CN105176864B - 一种延缓蔬果成熟的微生物菌剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于延缓蔬果成熟的微生物菌剂及其制备方法，主要是利用枯草芽孢杆菌，红球菌属，红曲霉菌，戈登氏菌属，酵母菌及瘦果红酵母菌来制备延迟水果成熟的生物保鲜菌剂的方法，主要步骤为：1、基础培养基培养细菌；2、在诱导条件下继续培养细菌制成菌剂原料；3、收集微生物菌体，按特定比例混合配制菌剂；4、外源施用菌剂，延缓水果成熟。本方法制备的菌剂成本低廉，可以有效延长香蕉、苹果、牛油果、西红柿、桃、李等常见蔬果的保鲜时间，减少传统保鲜食用蜡和塑料薄膜的使用。另外，该方法使用纯生物制剂来延缓水果成熟，是一种绿色、环境友好的产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法，尤其涉及一种可用于延长蔬果保鲜时长的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
在水果运输、储藏、加工、销售以及食用前延迟其成熟时间，直接关系到果实的内在品质和经济收益。目前，市面上常见的水果保鲜技术包括应用银盐，高锰酸钾，1-甲基环丙烯，环丙稀等以及这些化合物的类似物，这些方法涉及重金属以及难闻的化学味道。另外，其它水果保鲜技术还包括水果表面打食用蜡；包裹保鲜膜；低温储存，气体封闭等。然而，这些方法存在较多的局限性，如：水果表面喷施的食用蜡不易清除，且过多摄入食用蜡会对人体产生不良影响；低温保存对水果储存设施要求较高，且耗能较大，同时不能应用于一些不宜冷藏的水果(如：香蕉)；表面包裹保鲜膜增加了水果储藏成本，同时会制造白色污染，不利环保。目前，利用微生物方法来抑制蔬果成熟的专利仍较少报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于延缓蔬果成熟的微生物菌剂及其制备方法，使用经过诱导培养的多种微生物，组成复合菌剂,以非直接接触的方式来延迟蔬菜和水果的成熟，从而增加保藏时间。
本发明是用数个微生物菌种组成的复合菌剂，与水果表面非直接接触后，延迟其成熟的时间，所涉及到的微生物包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，红球菌属(Xanthophyllomyces)，红曲霉菌(Monascus purpureus)，戈登氏菌属(Gordonia)，酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)。上述细菌均可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)采购获得。本发明所述的以上任何单一菌种诱导培养或由任意以上两种或两种以上诱导培养后的菌种混合制成菌剂，用于延迟蔬果的成熟，该菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
1)基础培养：将枯草芽孢杆菌、红球菌属、红曲霉菌、戈登氏菌属、酵母菌和瘦果红酵母接种至各自的基础培养基中(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soy broth等)，在30°摇床上培养1-4天；
2)诱导培养：分别制备各细菌相应的诱导培养基-I，是在各细菌原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100mM Zn2+,0.1-100mM Ni2+，5-280mM维生素C，2-35mM维生素E(可优选采用维生素E307(α-Tocopherol))，0.006-0.7mM乙酰胆碱和0.005-0.45mMn-乙酰氨基葡萄糖；将步骤1)培养的各细菌离心收集并分别转入相应的诱导培养基-I中，在30°摇床培养3-5天；
再分别制备各细菌的诱导培养基-II，是在各细菌原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100mM Fe2+或Fe3+,1-100mM Ca2+,1-100mM Mg2+和0.05-1M羟基脲；将经上述诱导培养基-I培养的各种细菌离心收集并分别转入相应的诱导培养基-II中，在30°摇床培养5天以上；
3)分别离心收集经步骤2)培养的各种菌体细胞，取枯草芽孢杆菌、红球菌属、红曲霉菌、戈登氏菌属、酵母菌和瘦果红酵母中的一种或几种的混合，获得微生物菌剂。
上述技术方案中，将各细菌在基础培养基、诱导培养基-I或诱导培养基-II中培养时，通常培养至使枯草芽孢杆菌，戈登氏菌属和瘦果红酵母各自的菌液终浓度达到108CFU/mL(每毫升中菌落形成单位个数)以上,红球菌属和酵母菌各自的菌液终浓度都达到107CFU/mL以上，红曲霉菌的菌液浓度在分光光度计600纳米处的吸光值达到2.5以上。
优选的，步骤3)中取步骤2)诱导培养后的瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、红球菌属、红曲霉菌、戈登氏菌属和酵母菌按质量比1:(0-5):(0-5):(0-10):(0-10):(0-10)混合的混合物作为微生物菌剂。
本发明制备的微生物菌剂可用于延缓蔬菜或水果的成熟。
本发明的技术方案中所用到的培养基可以是液体培养基或固态培养基(琼脂培养基)，也可以适用于发酵罐发酵培养。
本发明的有益效果是：本发明是利用微生物方法延迟蔬果成熟的技术，可以以非直接接触的方式有效延缓香蕉、苹果、牛油果、西红柿等常见蔬果的成熟时间，使用本方法制备的菌剂成本低廉，且环境友好，无毒无害，绿色安全，可以减少传统保鲜食用蜡和塑料薄膜的使用。
附图说明
图1是实施例1的实验结果对照图；
图2是实施例2的实验结果对照图；
图3是实施例3的实验结果对照图。
具体实施方式
本发明的延缓蔬果成熟的微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)采购以下菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号：1.4255；红球菌属(Xanthophyllomyces)，(Xanthophyllomyces dendrorhous，编号：2.1557)；红曲霉菌(Monascus purpureus)，编号：3.5839；西洼湖戈登氏菌(Gordonia sihwensis)编号：4.2184；沟戈登氏菌(Gordoniaamarae)编号：4.1126；酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)编号：2.3973；瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)编号：2.4248。根据各种菌种的具体要求，将上述菌种接种至各自的液体培养基(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soy broth等)中，在30°摇床(转速100-200rpm)上培养1-4天；
步骤二、将上述各细菌，分别转入诱导培养基-I中，在30°摇床(转速100-200rpm)培养3-5天。诱导培养基-I是在原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100mMZnCl2,0.1-100mM NiCl2，5-280mM维生素C，2-35mM维生素E，0.006-0.7mM乙酰胆碱和0.005-0.45mM n-乙酰氨基葡萄糖。然后将细菌收集并转入诱导培养基-II中，在30°摇床(转速100-200rpm)培养5天以上。诱导培养基-II是在原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100mM FeCl2或FeCl3,1-100mM CaCl2,1-100mM MgCl2,和0.05-1M羟基脲；
步骤三、8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，按一定比例混合制成菌剂。将不同质量的菌剂放入一个空的培养皿，以清水为对照，将该培养皿和待测水果一同放入一个封口的塑料容器中(不必气密)，进行蔬果的成熟转变试验。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
分别在基础培养基中培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)1-4天。使Bacillus subtilis和Rhodotorula acheniorum菌液的终浓度都达到108CFU/mL以上。离心并收集上述细菌的沉淀，并转入诱导培养基-I培养3天，该诱导培养-I基包含0.4mM ZnCl2,3.8mM NiCl2，85mM维生素C，34.8mM维生素E，0.068mM乙酰胆碱和0.23mM n-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养5天，该诱导培养-II含有5mM FeCl2或FeCl3,1mM CaCl2,1mM MgCl2,和260mM羟基脲。8000g高速离心收集诱导培养基中的菌体细胞，按照菌体质量比＝1:1的比例混合，制成菌剂，如图1所示，在培养皿中放置5g细菌菌剂，以清水为对照，将未成熟的香蕉和培养皿一同放置在一个4.4L的塑料盒子里，盖上盖子，分别在不同的时间点(0天，6天，16天)观察和拍照，记录水果成熟情况。
本例中以香蕉表面褐变程度作为评判标准，将结果记录于表1，“-”表示基本没有变化；“+”表示褐变程度较轻；“++”表示褐变程度相对较重。
表1
| 贮存期(天) | 菌剂组 | 清水对照组 |
| 0 | - | - |
| 6 | - | + |
| 16 | - | ++ |
实施例2：
在基础培养基(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soybroth，等)中培养瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红球菌(Xanthophyllomyces dendrorhous)，沟戈登氏菌(Gordonia amarae)，酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等种属的细菌1-4天。使Bacillus subtilis和Gordonia amarae菌液的终浓度达到108CFU/mL以上,Xanthophyllomyces dendrorhous和Saccharomyces cerevisiae菌液的终浓度达到107CFU/mL以上，Monascus purpureus的浓度达到OD600到2.5以上。并转入诱导培养基-I培养3天，该诱导培养基-I包含0.6mM ZnCl2,2.3mM NiCl2，96mM维生素C，12mM维生素E，0.068mM乙酰胆碱和0.23mM n-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养8天，该诱导培养-II含有1mM FeCl2或FeCl3,1mM CaCl2,1mMMgCl2,和130mM羟基脲。8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，然后按照1:1:2:2:4的细胞质量(湿重)比，将瘦果红酵母，枯草芽孢杆菌，红球菌，沟戈登氏菌，酵母菌混合制成菌剂，如图2所示，在培养皿中放置10g细菌菌剂，以清水为对照，将未成熟的香蕉和培养皿一同放置在一个4.4L的塑料盒子里，盖上盖子，分别在不同的时间点(0天，7天，18天)观察和拍照，记录水果成熟情况。
本例中以香蕉表面褐变程度作为评判标准，将结果记录于表2，“-”表示基本没有变化；“+”表示褐变程度较轻；“++”表示褐变程度相对较重。
表2
| 贮存期(天) | 菌剂组 | 清水对照组 |
| 0 | - | - |
| 7 | - | + |
| 18 | - | ++ |
实施例3：
在基础培养基(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soybroth等)中培养瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红球菌(Xanthophyllomyces dendrorhous)；红曲霉菌(Monascus purpureus)；西洼湖戈登氏菌(Gordonia sihwensis)和酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等种属的细菌1-4天。使Bacillus subtilis，Sarcina ventriculi，Gordonia amarae和Rhodotorulaacheniorum菌液的终浓度达到108CFU/mL以上,Xanthophyllomyces dendrorhous和Saccharomyces cerevisiae菌液的终浓度达到107CFU/mL以上，Monascus purpureus的浓度达到OD600＝2.5。并转入诱导培养基-I培养5天，该诱导培养-I基包含0.6mM ZnCl2,2mMNiCl2，85mM维生素C，34.8mM维生素E，0.068mM乙酰胆碱和0.23mM n-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养5天，该诱导培养-II含有3mM FeCl2或FeCl3,9mM CaCl2,74mM MgCl2,和200mM羟基脲。8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，然后按照1:1:2:2:4:4的细胞质量(湿重)比，将瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、红球菌、西洼湖戈登氏菌、酵母菌和红曲霉菌混合制成菌剂。如图3所示，在培养皿中放置15g细菌菌剂，将牛油果和培养皿放置进入一个4.4L的塑料盒子内，盖上盖子，分别在不同的时间点(0天，4天，10天)切开牛油果观察并拍照，记录水果成熟情况。
本例中以对切开牛油果果肉褐变程度作为评判标准，将结果记录于表3，“-”表示基本没有变化；“+”表示褐变程度较轻；“++”表示褐变程度相对较重。
表3
| 贮存期(天) | 菌剂组 | 空白对照组 |
| 0 | - | - |
| 4 | - | - |
| 10 | - | ++ |
实施例4：
在基础培养基(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soybroth等)中培养瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红球菌(Xanthophyllomyces dendrorhous)；红曲霉菌(Monascus purpureus)；西洼湖戈登氏菌(Gordonia sihwensis)和酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等种属的细菌1-4天。使Bacillus subtilis，Sarcina ventriculi，Gordonia amarae和Rhodotorulaacheniorum菌液的终浓度达到108CFU/mL以上,Xanthophyllomyces dendrorhous和Saccharomyces cerevisiae菌液的终浓度达到107CFU/mL以上，Monascus purpureus的浓度达到OD600＝2.5。并转入诱导培养基-I培养5天，该诱导培养-I基包含100mM ZnCl2,0.1mMNiCl2，5mM维生素C，2mM维生素E，0.7mM乙酰胆碱和0.005mM n-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养5天，该诱导培养-II含有0.1mM FeCl2或FeCl3,100mM CaCl2,100mM MgCl2,和1M羟基脲。8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，然后按照1:0:5:0:10:10的细胞质量(湿重)比，将瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、红球菌、西洼湖戈登氏菌、酵母菌和红曲霉菌混合制成菌剂。
实施例5：
在基础培养基(包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soybroth等)中培养瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，红球菌(Xanthophyllomyces dendrorhous)；红曲霉菌(Monascus purpureus)；西洼湖戈登氏菌(Gordonia sihwensis)和酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等种属的细菌1-4天。使Bacillus subtilis，Sarcina ventriculi，Gordonia amarae和Rhodotorulaacheniorum菌液的终浓度达到108CFU/mL以上,Xanthophyllomyces dendrorhous和Saccharomyces cerevisiae菌液的终浓度达到107CFU/mL以上，Monascus purpureus的浓度达到OD600＝2.5。并转入诱导培养基-I培养5天，该诱导培养-I基包含0.1mM ZnCl2,100mMNiCl2，280mM维生素C，34.8mM维生素E307，0.006mM乙酰胆碱和0.45mM n-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养5天，该诱导培养-II含有100mM FeCl2或FeCl3,5mM CaCl2,1mMMgCl2,和50mM羟基脲。8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，然后按照1:5:0:10:0:0的细胞质量(湿重)比，将瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、红球菌、西洼湖戈登氏菌、酵母菌和红曲霉菌混合制成菌剂。
Claims (6)
1.一种微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，所述的微生物菌剂采用如下方法制备：
1）基础培养：将从中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）采购的以下菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），编号：1.4255 ；Xanthophyllomyces dendrorhous，编号：2.1557；紫红曲霉(Monascus purpureus)，编号：3.5839；西洼湖戈登氏菌（Gordonia sihwensis）编号： 4.2184；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编号：2.3973；瘦果红酵母（Rhodotorula acheniorum）编号：2.4248接种至各自的基础培养基中，在30℃摇床上培养1-4天；
2）诱导培养：分别制备各细菌相应的诱导培养基-I，是在各细菌原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100 mM Zn2+, 0.1-100 mM Ni2+，5-280mM维生素C，2-35mM维生素E，0.006-0.7mM乙酰胆碱和0.005-0.45mM n-乙酰氨基葡萄糖；将步骤1）培养的各细菌离心收集并分别转入相应的诱导培养基-I中，在30℃摇床培养3-5天；
分别制备各细菌的诱导培养基-II，是在各细菌原有的基础培养基的成分里加入以下几种物质：0.1-100 mM Fe2+或 Fe3+, 1-100 mM Ca2+,1-100 mM Mg2+和0.05-1mM 羟基脲；将经上述诱导培养基-I培养的各种细菌离心收集并分别转入相应的诱导培养基-II中，在30℃摇床培养5天以上；
3）分别离心收集经步骤2）培养的各种菌体细胞，取枯草芽孢杆菌和瘦果红酵母混合，或者取Xanthophyllomyces dendrorhous、紫红曲霉、西洼湖戈登氏菌、酿酒酵母中的几种与枯草芽孢杆菌和瘦果红酵母混合，获得微生物菌剂；
所述的微生物菌剂以非直接接触的方式用于延缓蔬果成熟。
2. 如权利要求1所述的微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，将各细菌在基础培养基、诱导培养基-I或诱导培养基-II中培养时，均培养至使枯草芽孢杆菌，西洼湖戈登氏菌和瘦果红酵母各自的菌液终浓度达到108 CFU/mL以上,Xanthophyllomyces dendrorhous和酿酒酵母各自的菌液终浓度都达到107CFU/mL以上，紫红曲霉的菌液浓度在分光光度计600纳米处的吸光值达到2.5以上。
3. 如权利要求1所述的微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，步骤3）为取步骤2）诱导培养后的瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、Xanthophyllomyces dendrorhous、紫红曲霉、西洼湖戈登氏菌和酿酒酵母按质量比1:1:（0-5）:（0-10）:（0-10）:（0-10）混合的混合物作为微生物菌剂。
4.如权利要求1所述的微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，所述的维生素E为维生素E307。
5.如权利要求1所述的微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，所述的离心采用8000g的转速。
6. 如权利要求1所述的微生物菌剂用于延缓蔬果成熟的用途，其特征在于，培养摇床的转速为10-300 rpm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |