CN112195118B - 一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌pc28152及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌pc28152及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌PC28152，该菌株已于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20198。本发明的植物乳杆菌PC28152及其发酵液具有广谱抑制真菌活性的作用，尤其对黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌具有明显的抑制作用。在食品保鲜和防腐方面的应用中，能够有效抑制腐败真菌对食品的侵染，显著提高食品的货架期。

Description

一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌PC28152及其应用
技术领域
本发明属于微生物和生物技术领域，尤其涉及一株具有广谱抑制真菌活 性的植物乳杆菌PC28152及其应用。
背景技术
真菌污染是引起食品原料和产品在加工、运输和保藏过程中发生品质改 变的极其重要的因素之一。真菌在食品中主要以菌丝体、孢子和菌核等形式 存在，一方面会通过自身的生长繁殖损耗食品中的营养物质而降低食品品质 和营养价值。另一方面，如黄曲霉、镰刀菌等真菌在繁殖过程中分泌多种真 菌毒素，严重危害人体健康并由此产生诸多食品安全问题。
食品工业中对真菌污染的防治以物理和化学防腐方法为主。物理方法主 要包括高温、紫外及吸附等方法。化学方法主要采用强氧化剂、强酸碱性物 质进行消毒和防腐，在食品工业中最为常见的防腐剂主要有苯甲酸、山梨酸 和对羟基苯甲酸及其盐等。随着广大消费者食品安全意识的增强，长期使用 化学防腐剂对人体健康的潜在危险受到越来越多的重视，使用安全、绿色的 生物防腐手段取代现有化学防腐剂已成为时下食品工业领域的研究热点和 发展趋势。
乳酸菌是一类能够代谢碳水化合物产生大量乳酸的细菌，在自然界分布 极为广泛且具有丰富的物种多样性，其中绝大多数与人类的生活密切相关， 是一类公认安全(GRAS，generally recognized as safe)的微生物。众多研究 表明乳酸菌具有拮抗病原菌、调节肠道菌群、增强机体免疫力及预防和治疗 多种疾病的益生功能。就抑菌特性而言，在众多乳酸菌中植物乳杆菌表现的 尤为引人关注。因此，在食品工业领域，筛选具有广谱抑制食品腐败真菌的 植物乳杆菌，并将其作为安全的生物防腐剂替代现有化学防腐剂具有极高的 应用价值和市场前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳 杆菌PC28152，该菌株可显著的抑制黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰 刀菌和芽枝状枝孢菌活性，同时可有效抑制腐败真菌对食品的侵染，提高食 品的货架期。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌 PC28152，所述植物乳杆菌PC28152于2020年7月6日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20198。
本发明中，所述植物乳杆菌PC28152在MRS琼脂培养基上的菌落形态 为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐、菌落直径1～2mm。
本发明中，所述植物乳杆菌PC28152来源于四川传统泡菜样品。
本发明提供一株植物乳杆菌PC28152发酵得到的发酵液。
优选的，该发酵液的制备方法包括以下步骤：将植物乳杆菌PC28152 接种于MRS液体培养基中，35～40℃培养10～14h，得发酵液。
优选的，该发酵液的制备方法还包括：将所述发酵液离心，得到上清液。
优选的，所述上清液再经滤膜过滤后得到无菌发酵液。
本发明提供一种植物乳杆菌PC28152或植物乳杆菌PC28152的发酵液 在抑制黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌活性中的 应用。
本发明提供一种植物乳杆菌PC28152或植物乳杆菌PC28152的发酵液 在食品保鲜和防腐中的应用。
本发明提供一种保鲜剂和防腐剂，包括植物乳杆菌PC28152或植物乳杆 菌PC28152的发酵液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次从四川传统泡菜样品中分离出植物乳杆菌PC28152，该菌株 具有明显抑制黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌活 性的作用，经抑菌试验结果表明，植物乳杆菌PC28152对上述5种食品腐败 真菌的抑菌圈直径分别为：黄曲霉8.17±1.35mm、串珠镰刀菌8.05±1.57mm、 扩展青霉13.64±1.33mm、产黄青霉11.20±0.87mm和芽枝状枝孢 10.62±1.08mm，植物乳杆菌PC28152无菌上清液对上述5种食品腐败真菌 的抑制率分别为：黄曲霉38.2％、串珠镰刀菌42.1％、扩展青霉29.5％、产 黄青霉21.8％和芽枝状枝孢20.5％。在食品保鲜和防腐方面的应用中，能够 有效抑制腐败真菌对食品的侵染，显著提高食品的货架期。
附图说明
图1植物乳杆菌PC28152抑制真菌活性图。
图2植物乳杆菌PC28152菌落形态图。
图3植物乳杆菌PC28152镜检结果图(×1000)。
图4植物乳杆菌PC28152应用于面包防腐图。
生物保藏说明
植物乳杆菌PC28152，拉丁文为Lactobacillus plantarum，于2020年7 月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏 编号为：CGMCC NO.20198。
具体实施方式
本发明提供了一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌 PC28152，所述植物乳杆菌PC28152于2020年7月6日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20198。
在本发明中，所述植物乳杆菌PC28152在MRS琼脂培养基上的菌落形 态为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐、菌落直径1～2mm。 本发明所述植物乳杆菌PC28152经革兰氏染色后显微镜观察：该菌为革兰氏 阳性菌，呈直杆状，单个、成对或呈链状，大小3.0-8.0μm×0.9-1.2μm，无鞭 毛，不产芽孢。所述MRS琼脂培养基配方为：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、 酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温-801mL、磷酸氢二钠2g、无水乙酸钠5g、柠 檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g、琼脂粉15g、蒸馏水定容1L，调 节初始pH至6.20，121℃灭菌15min。本发明对大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母 粉、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钠、无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸锰、 硫酸镁、琼脂粉的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市 售产品即可。
在本发明中，所述植物乳杆菌PC28152分离自四川省蒲江县甘溪镇传统 泡菜样品。所述植物乳杆菌PC28152的分离方法优选为：采用生理盐水将四 川传统泡菜样品进行梯度稀释，稀释后取200μL的10-4、10-5和10-6稀释液 涂布于含放线菌酮(0.1wt％)和硫酸粘菌素(0.1wt％)的MRS琼脂培养基 上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放于培养箱中37℃厌氧培养 24～72h，挑取单菌落连续在上述相同的培养基上划线纯化2次后进行革兰氏 染色和过氧化氢酶试验，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌暂定为乳酸菌。
本发明提供了植物乳杆菌PC28152发酵得到的发酵液。
在本发明中，所述发酵液的制备方法优选的包括以下步骤：将植物乳杆 菌PC28152接种于MRS液体培养基中，35～40℃培养10～14h，得发酵液。 进一步优选的，还包括将所述发酵液离心，得到上清液。更优选的，将所述 上清液再经滤膜过滤后得到无菌发酵液。本发明所述MRS液体培养基配方 为：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐温-801mL、 磷酸氢二钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g， 蒸馏水定容1L，调节初始pH至6.20，121℃灭菌15min；所述滤膜优选为 0.22μm滤膜。本发明对大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、吐温-80、 磷酸氢二钠、无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸锰、硫酸镁的来源没有特殊的 限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。
本发明提供植物乳杆菌PC28152或植物乳杆菌PC28152发酵液在抑制 黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌活性中的应用。 在具体实施例中，本发明的黄曲霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌购自中国工 业微生物菌种保藏管理中心，产黄青霉和扩展青霉购自北京北纳创联生物技 术研究院。本发明所述黄曲霉优选为黄曲霉CICC2219、产黄青霉优选为产 黄青霉BNCC185782、扩展青霉优选为扩展青霉BNCC185786、串珠镰刀菌优选为串珠镰刀菌CICC2490和芽枝状枝孢菌优选为芽枝状枝孢CICC2477。
本发明提供植物乳杆菌PC28152或植物乳杆菌PC28152发酵液在食品 保鲜和防腐中的应用。本发明的食品为可供人类食用或饮用的物质，包括加 工食品，半成品和未加工食品，包括但不限于面食、水果、蔬菜、肉食、粮 油、糕点、奶制品等。本发明提供的植物乳杆菌PC28152和发酵液中含有能 够抑制有害微生物的植物乳杆菌及其代谢产物，尤其可抑制黄曲霉、产黄青 霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌的生长和产毒，防止食品的腐败， 延长食品的保鲜时间。
本发明提供一种保鲜剂和防腐剂，优选的包括植物乳杆菌PC28152或植 物乳杆菌PC28152的发酵液。本发明所述的保鲜剂和防腐剂还可包括制备保 鲜剂和防腐剂所用的载体辅料。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1植物乳杆菌PC28152分离、鉴定和筛选
1、菌株的分离
采用生理盐水将四川传统泡菜样品进行梯度稀释，稀释后取200μL的 10-4、10-5和10-6稀释液涂布于含放线菌酮(0.1wt％)和硫酸粘菌素(0.1wt％) 的MRS琼脂培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放于培养箱 中37℃厌氧培养24～72h，挑取单菌落连续在上述相同的培养基上划线纯化2 次后进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌暂 定为植物乳酸菌。
2、菌株的筛选
采用双层平板点接法：将MRS琼脂培养基倒入培养皿作为下层平板， 待其凝固后点接5μL植物乳杆菌菌液，37℃培养12h形成圆形菌斑后，将 10mL分别含有黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌 真菌孢子(104孢子/mL)的半固体PDA培养基分别覆盖在含植物乳杆菌菌斑 的下层培养基上，25℃培养3-5d，筛选均可同时抑制黄曲霉、产黄青霉、扩 展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌活性最强的植物乳杆菌，采用游标卡尺分别测定5种真菌的抑菌圈直径，选出均可显著抑制上述5种真菌活性的菌 株，即为最终筛选出的植物乳杆菌PC28152。结果见表1和图1。
所述的MRS琼脂培养基为大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡 萄糖20g、吐温-801mL、磷酸氢二钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、 硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g、琼脂粉15g。
所述MRS琼脂培养基的制备方法为将上述配比的MRS琼脂培养基与蒸 馏水混合，定容至1L，调节初始pH至6.20，121℃灭菌15min。
所述的半固体PDA培养基购自OXID公司。
由表1和图1试验结果显示，本发明分离的植物乳杆菌PC28152对5 种食品腐败真菌(黄曲霉CICC2219、产黄青霉BNCC185782、扩展青霉 BNCC185786、串珠镰刀菌CICC2490、芽枝状枝孢CICC2477)具有较强的 抑菌活性，表明分离的该菌株具有明显的广谱抗真菌活性。
表1植物乳杆菌PC28152广谱抑制真菌活性测定
Figure BDA0002691746810000061
3、分子生物学鉴定
以植物乳杆菌PC28152菌株的基因组DNA为模板，利用扩增细菌16S rDNA的通用引物上游引物27F(5’-NNNAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 和下游引物1492R(5’-NNNACCTTGTTACGACTT-3’)，对植物乳杆菌的16S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min， 55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10minPCR产物为单 一条带，通过测序得到16S rDNA，其序列长度为1477bp，同时将该菌株的 16S rDNA序列与植物乳杆菌模式菌株(Lactobacillus plantarum strain WCFS1)的核苷酸序列进行同源性比对，结果同源性为99.99％，故确定筛 选出的植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌PC28152。
3、形态学特征
本发明的植物乳杆菌PC28152经革兰氏染色后显微镜观察：该菌为革兰 氏阳性菌，呈直杆状，单个、成对或呈链状，大小3.0-8.0μm×0.9～1.2μm， 无鞭毛，不产芽孢。结果见图2。
4、菌落形态特征
植物乳杆菌PC28152在MRS琼脂培养基上的菌落形态为乳白色、表面 光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐、菌落直径1～2mm。结果见图3。
实施例2植物乳杆菌PC28152无菌发酵上清液的制备和抑菌活性的测 定
1、植物乳杆菌PC28152无菌发酵上清液的制备
将植物乳杆菌PC28152按5×106CFU/mL接种于MRS液体培养基中， 37℃培养12h后，4000×g离心10min收集发酵上清液，经0.22μm滤膜过滤 后，制得无菌发酵上清液。
2、植物乳杆菌PC28152无菌发酵上清液抑菌活性的测定
按照10％(v/v)比例将植物乳杆菌PC28152无菌发酵上清液与灭菌后 PDA培养基充分混合倒入平皿。待冷却凝固后，于平皿中心点接5μL真菌 (黄曲霉CICC2219、产黄青霉BNCC185782、扩展青霉BNCC185786、串 珠镰刀菌CICC2490、芽枝状枝孢CICC2477)孢子悬液(105孢子/mL)，阳 性对照组PDA培养基不含无菌发酵上清液。25℃培养5～7d后，测定试验组 及对照组真菌菌落直径，计算菌丝抑制率，试验重复进行3组。结果见表2。
Figure BDA0002691746810000071
由表2试验结果显示，本发明分离的植物乳杆菌PC28152无菌发酵上清液 对5种食品腐败真菌(黄曲霉CICC2219、产黄青霉BNCC185782、扩展青霉 BNCC185786、串珠镰刀菌CICC2490、芽枝状枝孢CICC2477)具有较强的 抑菌活性，表明分离的该菌株具有明显的广谱抗真菌活性。
表2植物乳杆菌PC28152无菌上清液抑菌活性
Figure BDA0002691746810000072
实施例3植物乳杆菌PC28152在防治食品腐败中的应用
植物乳杆菌PC28152活菌发酵液的制备：将植物乳杆菌PC28152按 5×106CFU/mL接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h后，获得植 物乳杆菌PC28152活菌发酵液。
选用市售切片面包，将0.5ml黄曲霉CICC2219孢子悬液(106CFU/mL) 和1ml植物乳杆菌PC28152活菌发酵液(108CFU/mL)的混合液、将0.5ml 黄曲霉CICC2219孢子悬液(106CFU/mL)和2ml植物乳杆菌PC28152活菌 发酵液(108CFU/mL)的混合液，分别均匀喷洒面包表面，阳性对照组为将 0.5ml黄曲霉CICC2219孢子悬液(106CFU/mL)均匀喷洒面包表面，观察 实验组和对照组面包腐败变质情况。结果见图4。
由图4试验结果显示，喷洒植物乳杆菌PC28152活菌发酵液能够有效抑 制黄曲霉CICC2219对面包产品的侵染，喷洒2mL植物乳杆菌PC28152活 菌发酵液后面包表面黄曲霉侵染区域较小、防腐效果最好，表明植物乳杆菌 PC28152活菌发酵菌液在食品应用方面具备较强的防腐能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌PC28152及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(上游引物 Artificial Sequence)
<400> 1
nnnagagttt gatcmtggct cag 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(下游引物 Artificial Sequence)
<400> 2
nnnaccttgt tacgactt 18
<210> 3
<211> 1477
<212> DNA
<213> 人工序列(16S rDNA Artificial Sequence)
<400> 3
cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60
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ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140
tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga 1260
gagtaagcta atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca 1320
tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagtcgg tggggtaacc 1440
ttttaggaac cagccgccta aggtgggaca gatgatt 1477

Claims (6)

1.一株具有广谱抑制真菌活性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152，其特征在于，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .20198。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152发酵得到的发酵液；所述发酵液的制备方法包括以下步骤：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152接种于MRS液体培养基中，35～40℃培养10～14h，得发酵液。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152发酵得到的发酵液上清液；所述发酵液上清液的制备方法包括以下步骤：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152接种于MRS液体培养基中，35~40℃培养10~14h，得发酵液；将所述发酵液离心，得到上清液；所述上清液再经滤膜过滤后得到发酵上清液。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152、权利要求2所述的发酵液或权利要求3所述的发酵上清液在制备抑制黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、串珠镰刀菌和芽枝状枝孢菌活性的药物中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152、权利要求2所述的发酵液或权利要求3所述的发酵上清液在食品保鲜和防腐中的应用。
6.一种保鲜剂和防腐剂，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）PC28152、权利要求2所述的发酵液或权利要求3所述的发酵上清液。
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