CN102703345B - 一株抑制生物胺产生的棒状乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可抑制生物胺产生菌产生物胺的棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，保藏编号为CCTCC NO:M 2012130。这株棒状乳杆菌BBE-H3不产生物胺，并且可以抑制沙克乳杆菌（Lactobacillus sakeiDSM20100T）产生物胺。棒状乳杆菌BBE-H3所产细菌素具有较广的抑菌谱，其抑菌物质是耐高温且对蛋白酶敏感的小分子物质。
Description
技术领域
本发明涉及一株棒状乳杆菌，特别是一株非生物胺产生乳酸杆菌。
背景技术
生物胺（Biogenic amines，BA）是生物体内产生的一类低分子量含氮有机化合物的总称。它们是生物体合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体，因此生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力，加强肠道免疫系统、控制血压等生理功能。但是过量外源生物胺的摄入会导致生物体的不良反应，如高血压、头疼，腹部痉挛、腹泻和呕吐等。
乳酸杆菌是是一群存在于食物和宿主体内能发酵糖类产生乳酸的细菌，被广泛应用于多种产品的发酵生产中，如乳制品、发酵香肠、鱼露、酒精饮料等。在生产过程中，原料中的天然氨基酸或者原料中的蛋白类物质可以经由酶解产生的氨基酸在微生物的氨基酸脱羧酶作用下脱羧，生成相应的生物胺。具有氨基酸脱羧酶活性的微生物包括乳酸菌以及其它生产菌与外源菌株。因此，筛选不产生物胺的乳酸杆菌对于以乳酸杆菌为主要生产菌的食品的安全生产和消费者的健康有着重要的意义。
乳酸杆菌的抑菌作用主要是通过两个方面实现的。一方面，由乳酸杆菌产生的乳酸，可以抑制某些细菌的生长。另一方面，多数乳酸杆菌会产生细菌素或类细菌素，起到抑制其它细菌生长的作用。乳酸杆菌合成的细菌素主要作用于革兰氏阳性菌及与其亲缘性较近的菌株，对于革兰氏阴性菌和真菌有抑菌效果的报道较少。而在食品发酵生产过程中比较容易污染外界微生物，其中包括如大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。这些细菌不仅会导致发酵失败，还可能危害食用人群的健康。因此，筛选可以抑制这些革兰氏阴性菌生长的乳酸杆菌可保证发酵食品的品质和安全。
发明内容
本发明提供了一株抑制生物胺产生的棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，已于2012年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012130。
所述棒状乳杆菌分离自家庭自制泡菜，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入MRS培养基中，在37℃静置培养（5%CO2）24h，取500μL培养液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。
所述MRS培养基为培养乳酸杆菌专用，购于OXIOD公司。
生物胺检测培养基：酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，NaCl 0.25%，葡萄糖0.05%，Tween-80 0.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO4·H2O 0.005%，FeSO4 0.04%，柠檬酸三胺0.2%，CaCO3 0.01%，吡哆醛-5-磷酸0.005%，K2HPO4 0.2%，pH 5.3，溴甲酚紫0.006%，氨基酸1%。
所述棒状乳杆菌的培养条件为：将保藏的乳酸菌在MRS固体培养基上划线，于37℃静置（5%CO2）培养48h，挑取单菌落接入MRS液体培养基，37℃静置培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）后去上清，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。
向96孔板中加入200μL含不同氨基酸（色氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸）的生物胺检测培养基，分别单独接种10μL乳酸菌。再将棒状乳杆菌发酵液与生物胺检测培养基按1:9、1:19的比例混合加入空白的孔中，接种10μL沙克乳杆菌。37℃静置（5%CO2）培养48h后，观测到沙克乳杆菌产精胺，而加入少量棒状乳杆菌后沙克乳杆菌不产生物胺。因此，在棒状乳杆菌的发酵液的影响下沙克乳杆菌不产生物胺。
本发明还提供了应用棒状乳杆菌抑制产生物胺微生物生长的应用。
为解决上述技术问题，将平板上活化好的棒状乳杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃静置（5%CO2）培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）后取上清，经0.22μm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存。
用于抑菌检测的指示菌及其培养条件：
大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌：LB培养基，37℃摇瓶培养；
产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌：LB培养基，30℃摇瓶培养；
鼠伤寒沙门氏菌：BHI(Brain Heart Infusion，脑心浸液培养基)，37℃摇瓶培养；
空肠弯曲杆菌：BHI培养基液体培养，Meller-Hinton固体培养基，37℃静置（5%CO2）培养。
本发明提供的棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，可以抑制沙克乳杆菌产生物胺，并对一些革兰氏阴性致病菌属的细菌具有较强的抑制作用，可作为乳制品、发酵肉制品等产品的生产菌株。
具体实施方式
实施例1：棒状乳杆菌筛选方法
从家庭自制泡菜、发酵香肠、奶酪、天然发酵酸奶等发酵食品中取样加入到20mLMRS液体培养基中，37℃富集培养12h。用磷酸盐缓冲液（pH7.0）按梯度稀释培养液，涂布于添加0.5% CaCO3的MRS平板，37℃培养48h。挑选有溶钙圈、表面光滑或稍粗糙、不透明、乳白或灰白色的单菌落接种到MRS固体培养基上，划线分离作纯培养。48h后，对纯培养物进行革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性、无芽孢、杆状菌转移到MRS液体培养基中，培养约24h后保藏。
挑取-80℃保藏的菌株在MRS固体培养基上划线，于37℃培养48h后，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）后收集菌体，再用磷酸盐缓冲液悬浮菌体至菌浓107CFUmL-1。接种10μL菌液于含有200μL生物胺检测培养基的96孔板中，置于37℃培养箱中培养48h。通过培养液颜色变化情况，筛选到一株不产生物胺的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为棒状乳杆菌。
实施例2：棒状乳杆菌抑制沙克乳杆菌产生物胺
挑取-80℃甘油管保藏的棒状乳杆菌和实验室保藏的产生物胺的沙克乳杆菌在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h后，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）后收集菌体，上清液过滤，保藏于4℃冰箱，再用磷酸盐缓冲液悬浮菌体至菌浓107CFUmL-1。
向96孔板中加入200μL生物胺检测培养基，分别接种10μL的棒状乳杆菌和沙克乳杆菌菌液。再将棒状乳杆菌发酵上清液与生物胺检测培养基按1:9、1:19的比例混合加入96孔板，接种10μL沙克乳杆菌菌液。37℃静置培养48h，观察培养基颜色变化。
观测到接种了沙克乳杆菌的含精氨酸的生物胺检测培养基由初始的棕绿色变为紫色，而棒状乳杆菌发酵液与生物胺检测培养基混合培养的沙克乳杆菌则保持初始的棕色。因此，棒状乳杆菌的发酵液抑制了沙克乳杆菌产生物胺。
实施例3：棒状乳杆菌抑制沙克乳杆菌产生物胺机理
挑取平板上活化好的棒状乳杆菌单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）取上清，经0.22μm滤膜过滤后置于4℃冰箱保存。
双层琼脂挖井法：将素琼脂培养基倾倒在无菌培养皿中。将沙克乳杆菌培养24h后稀释到菌浓为107CFUmL-1，与软琼脂培养基（0.75-0.8%琼脂）混合（菌液：软琼脂培养基为1:100），混匀后倾倒在事先放置有牛津杯的倒好的2%琼脂培养基上。待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL棒状乳杆菌发酵上清液，在适宜温度下培养12-16h后测量抑菌圈直径。
棒状乳杆菌对沙克乳杆菌的抑菌作用较明显，因此棒状乳杆菌通过抑制沙克乳杆菌的生长阻止其产生生物胺。
实施例4：棒状乳杆菌的抑菌作用
挑取平板上活化好的棒状乳杆菌单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，离心15min（8000rpm，4℃）取上清，经0.22μm滤膜过滤后置于4℃冰箱保存。
将实验室保藏的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲杆菌过夜培养后，稀释到107CFUmL-1，与软琼脂培养基（0.75-0.8%琼脂）混合，使得菌液与软琼脂培养基比例为1:100，混匀后倾倒在事先放置有牛津杯的倒好的琼脂培养基上。待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL棒状乳杆菌发酵上清液，在适宜温度下培养12-16h，测量抑菌圈直径。
除对鼠伤寒沙门氏菌抑制作用较弱外，棒状乳杆菌对其余7株指示菌的抑制作用都比较强。
实施例5：棒状乳杆菌非抑菌活性物质的排除
培养24h的棒状乳杆菌发酵液（pH4.0）离心过滤后分别调节pH至4.5、5.0、5.5、6.0，并同发酵原液及与发酵液同pH的乳酸作为对照，以大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌作为指示菌进行抑菌实验。
向发酵上清液中加入过氧化氢酶处理3h后进行抑菌实验。
结果表明，棒状乳杆菌发酵上清液在pH4.0-4.5时具有较明显的抑菌作用，而pH高于4.5时，抑菌作用明显降低直至消失。而pH3.0的乳酸无抑菌作用，因此可排除发酵液中酸的影响。过氧化氢酶处理过的发酵液与发酵原液抑菌作用基本一致，排除发酵液中过氧化氢的作用。
实施例6：棒状乳杆菌抑菌物质研究
取培养24h的H3发酵液离心15min（8000rpm，4℃）后过滤除菌，在等体积的上清液中加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K，使酶浓度为1mg/mL，置于37℃处理3h后进行抑菌实验。将发酵上清液在70℃、100℃、121℃处理15min，检测抑菌效果。
实验结果表明，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理后发酵液的抑菌作用减低，胰蛋白酶处理后，发酵液的抑菌作用消失。70℃、100℃、121℃处理后的发酵上清液与发酵原液的抑菌效果一致。因此，棒状乳杆菌产生的抑菌物质是热稳定性蛋白类物质。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一株抑制生物胺产生的棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）BBE-H3，保藏编号为CCTCC NO:M2012130。
2.权利要求1所述棒状乳杆菌，其特征在于在生物胺检测培养基中不产组胺、酪胺、精胺、腐胺、尸胺。
3.一种权利要求1所述棒状乳杆菌的应用，其特征在于，将大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲杆菌过夜培养后，稀释到107CFUmL-1，与软琼脂培养基混合，使得菌液与软琼脂培养基比例为1:100，混匀后倾倒在事先放置有牛津杯的倒好的琼脂培养基上；待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL棒状乳杆菌发酵上清液，在适宜温度下培养12-16h，测量抑菌圈直径；所述软琼脂培养基含0.75-0.8%的琼脂。
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