CN104877986A - 一株植物乳杆菌的筛选及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌的诱变选育方法及其菌株的应用，该植物乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No 5297。本发明的植物乳杆菌可以产生对多种革兰氏阳性菌有较好抑制作用的细菌素，尤其对单核细胞增多性李斯特菌有极强的抑制作用。并且该细菌素有较好的热稳定性及酸稳定性等优点，可以应用为具有广阔应用前景的食品添加剂及饲料防腐剂使用。

Description

一株植物乳杆菌的筛选及其应用

技术领域

本发明涉及一株植物乳杆菌及其应用。

背景技术

食品安全问题是世界范围内的重要课题，在我国这样的发展中国家问题尤为突出，近年来食源性疾病患者的数目一直居高不下，由微生物引起的食物中毒情况非常严重。添加化学防腐剂是人类使用的重要食品保藏方法，但经长期研究发现过量食用合成的防腐剂对血压，心脏，肾脏等有不良影响，甚至有些化学防腐剂有致癌性，致畸性和易引起食物中毒等问题。热杀菌也是食品加过程中杀灭微生物的重要方法，但对某些低温制品，加热温度过高，其色泽，风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低。其它物理方法：如紫外消毒，过滤除菌，钴60照射法等，对人体无毒害作用，但当包装打开后，又有再次感染腐败菌的可能。因此，开发出高效，稳定，安全的天然食品防腐剂市食品工业发展的必然趋势。

单核细胞增生李斯特菌是致病微生物，是人类和动物的严重疾病根源，尤其易于通过污染食品进行传播，更具体的说是通过肉类，肉质品，海产品，奶类及由其衍生的产品。单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

乳酸菌细菌素（bacteriocins of LAB）是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白类物质。它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病菌，如金黄色葡萄球菌，藤黄微球菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞增生李斯特菌等。而且大部分乳酸菌细菌素稳定性较好，可与食品一起加热使用，而且易于被人体中的蛋白酶降解，不会在体内积聚引起不良反应，被认为是具有广阔前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的是提供一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用，该菌株生产的细菌素可以抑制多种与其近缘的G⁺菌株，并对单核细胞增多性李斯特菌有强烈的抑制性。

本发明提供的植物乳杆菌为植物乳杆菌（lactobacillus plantarum），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No 5297。

上述植物乳杆菌是以一些最常见的腐败菌和病原菌为指示菌，筛选出产对单核细胞增多性李斯特菌有强烈抑制性的植物乳杆菌菌株，并且通过诱变手段提高其发酵液中的细菌素活力。已于2011年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No 5297。

本发明提供的应用，即植物乳杆菌CGMCC No 5297在抑制李斯特氏菌，尤其是单核细胞增多性李斯特菌中的应用，以及植物乳杆菌CGMCC No 5297在生产细菌素中的应用，同时还有所产细菌素在食品及饲料防腐中的应用。

上述单核细胞增多性李斯特菌优选为单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595。

本发明的植物乳杆菌（lactobacillus plantarun）可以产生对多种近源菌有抑制作用的细菌素，并且对李氏杆菌有强烈的抑制性。该细菌素对蛋白酶敏感，具有很好的热稳定性，在121℃作用30min，仍然保持较高的活性。该细菌素在pH2.0-8.0范围处理30min，回调到pH5.0后，均保持很强的抑制指示菌单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595的能力。可以应用为具有广阔前景的天然食品防腐剂及饲料添加剂。

附图说明

 图1是野生菌Yal-1的EMS致死曲线。

     图2是筛选菌株CGMCC No 5297的生长曲线。

     图3是筛选菌株CGMCC No 5297生长过程中的pH变化曲线。

     图4是筛选菌株CGMCC No 5297生长过程中抑菌活性的变化曲线。

     图5是利福平标准效价曲线。

     图6是添加不同浓度植物乳杆菌CGMCC No 5297无菌上清的单核细胞增多性李斯特菌的OD₆₂₀变化曲线。

     图7是经植物乳杆菌CGMCC No 5297代谢产物粗品处理的酸奶细菌总数的变化。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1：植物乳杆菌的获得。

一：植物乳杆菌野生菌的获得。

菌种来源：分离自自制酸奶。在无菌条件下，取酸奶5mL，加入到45mL 无菌蒸熘水中，充分震荡5min ，以10 倍系列稀释，从10^-1 ~ 10^-7 梯度，选合适的梯度，取100u L 分别涂布于含有CaCO₃的MRS（蛋白胨10g ，酵母膏5g ，牛肉膏10g ，葡萄糖20g ，磷酸氢二钾2g ，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g ，硫酸镁0.58g ，硫酸锰0.25g ，吐温80 1mL，琼脂15g ，蒸馏水1L，pH6.50）培养基上，30 ℃ 静置培养并计数。选取具有明显溶钙圈的单菌落，进行革兰氏染色试验，镜检。挑选革兰氏阳性菌进行划线分离纯化2～3次，将分离纯化后的单菌落再一次进行镜检，转移到MRS斜面培养基上，并于4℃保存，待鉴定。

将保存的乳酸菌用接种环接种在MRS液体培养基中，30℃静置培养48 h后，利用点种法，点种5ul，对各种G-，G+病原菌做抑菌试验，并选取抑菌圈比较明显的乳酸菌株进行复筛试验。

初筛后具有抑菌效果的菌株培养于MRS液体培养基中，24 h后离心收取上清，将上清用过氧化氢酶处理后调节PH值为6.0，过滤除菌。利用牛津杯双层琼脂扩散法，对指示菌进行抑菌试验。含1. 5% 琼脂的LB培养基（蛋白陈10g ，酵母提取物5g ，氯化纳10g ，蒸馏水1. 0 L，pH7.0）按每平皿10mL 倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却，然后用无菌摄子将牛津杯轻轻放置于培养基上;制备含0.8% 琼脂的LB培养基，冷却至50 ℃ 左右，按1% 的接种量加入单核细胞增生李斯特菌菌悬液作为上层培养基，倾倒15mL 上层培养基于放置好牛津杯的的平板中冷却，冷却后将牛津杯取出，将上清液加入小孔中于4℃冰箱中扩散， 30℃过夜培养。用游标卡尺比较抑菌圈大小。获得一株对单核细胞增生李斯特菌有强烈抑制的乳酸菌，命名为Yal-1。

二、植物乳杆菌CLactobacillus plantarum)Yal-1的鉴定。

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，并对菌株Yal-1进行16sRNA测序。其中菌株生理生化实验结果如表1 所示，碳源发酵试验结果如表2 所示，结合生理生化及碳源发酵实验结果，并将16S信息进行比对，菌株Yal-1应为植物乳杆菌。

根据细胞显微形态、生理生化数据和16S rRNA 基因序列数据，将菌株鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 。

表1：植物乳杆菌Yal-1的理化试验结果。

精氨酸产氨 -

石蕊牛奶     +

硫化氢实验 -

淀粉水解     -

七叶苷水解 +

精氨酸水解 -

葡萄糖产气 -

葡聚糖  -

V-P实验      +

明胶液化     -

过氧化氢酶 -

 注：“-”代表阴性，“+”代表阳性。

表2：植物乳杆菌Yal-1糖发酵实验结果。

阿拉伯糖     w

木糖      -

半乳糖  +

麦芽糖  +

甘露糖  +

棉子糖  +

可溶性淀粉 +

蔗糖      +

注：“-”代表不发酵，“+”代表发酵,“w”代表略微发酵。

三、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Yal-1诱变筛选获得高产菌株。

    1 甲基磺酸乙酯（EMS）诱变适宜菌液浓度的选择及致死曲线的绘制。

    将处于对数生长期的植物乳杆菌Yal-1悬液进行10倍梯度稀释，分别制成10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴cfu/ml的菌悬液；各浓度的菌液中加入EMS溶液，使EMS的终浓度分别为0.25％,0.5％,0.75％,1％；37℃水浴处理30min。间歇振荡；到达预定时间后，加入等体积的2％的NaS₂O₃中和EMS。进行10倍梯度稀释，10⁴,10⁵,10⁶稀释梯度各取100ul涂布MRS培养基的平皿上，(每个梯度平行5个)，30℃培养48h，计算个浓度的菌落数及适宜菌液浓度的致死率。致死曲线如图1所示，结果表明，以10⁶-10⁷cfu/ml的菌悬液，加入0.5％-0.75％的EMS诱变效果为佳。

2甲基磺酸乙酯诱变获得高产菌。

将植物乳杆菌Yal-1接于MRS于30℃培养16h，调单细胞菌悬液浓度为10⁶cfu/ml，取10mL菌液加入EMS，使EMS终浓度为0.5％，37℃水浴处理30min，间歇震荡；到达预定时间后，加入等体积的2％的NaS₂O₃中和EMS。进行10倍梯度稀释，取 10⁵稀释梯度涂布100ul于MRS培养基的平皿上，共涂平皿50个。30℃培养48小时。

将诱变后的植物乳杆菌用接种环接于液体MRS中，30℃培养24小时。以单核细胞增生李斯特菌为指示菌，菌浓为10⁷cfu/ml接于琼脂含量为0.8％的LB培养基中，分别以点种法初筛，牛津杯法复筛。获得一株抑菌圈明显增大的诱变菌株，将此菌株每隔十天传代一次，共传十代，分别比较每代菌株的上清液的抑菌活性，确定所获得菌株的稳定性，将此菌株命名为Yal-49。并于2011 年09 月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1 号院，中国科学院微生物研究所) ，保藏登记号为CGMCC No 5297。

四 植物乳杆菌CGMCC No 5297生长状况的确定。

1植物乳杆菌CGMCC No 5297生长曲线的测定。

接1%植物乳杆菌CGMCC No 5297的24小时培养物于新鲜MRS培养基中，30℃静置培养，每小时测量OD₆₂₀值变化。生长曲线如图2所示，植物乳杆菌CGMCC No 5297于第4小时开始进入对数期，第16小时起进入延滞期。

2 植物乳杆菌CGMCC No 5297生长中PH变化的确定。

接1%植物乳杆菌CGMCC No 5297的24小时培养物于新鲜MRS培养基中，30℃静置培养，每小时测量PH值变化。PH变化曲线如图3所示，随着培养时间的延长，培养基中PH值逐步下降，约在16,17小时后稳定，稳定PH值为3.8-4.0。

3植物乳杆菌CGMCC No 5297生长中抑菌活力变化的确定。

接1%植物乳杆菌CGMCC No 5297的24小时培养物于新鲜MRS培养基中，30℃静置培养，每小时取样测量OD₆₂₀值。并离心取上清，将上清调PH至6.0后各点100ul于含1%单核细胞增生李斯特菌的效价检测平板，于30℃过夜培养。用游标卡尺测量抑菌圈大小的变化。抑菌活性随OD₆₂₀的变化曲线如图4所示，从OD₆₂₀为0.276起有抑菌圈，为13.5mm,至OD₆₂₀为1.62后趋于稳定，最大为22mm。

实施例2 、植物乳杆菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297抑菌效果鉴定。

从实施例1 看出本发明的植物乳杆菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297对单核细胞增生李斯特菌有强烈的抑制作用，因此推测该菌株可以分泌细菌素，通过以下方法对植物乳杆菌CLactobacillusplantarum) CGMCC No 5297的抑菌效果和其分泌的细菌素进行鉴定。

一、排除因素干扰。

1 、排除酸的干扰。

 抑制病原菌的试验方法为牛津杯双层平板法:含1. 5% 琼脂的指示菌LB 培养基:蛋白陈10g ，酵母提取物5g ，氯化纳10g ，蒸馆水1. 0 L，pH7.0。按每平皿10mL 倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却。用无菌摄子将牛津杯轻轻放置于平板上。制备含0.8% 琼脂的指示菌培养基，冷却至50 ℃左右，按1 % 体积百分含量的接种量加入新鲜培养的菌浓度约为10 ⁷cfu/mL的单核细胞增生李斯特菌菌悬液混匀作为上层培养基，倾倒15mL 上层培养基于上述制备的放置牛津杯琼脂培养基的平板中冷却。

将植物乳杆菌CGMCC No 5297在MRS培养基中于30℃培养24h，取上清离心，用乳酸将发酵上清分别调至PH5.0，PH6.0，过滤除菌。将PH5.0，PH6.0的上清及发酵上清原液各加100uL于牛津杯小孔中。于4℃冰箱扩散12h，30℃静置培养，用游标卡尺比较抑菌圈大小。

结果如表3所示，表明植物乳杆菌Yal-49对单核细胞增生李斯特菌CVCC1595的抑制作用不受PH的影响。

表3. 排除酸抑制作用的试验结果。 

CGMCC No 5297	原液	PH5.0	PH6.0
				抑菌活力（抑菌圈单位mm，牛津杯直径7.8mm）	26．5	26	25.5

2 、过氧化氢作用的排除。

乳酸菌在代谢过程中可能产生过氧化氢抑制细菌的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。发酵上清液用过氧化氢酶处理，以未经过氧化氢酶处理的pH6. 0 的无细胞发酵上清液做对照，以单核细胞增生李斯特菌为指示菌进行抑菌试验，乳酸菌的发酵上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径和对照抑菌圈直径相比无明显变化，从而证明发酵液中主要抑菌物质是不是过氧化氢。

挑取MRS 培养基上培养24 小时的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297,接种于MRS 液体培养基中， 30℃ 静置培养24h ，离心获得发酵上清液。过氧化氢酶溶解在50mmo l/L 的磷酸缓冲液(pH 7.0) 中，按照过氧化氢酶终浓度为5.0mg/mL 加入到上述发酵上清液， 37℃ 水浴2h，检测过氧化氢酶处理后无细胞发酵上清液的抑菌活性，方法同步骤1 的牛津杯双层平板法。结果如表4所示，表明过氧化氢酶不影响该菌对单核细胞增生李斯特菌CVCC1595的抑制作用。

表4排除过氧化氢抑制作用的实验结果。 

CGMCC No 5297	原液	过氧化氢酶处理
			抑菌活力（抑菌圈单位mm，牛津杯直径7.8mm）	26	25

3 、蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质。

挑取MRS 培养基上培养24 小时的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297,接种于MRS 液体培养基中， 30℃ 静置培养24h ，离心获得发酵上清液。先用1mol/L NaOH( 己灭菌)和1mol/L HCI 分别调发酵上清液pH 值8. 0。按1. 0mg/mL 加入胰蛋白酶(SIGMA公司，货号:C9322)和蛋白酶K (MERCK 公司，货号:WL558668.609)，37 ℃ 水浴2h，再将pH调回对照pH值6.0 ，牛津杯法检测抑菌活性，并用pH6.0 无细胞发酵上清液作为对照，检测胰蛋白酶和蛋白酶K 对乳酸菌无细胞发酵上清液抑菌活性的影响。方法同步骤1 的牛津杯双层平板法。结果表明胰蛋白酶和蛋白酶K 作用后，该菌对单核细胞增生李斯特菌CVCC1595没有抑菌作用。 说明该菌抑制单核细胞增生李斯特菌CVCC1595的物质为可被胰蛋白酶和蛋白酶K 分解，是蛋白质类物质。

表5.蛋白酶作用后的抑菌活性。 

CGMCC No 5297	原液	胰蛋白酶作用	蛋白酶K作用
				抑菌活力（抑菌圈单位mm，牛津杯直径7.8mm）	26	-	-

注：“-”指抑菌圈直径小于8mm。

上述步骤1-3 的实验结果说明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297发酵液中主要抑菌物质不是过氧化氢，也不是因为酸的作用，还有另外的抑菌物质对指示菌起抑制作用。该抑菌物质可被胰蛋白酶和蛋白酶K酶解，说明它们是蛋白质类物质，是一种细菌素。

二、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297所产细菌素抑菌活力的确定。

1 利福平标准效价曲线的绘制。

以利福平为对照，制作利福平的标准曲线，植物乳杆菌CGMCC No 5297的抑菌效价以对单核细胞增生李斯特菌具有相同抑菌效果的利福平标准品的效价定义。效价检测平板中，分别加入2ug/ml, 3ug/ml, 4ug/ml, 5ug/ml, 6ug/ml, 7ug/ml, 8ug/ml, 9ug/ml, 10ug/ml的利福平(GENE公司，货号: 19-1059) 标准品，以单核细胞增生李斯特菌CVCC1595为指示菌，菌浓为10⁷cfu/ml接于琼脂含量为0.8％的LB培养基中。每牛津杯中加100ul，4℃扩散24h，30℃避光培养培养24h ，以加入利福平微克数对数值为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标，添加直线渐近线，获得效价测定标准方程。

由图5可见，利福平在1-7ug/ml范围内，抑菌圈直径与利福平克数的对数值呈良好的线性关系。回归方程为y=24.21x+4.684，其中y为利福平对数值，x为抑菌圈直径（mm），线性相关系数为0.996。

2 植物乳杆菌Yal-49的抑制单核细胞增生李斯特菌效价的确定。

挑取MRS 培养基上培养24 小时的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297，接种于MRS 液体培养基中，30 ℃静置培养24h ，离心取上清。依次2倍稀释，至2⁸倍。调节pH 值为6.0 ，过滤除菌。单核细胞增生李斯特菌接种量为10⁷cfu/ml，制作效价检测平板。每牛津杯加100ul，每稀释度3个重复，4℃扩散24h以保证细菌素完全扩散，30℃避光培养培养24h。用游标卡尺准确测量抑菌圈大小。对应标准曲线计算出植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297产细菌素的相对效价。结果如表6 所示，结果表明，经过EMS诱变后的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) CGMCC No 5297对单核细胞增生李斯特菌的抑菌活性大大增强。

表6 诱变前后植物乳杆菌对单核细胞增生李斯特菌的相对效价。 

	Yal-1	CGMCC No 5297
			相对利福平效价	458 ug/ml	682 ug/ml

 三、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297分泌的细菌素生物学特性的研究。

1 、细菌素对热的稳定性。

挑取活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297单菌落接种于MRS液体培养基中， 30℃ 静置培养24h，发酵液以12000rpm ， 4℃离心15min ，收集上清液，过滤除去菌体及其它杂质。获得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297的无细胞发酵上清液。将上清液分别放置在60℃ 、80℃、100℃和121℃处理15min 和30min ，调节PH值6.0。按照步骤一所述的牛津杯双层平板法，在30 ℃条件下做抑菌试验，确定不同温度处理后对细菌素抑制单核细胞增生李斯特菌CVCC1595活性的影响。结果如表7所示，结果表明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297对121℃以下的温度稳定。

表7. 温度对细菌素活性的影响。 

加热处理	抑菌圈直径（mm）（牛津杯外径7.8mm）	抑菌圈直径（mm）（牛津杯外径7.8mm）
			60℃	15min	24.5
60℃	30min	24.5
			80℃	15min	23.5
80℃	30min	24
			100℃	15min	23
100℃	30min	23
			121℃	15min	22.5
121℃	30min	22

2 、植物乳杆菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297分泌的细菌素对酸的稳定性。

将植物乳杆菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297无细胞发酵上清液(按照步骤1 的方法获得)分别用lmo l/L HCL 和lmo l/L NaOH 调其pH 值为2. 0-10.0, 37℃下温育2h，调pH 值为6.0 ，然后按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做抑菌试验测对单核细胞增生李斯特菌CVCC1595的抑菌活性。同等条件下，分别用lmo l/LHCL 和lmol/LNaOH 调整灭过菌的液体MRS 培养基pH 值为2. 0-10. 0 , 37℃下温育2h，调整pH值为6.0，同样按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做对照。结果如表8可见，植物乳杆菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297分泌的细菌素在PH2.0-10.0范围内较为稳定。

表8. 植物乳轩菌CLactobacillus plantarum) CGMCC No 5297细菌素对酸的稳定'性。 

PH值	抑菌圈直径（mm）（牛津杯外径7.8mm）
		2	26
3	25
		4	25
5	25
		6	24.5
7	24
		8	23
9	22
		10	20

实施例3 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297对单核细胞增多性李斯特菌的抑制。

一  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297所产细菌素对单核细胞增多性李斯特菌生长曲线的影响。

用接种环挑取单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595单菌落于5mlLB培养基中，37℃过夜培养。按1%接种量接于新鲜LB培养基中,37℃培养至平台期。用新鲜LB稀释至菌数约为10⁶cfu。然后每试管分装2.75ml，分为4组。1组添加250ulMRS培养基为对照。2组添加250ul CGMCC5297无菌上清，3组添加125ul CGMCC5297无菌上清+125ul MRS培养基,4组添加62.5ul CGMCC5297无菌上清+187.5ul MRS培养基。上述CGMCC5297无菌上清调节PH为6.0。将4组试管一起至于30℃静置培养，每小时取一管测OD₆₂₀变化，连续测5小时。测量结果如图6可见，含有细菌素的培养上清对单核细胞增多性李斯特菌有明显的抑制作用，其中添加250ul抑菌上清的实验组在5小时内李氏杆菌基本没有生长现象。

二  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297所产细菌素对酸奶保鲜效果的研究。

将培养16-20h的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC No 5297培养物离心取上清，调节PH为6.0。在自制酸奶中接种活化培养好的李氏杆菌至菌数约为10⁶CFU， 每试管中分装2.75ml。各加入250ul无菌上清或250ul MRS培养基为对照。每管重复3次，于4℃培养。每天取出3管进行计数，将酸奶稀释10³,10⁴,10⁵倍，每稀释梯度涂5个LB平板。计数结果如图7所示，可见在酸奶中添加细菌素培养上清可以显著抑制酸奶中李氏杆菌的生长。

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌的诱变方法，其特征在于，将植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）制成菌悬液后加EMS孵育，然后涂布于MRS平板上，筛选即可得到突变株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，初始乳酸菌OD620为1.0-2.0，稀释至菌悬液浓度为106-107cfu/m，EMS浓度为0.5％-0.75％，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。

3.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC5297。

4.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）CGMCC5297在抑制单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes）中的应用。

5.根据权利要求书4中的应用，其特征在于：所述细菌为单核细胞增生李斯特菌CVCC 1595。

6.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）CGMCC5297在生产细菌素中的应用。

7.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）CGMCC5297在制备食品和饲料防腐剂中的应用。

8.植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）CGMCC5297在制备细菌抑制剂中的应用。