

（5）月桂酸单甘酯浓度为500mg/L、粘红酵母浓度为1×10⁸细胞/毫升的酵母悬浮液。

（6）鼠李糖脂浓度为500mg/L、红冬孢酵母浓度为1×10⁸细胞/毫升的酵母悬浮液。

然后将果实放在塑料筐内，风干后用保鲜膜密封。贮藏于25℃恒温室内，5天后进行贮藏品质分析。每处理重复3次，每次重复10个果实，整个试验重复2次。测定硬度、可溶性固形物、抗坏血酸3项品质指标。结果如表2所示：

表2

结果说明：经本发明的生物保鲜剂处理的樱桃番茄仍能基本保持新鲜果实的硬度和风味。

因此，本发明的生物防腐保鲜剂具有防止腐烂、控制氧化和软化变坏的多种功能，配制和使用方便，安全无毒，是一种极具潜力的新型生物保鲜剂。

最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂，其特征是：每升生物防腐保鲜剂由1×10¹⁰～1×10¹²个粘红酵母细胞、400～600mg鼠李糖脂，以及作为余量的水组成；

所述粘红酵母为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)ZJU 11，保藏号为CGMCC NO.3589；

所述鼠李糖脂是糖脂含量为70％～90％的浓缩鼠李糖脂。

2.根据权利要求1所述的樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂，其特征是：

所述每升保鲜剂中，含有1×10¹¹个粘红酵母细胞和500mg的鼠李糖脂，其余为水。

3.如权利要求1或2所述的樱桃番茄果实生物防腐保鲜剂的用途，其特征是：延缓樱桃番茄果实的腐败，且保证樱桃番茄果实的品质。