CN102250806B - 从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 - Google Patents
从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102250806B CN102250806B CN 201110184137 CN201110184137A CN102250806B CN 102250806 B CN102250806 B CN 102250806B CN 201110184137 CN201110184137 CN 201110184137 CN 201110184137 A CN201110184137 A CN 201110184137A CN 102250806 B CN102250806 B CN 102250806B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacteriocin
- lactic acid
- screening
- acid bacteria
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 94
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 80
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 47
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 55
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 claims description 25
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 238000003453 ammonium sulfate precipitation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 5
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 5
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 claims description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 5
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 5
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 claims description 4
- 244000234609 Portulaca oleracea Species 0.000 claims description 4
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 235000017016 Setaria faberi Nutrition 0.000 claims description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 2
- YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N diammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- -1 papoid Proteins 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 abstract 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 3
- 239000002655 kraft paper Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 3
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 2
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028706 ribosome biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。本方法包括下述步骤：植物源材料的处理；乳酸菌的分离筛选；用菌株发酵上清液做抑菌试验的方法筛选产抑菌物质的乳酸菌菌株；通过用上清液的透析液做抑菌试验来排除小分子的干扰，筛选产细菌素的乳酸菌菌株，以及用硫酸铵沉淀后的蛋白粗提物做抑菌试验的方法和各种蛋白酶对粗提物的酶解实验的方法证明了利用该方法可以有效地筛选到产细菌素的乳酸菌菌株。本发明对产细菌素乳酸菌的分离纯化方法进行了改进，通过用截留分子量较小的透析袋透析处理发酵上清液，即可排除发酵上清液中的小分子抑菌物质对指示菌的抑制作用，同时又保证了细菌素的活力。本方法既减少了实验步骤，又提高了筛选效率。
Description
技术领域
本发明涉及从植物源材料中筛选获得产细菌素乳酸菌菌株的方法。
背景技术
细菌素是细菌通过核糖体合成的一类蛋白或多肽类物质，因其具有抑菌活性而受到广泛的关注。与化学类防腐剂和抗生素相比，细菌素作为一种蛋白类物质，抑菌活性强，稳定性好，可被酶解而不会残留于人体内，不易引起抗药性，具有较高的安全性，可广泛应用于食品天然防腐剂及医药领域。很多乳酸菌是细菌素的产生菌，其中由乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin，已被FAO批准用于食品生物保鲜中，但由于Nisin仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，抑菌谱较窄，并且在中性条件下溶解性差，稳定性较低，因而极大地限制了Nisin在食品防腐保鲜中的应用。因此，为开发新的具有优良性能的细菌素，筛选出产细菌素的乳酸菌是应用研究的第一环节。
目前，筛选产细菌素乳酸菌的方法主要包括以下几步：先筛选出产酸菌株，再通过将发酵上清液的pH调至5.5～6.0做抑菌实验以排除发酵液中酸对指示菌的抑制作用，再通过过氧化氢酶处理的上清液做抑菌实验来排除过氧化氢对指示菌的抑制作用。进一步通过酶解实验，确认筛选出的菌株可以产生蛋白质性质的抑菌物质-细菌素。但由于乳酸菌在发酵过程中除了可以产生各种有机酸和过氧化氢等抑菌物质外，还会产生如双乙酰等小分子抑菌物质，因此传统的常规方法不能够完全排除小分子的影响，而且实验结果的准确度不高，往往有一些假阳性的结果。此外，相当一部分细菌素属于酸依赖型细菌素，若将发酵上清液的pH调至5.5～6.0，这些酸依赖型的细菌素就会失去活性，从而无法筛选出这些产细菌素的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)植物源材料的处理
将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10～15天，得到富集液；
(2)乳酸菌的分离与纯化
A、在无菌条件下，吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释液；
B、取上述不同梯度的稀释液各0.05～0.2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面；
C、在25℃～35℃的无氧条件下，将上述平板静置培养1～5天；
D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25℃～35℃的无氧条件中培养1～5天；
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；
(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选
A、将步骤(2)得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25℃～35℃无氧条件下静置培养24～48h，得到菌株的发酵液；
B、在4℃条件下，分别将上述发酵液经7000～10000r/min离心10～25min，保留上清液；
C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；
(4)产细菌素乳酸菌的筛选
将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；
(5)产细菌素乳酸菌的验证
将(4)中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。
本发明中，所述的植物源材料为植物的茎、叶、根、果实或种子。
进一步的，所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。
本发明还可以通过以下技术措施得以进一步实现：
所述(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选，C步骤通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株的具体操作方法如下：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养5～10h，OD600为0.2～0.4；取指示菌菌液0.1～0.3mL，与5～8mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上；待所述混匀物凝固，放上牛沣杯，每个平板放置1～6个，并分别向牛沣杯中加入B步骤制备好的上清液0.1～0.2mL；将平板放于4℃冰箱中静置4～10h，然后在28～37℃培养6～12h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成，以得到产抑菌物质的菌株。
所述(4)产细菌素乳酸菌的验证，硫酸铵沉淀法具体操作如下：将(3)A步骤得到的产抑菌物质菌株的发酵上清液，以饱和度为80～100％硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜，在4℃下，7000～10000r/min离心40min得到沉淀；将所得沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将所得冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，以进一步通过酶解实验验证得到的抑菌物质为细菌素。
通过对制得的产细菌素乳酸菌发酵上清液的硫酸铵沉淀样品的酶解实验验证菌株所产抑菌物质蛋白质类物质，具体操作步骤如下：
A、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为20～100mg/mL，调pH值至各种蛋白酶的最适pH；
B、向上述溶液中分别加入各种对应的蛋白酶，终浓度为1.0～2.5mg/mL，对照组不加蛋白酶，37℃水浴1～3h；
C、然后将B步骤所得溶液的pH值调至4.0～5.0，通过牛沣杯扩散法测定有无抑菌圈；
经各种蛋白酶的作用后，所获样品在牛沣杯周围无抑菌圈，表明菌株所产抑菌物质是蛋白质，即为细菌素。
所述MRS培养基的组成：葡萄糖20.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，硫酸镁0.56g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵5.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.25g，吐温805.0mL，用三级水定容至1L，pH值为7.0。
所述的指示菌为各种革兰氏阳性菌或阴性菌。
优选的，所述的指示菌为绿脓杆菌、鸡白痢沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌。
所述的蛋白酶为蛋白酶E、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。
本发明对产细菌素乳酸菌的分离纯化方法进行了改进，通过用截留分子量较小(500～1000Da)的透析袋透析处理发酵上清液，即可排除发酵上清液中的小分子抑菌物质对指示菌的抑制作用，同时又保证了细菌素的活力。本方法既减少了实验步骤，又提高了筛选效率。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1：
(1)植物源材料的处理
将马齿苋的叶和茎剪成小块，装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封，25℃中富集15天，得到富集液；
(2)乳酸菌的分离与纯化
A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释液；
B、取上述不同梯度的稀释液0.1mL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均匀涂布于平板表面；
C、在28℃的无氧条件下，将上述平板培养48h；
D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于28℃的无氧条件下培养48h；
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；
(3)产抑菌物质乳酸菌的筛选
A、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在28℃无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；
B、在4℃下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；
C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养6h，OD600为0.2。取菌液0.2mL，与6mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0.2mL。将平板放于4℃冰箱中静置5h，然后在37℃培养6h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；
上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。
(4)产细菌素乳酸菌的筛选
排除有机酸、过氧化氢、双乙酰等小分子的抑菌作用：将上述菌株的上清液用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子的抑菌作用。
(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素
A、硫酸铵沉淀法：将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80％进行硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜。然后在4℃下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；
B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH值至各种酶的最适pH；
C、分别加入酶，终浓度为2.5mg/mL，对照组不加酶，37℃水浴2h；
D、将溶液的pH值调至4.2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈有无；
以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。
经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。
(6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从马齿苋叶和茎中分离筛选出2株产细菌素的植物乳杆菌菌株。
实施例2：
(1)植物源材料的处理
将大白菜叶剪成小块，装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封，25℃中富集15天，得到富集液；
(2)乳酸菌的分离与纯化
A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释液；
B、取上述不同梯度的稀释液0.1mL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均匀涂布于平板表面；
C、在28℃的无氧条件下，将上述平板培养48h；
D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于28℃的无氧条件中培养48h；
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；
(3)产抑菌物质乳酸菌的筛选
A、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在28℃无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；
B、在4℃下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；
C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养6h，OD6000.2。取菌液0.2mL，与6mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0.2mL。将平板放于4℃冰箱中静置5h，然后在37℃培养6h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；
上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。
(4)产细菌素乳酸菌的筛选
排除有机酸、过氧化氢、双乙酰等小分子的抑菌作用：将上述菌株的上清液用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子的抑菌作用；
(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素
A、硫酸铵沉淀法：将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80％进行硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜。然后在4℃下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；
B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH值至各种酶的最适pH；
C、分别加入酶，终浓度为2.5mg/mL，对照组不加酶，37℃水浴2h；
D、将溶液的pH值调至4.2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈的大小；
以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。
经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。
(6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从大白菜叶中分离筛选出1株产细菌素的亚利桑纳乳杆菌菌株。
实施例3：
(1)植物源材料的处理
将小米装入试管，加入少量无菌水，压实，用塑料袋与牛皮纸密封，25℃中富集15天，得到富集液；
(2)乳酸菌的分离与纯化
A、在无菌条件下，用取样器从试管底部吸取0.1mL菌悬液，进行梯度稀释，得到10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释液；
B、取上述不同梯度的稀释液0.1mL，分别加入到MRS固体平板上，用三角刮铲将菌悬液均匀涂布于平板表面；
C、在28℃的无氧条件下，将上述制备好的平板置于培养48h；
D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于28℃的无氧条件中培养48h；
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化，得到40株以上纯的乳酸菌菌株；
(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选
A、将上述菌株分别接入MRS液体培养基中，在28℃无氧条件下静置培养48h，得到菌株的发酵液；
B、在4℃下，分别将上述发酵液经9000r/min离心15min，保留上清液；
C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养6h，OD600为0.2。取菌液0.2mL，与6mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上。待其凝固，放上牛沣杯，每板可放6个，分别向牛沣杯中加入上述制备好的上清液0.2mL。将平板放于4℃冰箱中静置5h，然37℃培养6h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成；
上述C步骤中的指示菌，可为各种革兰氏阳性细菌和阴性细菌如鸡白痢沙门氏菌或绿脓杆菌或李斯特菌或变形杆菌或大肠杆菌。
(4)产细菌素乳酸菌的筛选
将上述菌株的上清液用截留分子量为500Da的透析袋透析12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否产生抑菌圈。若有抑菌圈形成，可排除小分子如有机酸、过氧化氢、双乙酰的抑菌作用。
(5)用酶解实验验证菌株所产抑菌物质为细菌素
A、硫酸铵沉淀法：将上述菌株的发酵上清液，按饱和浓度为80％进行硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜。然后在4℃下，9000r/min离心40min。将沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500D的透析袋透析12h，冷冻干燥制成冻干粉。将冻干粉溶解在二级水中，浓度为50mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，从而筛选出产细菌素的菌株；
B、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为100mg/mL，调pH值至各种酶的最适pH；
C、分别加入酶，终浓度为2.5mg/mL，对照组不加酶，37℃水浴2h；
D、将溶液的pH值调至4.2，通过牛沣杯双层平板扩散法测定抑菌圈的大小；
以上C步骤中的酶，可为蛋白酶E或蛋白酶K或木瓜蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或任何一种蛋白酶。
经各种蛋白酶作用后，所获样品在牛沣杯周围不产生抑菌圈，说明该菌株所产抑菌物质是细菌素。
(6)通过菌种的形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，依据《伯杰氏细菌分类手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，对所获菌株进行鉴定。鉴定结果表明从小米中分离筛选出1株产细菌素的植物乳杆菌菌株。
Claims (9)
1.一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）植物源材料的处理
将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10～15天，得到富集液；
（2）乳酸菌的分离与纯化
A、在无菌条件下，吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10-4、10-5、10-6、10-7的梯度稀释液；
B、取上述不同梯度的稀释液各0.05～0.2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面；
C、在25℃～35℃的无氧条件下，将上述平板静置培养1～5天；
D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25℃～35℃的无氧条件中培养1～5天；
E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；
（3）产抑菌物质的乳酸菌的筛选
A、将步骤（2）得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25℃～35℃无氧条件下静置培养24～48h，得到菌株的发酵液；
B、在4℃条件下，分别将上述发酵液经7000～10000r/min离心10～25min，保留上清液；
C、通过牛津杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；
（4）产细菌素乳酸菌的筛选
将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛津杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；
（5）产细菌素乳酸菌的验证
将（4）中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素，硫酸铵沉淀法具体操作如下：将（4）中得到的产细菌素菌株的发酵上清液，以饱和度为80～100％硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜，在4℃下，7000～10000r/min离心40min得到沉淀；将所得沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将所得冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛津杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，以进一步通过酶解实验验证得到的抑菌物质为细菌素。
2.根据权利要求1所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的植物源材料为植物的根、茎、叶、果实、种子。
3.根据权利要求2所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。
4.根据权利要求1～3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述（3）产抑菌物质的乳酸菌的筛选，C步骤通过牛津杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株的具体操作方法如下：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养5～10h，OD600为0.2～0.4；取指示菌菌液0.1～0.3mL，与5～8mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上；待所述混匀物凝固，放上牛津杯，每个平板放置1～6个，并分别向牛津杯中加入B步骤制备好的上清液0.1～0.2mL；将平板放于4℃冰箱中静置4～10h，然后在28～37℃培养6～12h，观察牛津杯周围是否有抑菌圈形成，以得到产抑菌物质的菌株。
5.根据权利要求1～3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：通过对制得的产细菌素乳酸菌发酵上清液的硫酸铵沉淀样品的酶解实验验证菌株所产抑菌物质为蛋白质类物质，具体操作步骤如下：
A、取上述经硫酸铵沉淀后制成的冻干粉，溶于二级水中，浓度为20～100mg/mL，调pH值至各种蛋白酶的最适pH；
B、向上述溶液中分别加入各种对应的蛋白酶，终浓度为1.0～2.5mg/mL，对照组不加蛋白酶，37℃水浴1～3h；
C、然后将B步骤所得溶液的pH值调至4.0～5.0，通过牛津杯扩散法测定有无抑菌圈；
经各种蛋白酶的作用后，所获样品在牛津杯周围无抑菌圈，表明菌株所产抑菌物质是蛋白质，即为细菌素。
6.根据权利要求1～3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述MRS液体培养基的组成：葡萄糖20.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，硫酸镁0.56g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵5.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.25g，吐温80 5.0mL，用三级水定容至1L，pH值为7.0。
7.根据权利要求4所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的指示菌为各种革兰氏阳性菌或阴性菌。
8.根据权利要求5所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的蛋白酶为蛋白酶E、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中的任意一种。
9.根据权利要求7所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的指示菌为绿脓杆菌、鸡白痢沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110184137 CN102250806B (zh) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | 从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110184137 CN102250806B (zh) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | 从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102250806A CN102250806A (zh) | 2011-11-23 |
| CN102250806B true CN102250806B (zh) | 2013-10-30 |
Family
ID=44978378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110184137 Expired - Fee Related CN102250806B (zh) | 2011-07-01 | 2011-07-01 | 从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102250806B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105779311B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-04-05 | 加加食品集团股份有限公司 | 一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法 |
| CN109837323A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 广州中国科学院先进技术研究所 | 一种乳酸菌的筛选方法 |
| CN109679944B (zh) * | 2018-12-25 | 2021-01-05 | 浙江皇冠科技有限公司 | 一株高产细菌素乳酸菌的选育方法及其应用 |
| CN110898211A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-03-24 | 福建省闽东水产研究所 | 一种体外抑制大黄鱼内脏白点致病菌的抑菌组合物及其制备方法 |
| CN114395610A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-26 | 浙江特隆检测技术有限公司 | 一种快速筛选产细菌素微生物的方法 |
| CN115299489A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-11-08 | 仲恺农业工程学院 | 一种细菌素抑菌组合物及其制备方法与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006166853A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Ajinomoto Co Inc | 反芻動物用のメタン生成抑制剤および飼料組成物 |
| CN101392223A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 北京大北农科技集团有限责任公司 | 一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法 |
| CN101974467A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-02-16 | 郑州大学 | 一株植物乳杆菌及其应用 |
-
2011
- 2011-07-01 CN CN 201110184137 patent/CN102250806B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006166853A (ja) * | 2004-12-17 | 2006-06-29 | Ajinomoto Co Inc | 反芻動物用のメタン生成抑制剤および飼料組成物 |
| CN101392223A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 北京大北农科技集团有限责任公司 | 一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法 |
| CN101974467A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-02-16 | 郑州大学 | 一株植物乳杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Park SH."Characteristics and identification of enterocins produced by Enterococcus faecium JCM 5804T.".《J Appl Microbiol.》.2003,第95卷(第2期), |
| 王蔚淼."青贮饲料中乳酸菌的鉴定及生物学特性的研究".《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》.2007,(第4期), |
| 王蔚淼."青贮饲料中乳酸菌的鉴定及生物学特性的研究".《中国优秀硕士学位论文全文数据库(农业科技辑)》.2007,(第4期), * |
| 郭艳萍."抑黄曲霉乳酸菌的筛选及菌种鉴定".《中国微生态学杂志》.2010,第22卷(第7期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102250806A (zh) | 2011-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104531562B (zh) | 一种植物乳杆菌植物亚种及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法 | |
| CN102250806B (zh) | 从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法 | |
| CN104845912A (zh) | 一株植物乳杆菌 | |
| CN108148789B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用 | |
| CN108611299B (zh) | 一株产抑菌肽的植物乳杆菌及其应用 | |
| CN103013861B (zh) | 枯草芽孢杆菌hjda32菌株及其所产细菌素的制备方法 | |
| KR20210088408A (ko) | 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도 | |
| CN106754584A (zh) | 用于高产细菌素的植物乳杆菌swun5815及其应用 | |
| KR101845709B1 (ko) | 락토바실러스 플란타룸 ｋｃｃ―２６ 및 이를 포함하는 조성물 | |
| CN109619184A (zh) | 植物乳杆菌cqpc02在制备预防肝脏氧化损伤的食品或药品中的应用 | |
| CN106754571A (zh) | 一种复合微生物除臭剂及其制备方法 | |
| CN102008110B (zh) | 一种多菌种微生物复合饮料制剂及其制备方法 | |
| CN106544287A (zh) | 一株具有抗氧化能力及产细菌素的德式乳杆菌 | |
| CN109337833B (zh) | 诱变的肠膜明串珠菌的生物制剂及其用途 | |
| CN108432996B (zh) | 一种猴头菇乳酸菌发酵饮料及其制备方法 | |
| CN106635916A (zh) | 东方醋酸菌yzd‑09及其应用 | |
| Syukur et al. | Antimicrobial properties and Lactase activities from selected probiotic Lactobacillus brevis associated with green cacao fermentation in West Sumatra, Indonesia | |
| CN110607253B (zh) | 一种嗜热链球菌及其增殖培养方法和应用 | |
| CN104877940A (zh) | 一株嗜热链球菌 | |
| CN107788240A (zh) | 一种仔猪坏死性肠炎微生态调节剂及其制备方法、包含调节剂的饲料 | |
| CN102154169B (zh) | 一株丙酸杆菌菌株及其发酵生产抗菌代谢物的方法 | |
| CN102703345B (zh) | 一株抑制生物胺产生的棒状乳杆菌及其应用 | |
| CN104757544B (zh) | 一种具有抑菌作用的膳食补充剂及其制备方法和应用 | |
| CN101608201A (zh) | 一种新型嗜热链球菌细菌素的生产方法 | |
| CN116970512A (zh) | 一种植物乳杆菌、植物乳杆菌的培养方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131030 Termination date: 20180701 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |