CN103013861A - 枯草芽孢杆菌hjda32菌株及其所产细菌素的制备方法 - Google Patents

Abstract

一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HJDA32菌株于2012年9月25日保藏，保藏号为CGMCCNo.6624，该菌株从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离得到。在牛肉膏蛋白胨基础培养基培养，菌株呈杆状、单个、成对或成链排列，大小为0.6～0.85μm×1.5～3.5μm，有荚膜；在生芽孢培养基上培养产生椭圆形芽孢。经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化等生理生化鉴定和16SrDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。用枯草芽孢杆菌HJDA32菌株为生产菌株，用发酵用培养液培养，然后离心、硫酸铵粉盐析、再离心得到细菌素。该细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。本发明可用于食品防腐剂。

Description

枯草芽孢杆菌HJDA32菌株及其所产细菌素的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是涉及一种枯草芽孢杆菌新菌株及其所产生的可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌细菌素的制备方法。

背景技术

食品安全问题是世界范围内的重要课题。目前解决食品安全的主要方法之一是添加化学防腐剂，但长期的研究发现过量食用防腐剂对血压、心脏、肾脏等有不良影响，甚至有些化学防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。热杀菌也是食品加工过程中杀灭微生物的重要方法之一，但对某些低温制品，如低温肉制品，加热温度过高，其色泽、风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低。其他物理方法：如紫外消毒、过滤除菌、钴60 照射法等，对人体无毒害作用，但当包装打开以后，又有再次染菌而腐败的可能。因此，开发广谱、高效、稳定、安全的天然食品防腐剂是食品工业发展的必然趋势。

细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体合成的具有抑菌生物活性的蛋白或肽类。这些物质在达到一定数量时可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物；一般产生细菌素的细菌都存在特异性免疫基因，所产细菌素不会对产生菌本身造成伤害。细菌素与临床抗生素在生物合成、作用机制、抑菌谱等方面明显不同，细菌素可以安全、有效地使用以达到控制目标病原微生物生长的目的。由于细菌素具有高效抑菌活性，能被人体降解，不产生耐药性等优点而倍受人们的关注，在食品中有很大的应用潜力。

开发新型食品安全的细菌素时首先要考虑的一个十分重要的前提条件是生产菌应具有很好的食品安全性。山西老陈醋的生产至今已有300余年的历史，仍然采用传统的固态自然接种发酵工艺，醋醅中栖息着丰富的微生物资源。从山西老陈醋醋醅中分离筛选产生细菌素的菌株具有很好的食品安全性，可用于开发生产食品防腐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌新菌株及其所产细菌素的制备方法，枯草芽孢杆菌新菌株及其所产细菌素具有抑菌谱广、抑菌活性高, 可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株，于2012 年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6624 ，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株是从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离筛选得到。在牛肉膏蛋白胨基础培养基（牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，pH7.2-7.4）上37℃培养48h，呈杆状、单个、成对或成链排列（见图1），大小为0.6～0.85μm×1.5～3.5μm，有荚膜（见图2），运动性较弱；幼龄菌培养2-18h，革兰氏染色呈阴性反应；培养19-23h，革兰氏染色呈阴阳性反应；培养24h，革兰氏染色呈阳性反应，菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，光滑，半透明，无色素产生，粘稠，湿润（见图3）；在生芽孢培养基（酵母浸膏0.7g，蛋白胨0.1g，葡萄糖0.1g，(NH₄)₂SO₄  0.02g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，K₂HPO₄  0.1g，蒸馏水100mL，pH 7.2-7.4）上30℃培养72h产生芽孢，芽孢呈椭圆形（见图4）；在种子培养及发酵用培养液中培养48h，发酵液清亮、液面有白色膜；经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化、葡萄糖产酸产气、初始生长pH检测、最适生长温度测定、柠檬酸盐利用、吲哚试验、水溶性色素试验、5%NaCl、7%NaCl试验、溶菌酶试验、M.R、V.P、硝酸盐还原等生理生化鉴定（见表1）和16S rDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1  枯草芽孢杆菌HJD A32的生理生化特性

特性	HJD.A32菌株	特性	HJD.A32菌株
				接触酶	＋	pH 4.0-8.5	＋
需氧性	＋	pH 9.0	－
				硝酸盐还原	＋	5℃	－
葡萄糖发酵	＋发酵型，不产气	20-45℃	＋
				木糖发酵	＋	50℃	－
乳糖发酵	＋	水溶性色素试验	－
				甘露醇发酵	＋	5%NaCl	＋
D-麦芽糖发酵	＋	7%NaCl	－
				半乳糖发酵	＋	0.001%溶菌酶	－
蔗糖发酵	－	V．P	＋
				酪蛋白水解	＋	淀粉水解	＋
乙醇氧化	－	M．R	－
				乙酸氧化	－	柠檬酸盐生长	－
明胶水解	＋	石蕊牛奶	＋ (产酸、胨化)
				吲哚试验	－	卵磷脂酶	＋
苯丙氨酸脱氨酶	－

注：“ － ”表示阴性；“ + ”表示阳性

枯草芽孢杆菌HJD A32菌株所产细菌素的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备发酵液  将枯草芽孢杆菌HJD A32菌株接种到发酵用培养液中，在36-38℃条件下，培养46-48h，得到发酵液。

（2）制备细菌素  将（1）制备的发酵液经10000 r/ m离心15 min后取上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4-5℃条件下静置12 h，再在4-5℃条件下、12000 r/ m 、离心30 min，弃去上清液得到细菌素。

所述的发酵用培养液是由下列质量/体积份的原料组成：葡萄糖1份，酵母浸膏1份，蒸馏水100份，培养液的pH值为7.2-7.4。

本发明所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素通过牛津杯法试验,即将10mL指示菌培养基（LB培养基：胰蛋白胨1g，酵母浸膏1g，NaCl 1g，1mol/L NaOH 0.5mL，琼脂1.5g，蒸馏水100 mL）平铺于直径90mm，深20mm的培养皿中，置于水平台面上静置凝固，取稀释至约10⁸cfu/mL的新鲜培养的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）100μl与融化并温热的指示菌培养基10mL混匀，倾倒于平板中，将培养皿盖打开使无菌空气流通约40min，以利于培养皿中水蒸气的扩散，将内径6mm、外径8mm、高10mm的不锈钢牛津杯用镊子轻轻放置于平板上，将200μl枯草芽孢杆菌HJD.A32菌株发酵液上清液加入牛津杯后，在4-5℃条件下扩散12h，然后30℃培养48h观察抑菌圈的出现。试验结果表明，该细菌素具有较高的抑菌活力，活力单位数为256AU/mL，且抑菌谱广，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，可抑制的革兰氏阳性菌株包括：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；可抑制的革兰氏阴性菌株包括：大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、福氏志贺氏菌（Salmonella Shigella flexneri）。试验结果详见表2。

表2  枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产细菌素的抑菌谱（牛津杯法）

指示菌	来源	培养条件	抑菌圈（mm）
				凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）	CICC10144	LB,37℃,48h	12.47±0.15
大肠杆菌（Escherichia coli）	CMCC44102	LB,37℃,48h	18.15±1.75
				蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）	CMCC63501	LB,37℃,48h	0
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）	CMCC26003	LB,37℃,48h	20.94±0.14
				葡萄球菌（Staphylococcus）	This lab	LB,37℃,48h	21.52±1.12
大肠杆菌（Escherichia coli）	CMCC0216	LB,37℃,48h	10.90±0.10
				大肠杆菌（Escherichia coli）	CMCC1515	LB,37℃,48h	24.10±0.12
大肠杆菌BL20（Escherichia coli BL20）	Solarbio	LB,37℃,48h	16.60±0.14
				肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）	CMCC50041	LB,37℃,48h	0
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）	This lab	LB,37℃,48h	13.58±0.15
				沙门氏菌（Salmonella）	CMCC50115	LB,37℃,48h	14.80±0.18
李斯特菌（Listeria monocytogenes）	CMCC54001	LB,37℃,48h	10.40±0.16
				福氏志贺氏菌（Salmonella Shigella flexneri）	CMCC51571	LB,37℃,48h	13.31±0.10

用本发明的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为处理，以乳酸溶液和乙酸溶液为对照，进行酸抑制排除试验，试验方法是：测定培养48h的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液的pH值，然后向两个小烧杯中加入适量蒸馏水，用36%乳酸和80%乙酸分别调节蒸馏水的pH值，使其pH值与枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液的pH值相同，备用；分别取200μL配置好的乳酸溶液、乙酸溶液置于牛津杯中做抑菌实验；取200uL枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液做对照；指示菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），每个处理重复3次。试验结果见图5，图中a为乳酸溶液； b为乙酸溶液；c为HJD A32菌株发酵液上清液，结果表明该菌株发酵液上清液的抑菌活性不是来自于乳酸和乙酸，而是来自于有机酸以外的抑菌物质。

用本发明的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为处理，以经过氧化氢酶处理过的HJD A32菌株发酵液上清液和发酵用培养液为对照，进行过氧化氢排除试验，试验方法是：将过氧化氢酶溶解在枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液中，使过氧化氢酶终浓度达到5μg/mL，37℃，温浴2h，取200μL做牛津杯抑菌试验，分别以发酵用培养液和未经过氧化氢酶处理的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为对照，每个处理3个重复。试验结果见图6，图中a为HJD A32菌株发酵液上清液；b为经过氧化氢酶处理过的HJD A32菌株发酵液上清液；c为菌株发酵用培养液，结果显示该菌株发酵液上清液经过氧化氢酶处理后仍然具有抑菌作用，表明枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液中存在过氧化氢以外的抑菌物质。

本发明菌株的发酵液上清液经过过氧化氢酶处理后，分别用胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsinase）、蛋白酶K（proteinase K）进行蛋白酶消化试验，试验方法是：将胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分别溶解在过氧化氢酶消化后的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液中，使酶终浓度为5mg/L ，37℃消化2h，取200μL做牛津杯抑菌试验；以蒸馏水稀释相同倍数后的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为对照，每个处理3个重复。试验结果见图7，图中a为胃蛋白酶；b为胰蛋白酶；c为蛋白酶K；d为未经过蛋白酶消化的HJD A32菌株发酵液上清液，结果显示该菌株发酵液上清液分别经过三酶处理后都可以使抑菌活性消失，表明该菌株产生的抑菌物质为蛋白类细菌素。

本发明的有益效果

本发明的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素对热具有很好的稳定性，经100℃、20min处理，抑菌活性不变； pH稳定性好，在pH3－8范围内，具有良好的抑菌活性。经胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶k处理，细菌素被降解，抑菌活性消失。该细菌素抑制枯草芽孢杆菌的活力单位数为256AU/mL。枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素抑菌谱广，可抑制多种食源性致病菌和引起食品腐败变质的细菌，包括革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等和革兰氏阴性菌：大肠杆菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌等。作为食品防腐剂具有良好的应用前景。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌HJD A32菌株的个体形态特征--呈杆状、单个、成对或成链排列。

图2是枯草芽孢杆菌HJD A32菌株的个体形态特征--有荚膜。

图3是枯草芽孢杆菌HJD A32菌落形态。

图4是枯草芽孢杆菌HJD A32菌株的个体形态特征--产生芽孢。

图5是枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素的有机酸抑制排除试验结果。

图6 枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素的过氧化氢的排除试验结果。

图7是枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素的蛋白酶消化试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32，已于2012 年9 月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( 简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏号为：CGMCC No.6624。

所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32从山西老陈醋发酵原料中分离得到。在牛肉膏蛋白胨基础培养基上37℃培养48h，呈杆状，单个、成对或成链排列（见图1），大小为0.6～0.85μm×1.5～3.5μm，有荚膜（见图2），运动性较弱；幼龄菌培养2-18h，革兰氏染色呈阴性反应；培养19-23h，革兰氏染色呈阴阳性反应；培养24h，革兰氏染色呈阳性反应；菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，光滑，半透明，无色素产生，粘稠，湿润（见图3）。在生芽孢培养基（酵母浸膏0.7g，蛋白胨0.1g，葡萄糖0.1g，(NH₄)₂SO₄  0.02g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，K₂HPO₄  0.1g，蒸馏水100mL，pH 7.2-7.4）上30℃培养72h产生芽孢（见图4），芽孢呈椭圆形。在种子培养及发酵用培养液中培养48h，发酵液清亮、液面有白色膜。经过生理生化鉴定包括：接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化、葡萄糖产酸产气、初始生长pH检测、最适生长温度测定、柠檬酸盐利用、吲哚试验、水溶性色素试验、5%NaCl、7%NaCl试验、溶菌酶试验、M.R、V.P、硝酸盐还原等试验和16S rDNA系统发育分析，确定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

实施例2

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32所产的可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的细菌素粗品的制备方法，首先用葡萄糖1份、酵母浸膏1份、蒸馏水100份发酵用培养液，培养液的pH值为7.2-7.4，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株接种至培养液，培养条件为36℃，48h，得到发酵液；然后将发酵液经10000 r/m离心15min后取上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4℃下静置12h，再在12000 r/m，5℃下离心30 min，弃去上清液得到细菌素沉淀粗品。

将制得的细菌素粗品沉淀溶于1/40 体积0.02mol/L 的乙酸钠缓冲液(pH6.5)，然后检测抑菌活性。抑菌活性分析方法：抑菌活性测定采用牛津杯法。将10mL牛肉膏蛋白胨基础培养基平铺于培养皿（直径90mm，深20mm）中，置于水平台面上静置凝固，取稀释至约10⁸cfu/mL的新鲜培养的指示菌-枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）100μl与融化并温热的牛肉膏蛋白胨基础培养基10mL混匀，倾倒于平板中。将培养皿盖打开使无菌空气流通约40min左右，以利于培养皿中水蒸气的扩散。将牛津杯(不锈钢管，内径6mm，外径8mm，高10mm)用镊子轻轻放置于平板上，将200μl枯草芽孢杆菌HJD.A32菌株发酵液上清液加入牛津杯后，在4-5℃条件下扩散12h，然后30℃培养48h观察抑菌圈的出现，用游标卡尺测量抑菌圈直径。检测结果如表2。试验结果表明，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32所产的细菌素抑菌谱广，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，且具有较高的抑菌活性，可抑制的革兰氏阳性菌株包括：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；可抑制的革兰氏阴性菌株包括：大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、福氏志贺氏菌（Salmonella Shigella flexneri）。

用葡萄糖1份、酵母浸膏1份、蒸馏水100份发酵用培养液，培养液的pH值为7.2-7.4，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株接种至培养液，发酵条件为发酵温度37℃，发酵时间48h。发酵液经10000 r/ m，4℃离心15 min后取上清液，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为指示菌，进行枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素的酸抑制排除试验、排除过氧化氢试验和蛋白酶消化试验。

（1）酸抑制排除试验方法：测定培养48h的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液的pH值。然后向两个小烧杯中加入适量蒸馏水，用36%乳酸和80%乙酸分别调节蒸馏水的pH值，使其pH值与枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液的pH值相同，备用。分别取200μL配置好的乳酸溶液、乙酸溶液置于牛津杯中做抑菌实验。取200uL枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液做对照。比较处理样品与对照样品的抑菌圈差异。每个处理3个重复。

（2）排除过氧化氢试验方法：将过氧化氢酶溶解在枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液中，使过氧化氢酶终浓度达到5μg/mL，37℃，温浴2h，取200μL做牛津杯抑菌试验。分别以发酵用培养液和未经过氧化氢酶处理的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为对照，比较处理样品与对照样品的抑菌圈差异。每个处理3个重复。

（3）蛋白酶消化试验方法：将胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K分别溶解在过氧化氢酶消化后的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液中，使酶终浓度为5mg/L ，37℃消化2h，取200μL做牛津杯抑菌试验。以蒸馏水稀释相同倍数后的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株发酵液上清液为对照，比较处理样品与对照样品的抑菌圈差异。每个处理3个重复。

试验结果表明：发酵上清液经酸抑制排除试验，表明该菌株发酵液上清液的抑菌活性不是来自于乳酸和乙酸；过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径缩小：处理前28.34mm，处理后13.58mm ；胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K作用后，均不能产生抑菌圈。表明发酵上清液经排除菌体细胞、酸和过氧化氢干扰因素，仍有抑菌活性，同时经胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后，均不能产生抑菌圈，从而判定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32产生的抑菌物质除过氧化氢以外为蛋白类细菌素。

Claims (8)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株，其特征是：已于2012 年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6624。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株，其特征是：所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株是从山西省清徐老陈醋醋厂新鲜醋醅中分离筛选得到，在牛肉膏蛋白胨基础培养基上、37℃条件下培养48h，呈杆状、单个、成对或成链排列，大小为0.6～0.85μm×1.5～3.5μm，有荚膜，运动性较弱；幼龄菌培养2-18h，革兰氏染色呈阴性反应；培养19-23h，革兰氏染色呈阴阳性反应；培养24h，革兰氏染色呈阳性反应，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、半透明、无色素产生、粘稠、湿润状；在生芽孢培养基上、30℃条件下培养72h产生芽孢，芽孢呈椭圆形；在种子培养及发酵用培养液中培养48h，发酵液清亮、液面有白色膜；经过接触酶、碳源利用试验、明胶水解、淀粉水解、乙醇氧化、乙酸氧化、葡萄糖产酸产气、初始生长pH检测、最适生长温度测定、柠檬酸盐利用、吲哚试验、水溶性色素试验、5%NaCl、7%NaCl试验、溶菌酶试验、M.R、V.P、硝酸盐还原等生理生化鉴定和16S rDNA系统发育分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株，其特征是：所述的牛肉膏蛋白胨基础培养基是由下列质量/体积份的成分组成：牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，NaCl 0.5份，琼脂1.5份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7.2-7.4。

4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HJD A32菌株，其特征是：所述的生芽孢培养基是由下列质量/体积份的成分组成：酵母浸膏0.7份，蛋白胨0.1份，葡萄糖0.1份，(NH₄)₂SO₄  0.02份，MgSO₄·7H₂O 0.02份，K₂HPO₄  0.1份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7.2-7.4。

5.枯草芽孢杆菌HJD A32菌株所产细菌素的制备方法，步骤如下：

（1）制备发酵液  将枯草芽孢杆菌HJD A32菌株接种到发酵用培养液中，在36-38℃条件下，培养46-48h，得到发酵液；

（2）制备细菌素  将（1）制备的发酵液经10000 r/ m离心15 min后取上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵固体粉末进行盐析，边加边搅拌，直至饱和度达80％，然后在4-5℃条件下静置12 h，再在4-5℃条件下、12000 r/ m 、离心30 min，弃去上清液得到细菌素。

6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的发酵用培养液是由下列质量/体积份的成分组成：葡萄糖1份，酵母浸膏1份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7.2-7.4。

7.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素通过牛津杯法试验,该细菌素的活力单位数为256AU/mL，可抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。

8.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株所产细菌素的制备方法，其特征是所述的枯草芽孢杆菌HJD A32菌株产生的细菌素是蛋白类抑菌物质。

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