CN114766547B - 一种重悬液延缓百香果腐败的方法及其专用菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重悬液延缓百香果腐败的方法及其专用菌，包括：将冠突散囊菌GY,Ecgy培养得培养物，将2g黑毛茶磨成粉末后，按1：50的茶水比加入100℃去离子水，100r/min浸提30min，纱布过滤，高压灭菌锅121℃，0.2Mpa灭菌30min，冷却至室温制成黑毛茶茶汤；将培养物过滤后的菌丝与黑毛茶茶汤按1：1的比例进行重悬并混匀；取百香果放入黑毛茶茶汤重悬液浸泡30s‑60s，取出置于室温中自然存放。本发明对百香果腐败真菌拮抗能力强，对百香果保鲜效果好且安全稳定，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及食品保鲜技术领域，具体来说涉及一种重悬液延缓百香果 腐败的方法，同时还涉及该方法使用的专用菌。
背景技术
水果是天然营养食品，含有人类生活所需要的多种营养物质。但是水 果生产存在着较强的季节性、区域性及水果本身的易腐性，与广大消费者 对水果需要的多样性及淡季调节的迫切性相矛盾。以百香果为例，目前贮 藏保鲜技术主要以低温贮藏为主，辅以1-甲基环丙烯(1一 Methylcyclopropene，1-MCP)延缓皱缩腐烂。但百香果作为典型的呼吸越变型热带水果，上述贮藏技术对延缓采后品质劣变效果有限，且出库后常 温下货架期5天左右，其果皮就会失水皱缩，随后受病菌侵染而腐烂。国 内外在果蔬保鲜领域采用的技术手段主要有物理和化学两大类，每一类又 衍生出很多的新技术。化学防腐剂对人体的毒副作用、致癌已让人们意识 到它的危险性。物理防腐保鲜方法要求技术性强、设备维修难、成本比较 高。而生物保鲜物质直接来源于生物体自身组成成分或其代谢产物，具有 无味、无毒、安全等特点。此外生物保鲜物质一般都可被生物降解，不会 造成二次污染。
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)俗称“金花菌”，散囊菌属的一种真 菌，是存在于黑毛茶中使其产生特征风味的优势益生菌。营养要求低，适 应性强，能利用多种氮源、碳源。黑毛茶属于后发酵茶，“发花”黑毛茶 具有较强的促消化、降血脂、溶解脂肪、调节糖类代谢和促进肠胃运动、 减肥等功效，这也使得冠突散囊菌的应用越来越受到人们的青睐。根据现 有研究已证实金花菌淀粉酶和氧化酶，可催化茶叶中的蛋白质、淀粉转化 为单糖，催化多酚类化合物氧化，转化成对人体有益的物质，使茶叶的口 感等特性提高和优化，其特性完全符合作为生物保鲜中对所运用菌种的要 求。
中国专利公开号CN105994611A于2016年10月12日公开了一种“冠 突散囊菌LS1菌株发酵葛根产物在樱桃蕃茄保鲜中的应用”，其用葛根作 冠突散囊菌的发酵底物，利用发酵后产物对番茄进行处理，达到保鲜效果。 其使用葛根粉作为培养基，其营养物质丰富，适宜多种微生物生长，在保 鲜防腐中，容易因操作不当造成杂菌污染，导致保鲜效果不佳。
哈茨木霉菌作为一种重要的生防真菌、具有广谱杀菌作用，通过营养 竞争、重寄生、细胞壁分解酵素、以及诱导植物产生抗性等多重机制，对 多种植物病原菌产生拮抗作用，具有保护和治疗双重功效。但目前为止仍 未有研究表明哈茨木霉可食用，在食品安全性上存在一定风险。另外，哈 茨木霉在大量繁殖时会产生霉味，影响水果本身的商品性。本实验将百香 果腐败过程中的腐败真菌分离纯化后将冠突散囊菌与哈茨木霉分别对水果上腐败真菌进行对峙抑菌实验，结果显示百香果中分离的鉴定的腐烂真菌 为镰刀菌，之后再分别制作哈茨木霉和冠突散囊重悬液对水果进行浸泡和 腐败时间对比，以证明其保鲜作用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种对腐败真菌拮抗能力强， 对水果保鲜效果好且安全稳定，生产成本低的重悬液延缓百香果腐败的方 法。
本发明的另一目的在于提供该重悬液延缓百香果腐败的方法中使用的 专用菌。
本发明的一种重悬液延缓百香果腐败的方法，包括以下步骤：
(1)菌液的制备：将冠突散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy) 在固体PDA上28℃，倒置暗培养4d，至菌斑点直径约为7cm，在菌斑的 边缘打取6mm的菌饼，置于250ml，液体PDA中，28℃、180r/min暗培养 12h得培养物；
(2)黑毛茶茶汤的制备：将2g黑毛茶磨成粉末后，按1：50的茶水 比加入100℃去离子水，100r/min浸提30min，纱布过滤，高压灭菌锅121℃， 0.2Mpa灭菌30min，冷却至室温制成黑毛茶茶汤；
(3)黑毛茶茶汤重悬液的制备：将培养物过滤后的菌丝与黑毛茶茶汤 按1：1的比例进行重悬并混匀；
(4)取百香果放入黑毛茶茶汤重悬液浸泡30s-60s，取出置于室温中自 然存放。
本发明的冠突散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)，其形态 特征：在PDA琼脂培养基上28℃恒温培养，约2天后，冠突散囊菌开始 生长，首先长出白色菌丝向外延伸，菌落中心逐渐由白色变为浅黄色，黄 色闭囊壳产生在整个菌落区域内，菌落直径达到20～25mm，呈淡黄色，第 5天时菌落直径30～40mm，菌落边缘呈淡黄色，中心凸起，越靠近菌落中 心颜色依次变深呈黄色、深黄色，菌落中心颜色深至橄榄褐色或深褐色， 并且菌落中心有少许黄色透明小液珠渗出。菌落生长7d时，直径达到65～ 70mm，菌落背部有大量色素渗出，扩散进入培养基，使培养基呈现深褐色。 约12d，能够很明显观察到菌落中心有干涩、凸起褶皱，菌落直径达70～ 75mm。在显微镜下观察可见，该菌株的孢子呈现圆形，少数孢子呈现卵圆 形，分生孢子椭圆形，少数近球形，壁粗糙，有小刺。
该菌种已于2022年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址： 中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO：M 2022211，名称为：冠突 散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)。
(一)冠突散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)的分离、鉴 定及菌液制备步骤：
(1)称取3g黑毛茶，置于含有50mL无菌生理盐水与玻璃珠的100mL 三角瓶内，200r/min培养60min，将茶末悬液稀释10倍、100倍，悬液和 稀释液100μL涂布于孟加拉红培养基上用于分离；
(2)26℃倒置培养，每天观察记录，选取长势良好的真菌菌落，用 PDA培养基进行纯化；
(3)冠突散囊菌的鉴定：根据冠突散囊菌的形态学鉴定结果，提取筛 选出的疑似真菌的DNA使用ITS1和ITS4进行PCR对获得冠突散囊菌进 行鉴定；
(4)冠突散囊菌菌液的制备：将步骤(3)中鉴定获得的冠突散囊菌 在接种于固体PDA上28℃，倒置暗培养4d。至菌斑点直径约为7cm，在 菌斑的边缘打取6mm的菌饼，置于250ml，液体PDA中，28℃、180r/min 暗培养12h，得到的冠突散囊菌的菌液。
(二)分离和培养冠突散囊菌采用的培养基：
孟加拉红培养基：将蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁 (含7H2O)0.5g，琼脂20g，孟加拉红0.0333g混匀加入蒸馏水中，至1000mL。
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g混匀加入蒸馏水中，至1000mL。
高温高压消毒后倒在培养皿中，冷却即可。
(三)菌种的保种和传代：
保种用的培养基为PDA培养基。
保存方法有2种：
(1)每周一次，从已长满的平板上切取一块带菌丝的PAD培养基块 转种到新的平板上。
(2)用15×200mm的试管，盛PDA培养基5ml，做成斜面，接种真 菌，25℃培养2-3d，倒10ml左右灭菌石蜡油覆盖其上，置25℃保存。3个 月转种一次。
(四)菌种的生态特征：
在PDA琼脂培养基上28℃恒温培养，约2天后，冠突散囊菌开始生长， 首先长出白色菌丝向外延伸，菌落中心逐渐由白色变为浅黄色，黄色闭囊 壳产生在整个菌落区域内，菌落直径达到20-25mm，呈淡黄色，第5天时 菌落直径30-40mm，菌落边缘呈淡黄色，中心凸起，越靠近菌落中心颜色 依次变深呈黄色、深黄色，菌落中心颜色深至橄榄褐色或深褐色，并且菌 落中心有少许黄色透明小液珠渗出。菌落生长7天时，直径达到65-70mm， 菌落背部有大量色素渗出，扩散进入培养基，使培养基呈现深褐色。约12 天时，能够很明显观察到菌落中心有干涩、凸起褶皱，菌落直径达70-75mm。 在显微镜下观察可见，该菌株的孢子呈现圆形，少数孢子呈现卵圆形，分 生孢子椭圆形，少数近球形，壁粗糙，有小刺。
(五)菌种的培养特性
(1)培养温度25-35℃，最适温度28-32℃；
(2)培养pH 3-7；最佳范围为4-6。
(3)接种量0.5％-1.5％，摇瓶转数80-120r/min之间对冠突散囊菌的生 长影响不大。
对照散囊菌属的特征，本真菌按形态结构应该属于散囊菌属。根据首 先发现的地名命名为冠突散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知： 本发明选用茶汤与冠突散囊菌GY,Ecgy配制成重悬液而不是发酵产物，冠 突散囊菌GY,Ecgy自茶叶中分离，适宜生长在茶汤中，冠突散囊菌GY,Ecgy 因此形成优势菌群，抑制杂菌或水果表面的腐败真菌的生长，从而使其在 水果保鲜效果稳定。对腐败真菌拮抗能力强，具有一定的耐渗透压能力， 并具有比较强的适应能力，容易培养和保存及工业化生产，生产成本低，保鲜效果好。
附图说明
图1为百香果不同处理后的储藏效果图；
图2为百香果果实皱缩度图；
图3为实施例1与对比例1～4剖开图；
图4为百香果表皮真菌分别和冠突散囊菌，哈茨木霉进行抑菌实验图。
具体实施方式
实施例1：
一种重悬液延缓百香果腐败的方法，包括以下：
(1)重悬液制备：
a.冠突散囊菌GY,Ecgy(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)的分离和纯化： 称取3g黑毛茶，置于含有50mL无菌生理盐水与玻璃珠的100mL三角瓶内， 200r/min培养60min，将茶末悬液稀释10倍、100倍，悬液和稀释液100μL 涂布于孟加拉红培养基上用于分离。26℃倒置培养，每天观察记录，选取 长势良好的真菌菌落，用PDA进行纯化。
b.冠突散囊菌的鉴定：根据冠突散囊菌的形态学鉴定结果，提取筛选出 的疑似真菌的DNA使用ITS1和ITS4进行PCR对获得冠突散囊菌进行鉴 定。
c.冠突散囊菌菌液的制备：将步骤b中鉴定获得的冠突散囊菌在固体PDA上28℃，倒置暗培养4d。至菌斑点直径约为7cm，在菌斑的边缘打取 6mm的菌饼，置于250ml，液体PDA中，28℃、180r/min暗培养12h。
d.黑毛茶茶汤的制备：将2g(黑毛茶磨成粉末后按1：50的茶水比加 入100℃去离子水，100r/min提取30min纱布过滤制成黑毛茶茶汤，121℃， 30min灭菌。
e.黑毛茶茶汤重悬液体的制备：将步骤c的培养物过滤后的菌丝与步骤 d冷却的黑毛茶茶汤按1：1的比例进行重悬并混匀；
(2)取百香果放入步骤(1)制得的重悬液浸泡30s-60s，取出置于室温 中自然存放。
对比例1：黑毛茶茶汤的水果保鲜试验
(1)黑毛茶茶汤的制备，包括以下步骤：
茶汤的制备：将2g黑毛茶磨成粉末后按1：50的茶水比加入100℃去 离子水，100r/min提取30min，纱布过滤制成黑毛茶茶汤，121℃，30min 灭菌。
(2)取百香果放入步骤(1)制得的黑毛茶茶汤浸泡30s-60s，取出置 于室温中自然存放。
对比例2：哈茨木霉的水果保鲜试验
(1)哈茨木霉与黑毛茶茶汤重悬液的制备，步骤如下：
a.哈茨木霉购于中国菌种资源库；
b.哈茨木霉菌菌液的制备：将步骤a中的哈茨木霉接种在固体PDA上 28℃，倒置暗培养2d，至菌斑点直径约为7cm，在菌斑的边缘打取6mm的 菌饼，置于250ml，液体PDA中，28℃、180r/min暗培养12h；
c.黑毛茶茶汤的制备:将2g黑毛茶磨成粉末后按1：50的茶水比加入100℃ 去离子水，100r/min提取30min，纱布过滤制成黑毛茶茶汤，121℃，30min 灭菌；
d.黑毛茶茶汤重悬液体的制备：将步骤b的培养物过滤后的菌丝与步骤 c冷却的黑毛茶茶汤按1：1的比例进行重悬并混匀；
(2)取百香果放入步骤(1)中所制重悬液浸泡30s-60s，取出置于室 温中自然存放。
对比例3：哈茨木霉与冠突散囊菌复配的水果保鲜试验
(1)哈茨木霉与冠突散囊菌复配黑毛茶茶汤重悬液，包括以下步骤：
a.哈茨木霉购自中国菌种资源库。
b.冠突散囊菌(Eurotium cristatum,GY,Ecgy)的分离和纯化：称取3g， 置于含有50mL无菌生理盐水与玻璃珠的100mL三角瓶内，200r/min培养 60min，将茶末悬液稀释10倍、100倍，悬液和稀释液100μL涂布于孟加 拉红培养基上用于分离。26℃倒置培养，每天观察记录，选取长势良好的 真菌菌落，用PDA进行纯化。
c.冠突散囊菌的鉴定：根据冠突散囊菌的形态学鉴定结果，提取筛选出 的疑似真菌的DNA使用ITS1和ITS4进行PCR对获得冠突散囊菌进行鉴 定。
d.哈茨木霉菌和冠突散囊菌菌液的制备：将步骤a和c中的哈茨木霉和 鉴定后的冠突散囊菌种在固体PDA上28℃，倒置暗培养2d，至菌斑点直 径约为7cm，在菌斑的边缘打取6mm的菌饼，置于250ml，液体PDA中， 28℃、180r/min暗培养12h。
e.哈茨木霉与冠突散囊菌混配菌液的制备：将步骤d中获取的哈茨木霉 与步骤c中获取的冠突散囊菌挑入液体PDA培养基中置于摇床反应12H， 反应条件为28℃，180r/min；培养结束后用纱布覆盖瓶口进行过滤获得菌 丝；
f.黑毛茶茶汤的制备：将2g黑毛茶磨成粉末后按1：50的茶水比加入 100℃去离子水，100r/min提取30min，纱布过滤制成黑毛茶茶汤，121℃， 30min灭菌。
g.黑毛茶茶汤重悬液体的制备：取步骤e反应结束的菌丝与步骤f冷却 后的黑毛茶茶汤按1：1的比例进行配置并摇匀；
(2)取百香果放入步骤(1)中制得的重悬液浸泡30s-60s，取出置于 室温中自然存放。
空白例：
选用与实施例1～4中同期同品种的水果于相同环境即室温中自然存放。
试验结果分析：
实施例1(见图1)与对比例1～3及空白例(见图2～4)处理的百香果 置于室温中自然存放，观察记录其腐烂程度(变质面积≥50％判其腐烂)并比 较腐烂率(果实腐烂率％＝腐败果实数/调查总果实数*100％)(见表1)。
表1
各组处理后的百香果分别剖开，对其果实内部进行观察比较(见表2)
表2
针对贮藏9天后的百香果表皮真菌组成鉴定见表3
表3
结果说明：本实验将百香果腐败过程中的腐败真菌分离纯化后将冠突 散囊菌与哈茨木霉分别对水果上腐败真菌进行对峙抑菌实验，结果显示百 香果中分离的鉴定的腐烂真菌为镰刀菌，之后再分别制作哈茨木霉和冠突 散囊重悬液对水果进行浸泡和腐败时间对比，以证明其保鲜作用。
本发明以黑毛茶为原料，分离纯化冠突散囊菌与黑毛茶茶汤制成重悬 液，并与生防真菌哈茨木霉作为对照比较，结果显示黑毛茶茶汤与冠突散 囊菌菌液所配的重悬液延缓水果腐败的效果更好。冠突散囊菌GY,Ecgy自 茶叶中分离，适宜生长在茶汤中，冠突散囊菌GY,Ecgy因此形成优势菌群， 抑制杂菌或水果表面的腐败真菌的生长，从而使其在水果保鲜效果稳定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不 局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本 发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种重悬液延缓百香果腐败的方法，包括以下步骤：
（1）菌液的制备：将冠突散囊菌GY,Ecgy（Eurotium cristatum,GY,Ecgy）在固体PDA上28℃，倒置暗培养4d，至菌斑点直径为7cm，在菌斑的边缘打取6mm的菌饼，置于250ml，液体PDA中，28℃、180r/min暗培养12h得培养物；
（2）黑毛茶茶汤的制备：将2g黑毛茶磨成粉末后，按1：50的茶水比加入100℃去离子水，100r/min浸提30min，纱布过滤，高压灭菌锅121℃，0.2Mpa灭菌30min，冷却至室温制成黑毛茶茶汤；
（3）黑毛茶茶汤重悬液的制备：将培养物过滤后的菌丝与黑毛茶茶汤按1：1的比例进行重悬并混匀；
（4）取百香果放入黑毛茶茶汤重悬液浸泡30s-60s，取出置于室温中自然存放；
其中所述的重悬液延缓百香果腐败的方法中使用的专用菌，其保藏号：CCTCC NO：M2022211，名称为：冠突散囊菌GY,Ecgy（Eurotium cristatum,GY,Ecgy）。
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