CN106544287A - 一株具有抗氧化能力及产细菌素的德式乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离出的具有抗氧化能力且产细菌素的德式乳杆菌，保藏号为CGMCC No.11247，能够显著提高小鼠体内GSH-Px、T-SOD的活性，并降低小鼠血清中MDA的含量，具有免疫调节作用，能够应用于发酵乳制品的制备以及保健食品和药品的制备。

Description

一株具有抗氧化能力及产细菌素的德式乳杆菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及极端环境功能性乳酸菌开发与应用领域，以及具有抗氧化功能、产细菌素能力、抑制腐败微生物作用的德式乳杆菌保加利亚亚种的分离、筛选、鉴定及益生功能评价，和在食品和药品生产中的应用。

背景技术

氧化作用是有机体的必要代谢过程，但过度的氧化作用会引起生物大分子的损伤。氧化代谢过程中不断产生各种活性氧分子(ROS)，ROS具有高度的氧化活性，它们极不稳定，活性极高，能攻击细胞膜、线粒体膜，与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强，并分解更多的ROS，引起连锁反应。这样，膜结构的完整性受到破坏，引起肌肉、肝细胞、线粒体、DNA、RNA等广泛损伤从而引起各种疾病，如扩张性心肌病，老年性白内障、哮喘等。因此，过氧化作用产生的ROS是人体疾病、衰老和死亡的直接参与和制造者。随着社会发展人民生活水平不断提高，不良饮食结构、工作压力、环境污染等都会造成机体过度的氧化作用，形成氧化胁迫，加速衰老和疾病的产生。

益生菌在自然界中分布广泛，是一种可以通过改善肠道微生物的平衡来对宿主产生有益影响的微生物。目前应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌等，它们是人体肠道内重要的生理菌，对机体有多种生理作用。益生菌可以调整肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢，产生抗菌素来抑制有害菌群生长，抗肿瘤，增强免疫力，降低血清胆固醇，抗氧化延缓衰老等。因此，将益生菌应用于功能性食品开发具有重要意义。而具有细菌素产生能力的益生菌具有更强的生存和竞争能力，对微生态平衡的调节具有重要作用。由于细菌素无毒副作用且不易出现耐药性等众多优势，目前已经在食品安全以及人类健康中表现出巨大的作用和意义。目前天然功能乳酸菌资源缺乏，拥有高抗氧化能力且产细菌素的益生菌更是严重稀缺。

青藏高原独特的极端环境高海拔、低压、强紫外线、低温等会造成有机体内的氧化胁迫。Dosek等(2007)报道，长期暴露在高海拔的环境下伴随大气中氧浓度减少会造成氧化胁迫，提高机体内活性氧浓度。同样，基于生物对环境的适应性原理，长期生存在该环境下的生物体为了适应这种氧化胁迫有可能产生具有高抗氧化能力的特殊遗传特性和机制。而且自从俄 国梅契尼科夫的著作《长寿说》问世以来，乳酸菌的抗氧化功能并延缓衰老的益生作用已经有很多研究证明。因此，在极端环境下更有可能筛选出具有高抗氧化能力的特殊功能乳酸菌，且具有更独特的开发和应用价值。

由此，具有产细菌素能力且维持高抗氧化能力益生菌具有较大的应用价值，对维持人体健康具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高抗氧化能力、产细菌素且维持基本益生特性，能在体内发挥特殊益生功能的益生菌，以期进一步开发利用。

为了实现上述目的，本发明方法步骤如下：

(1)青藏高原传统发酵牦牛酸奶中的微生物通过MRS、M17、KFS和SL四种不同的培养基培养，挑选特征菌株并纯化，得到纯分离的菌株。

(2)结合过氧化氢阴性、革兰氏染色阳性、菌体形态以及镜检分离挑选似乳酸菌菌株，进行16S rDNA测序，NCBI中进行Blast比对，鉴定并保存403株乳酸菌菌株。

(3)测定(2)中已鉴定的乳酸菌菌体的DPPH清除能力进行初筛，共筛选出59株清除能力较好的菌株。

(4)将(3)中挑选的菌株进行1×10⁹CFU/mL细胞破碎测定其无细胞提取物中T-AOC活性进行复筛，筛选出32株活性较强的菌株。

(5)将(4)中挑选的菌株进行1×10¹⁰CFU/mL细胞破碎测定其无细胞提取物中T-AOC、还原能力、HO·及O₂ ^-清除能力。参照标准菌株为中国工业的微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买。经分析挑选出综合抗氧化能力强的10株菌株。

(6)对(5)中挑选出的10株乳酸菌的体外益生功能进行评价，包括酶活、抑菌能力、模拟胃肠道、耐胆盐、疏水能力测定，选出1株综合体外益生功能较好的菌株F17，该菌株在(2)中被鉴定为德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。

(7)通过动物模型试验，对F17进行体内抗氧化特性研究以及免疫特性研究。

本发明所述具有高抗氧化能力且产细菌素的德式乳杆菌保加利亚亚种F17已于2015年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11247。

本发明具有综合性能的菌株，该菌株综合抗氧化能力较强，具有较强的肽酶和糖苷酶水 解活性，在胆盐耐受能力、抑菌能力、疏水能力以及模拟胃肠道的体外试验中都表现较好的益生特性。而且该发明菌株具有产细菌素的能力。

经动物试验证明，本发明菌株能有效减少衰老老鼠中脑组织的损伤，可调节肠道微生物菌群，并且提高老鼠肝脏和血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，以及提高老鼠血清和脑中总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，降低血清中丙二醛(MDA)的含量。本发明菌株能诱导血清中免疫因子IL-10、IL-12和IFN-γ的增加，具有免疫调节作用。

附图说明

图1为本发明实施例2中高DPPH清除能力乳酸菌与参考菌株的对比；

图2为本发明实施例2中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中T-AOC活性；

图3为本发明实施例2中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液对HO·自由基的清除能力；

图4为本发明实施例2中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液的还原能力；

图5为本发明实施例2中乳酸菌及相应的参考菌无细胞提取液中O₂ ^-清除能力；

图6为本发明实施例4发明菌株对小鼠血清细胞因子和分泌型免疫球蛋白A的影响

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

相关培养基配方

乳酸细菌培养基(MRS)(张刚，2007)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。

M17培养基(张刚，2007)：精确称取植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，量取1.0mol/L MgSO₄·7H₂O 1.0mL，蒸馏水1000mL，琼脂15g。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.0，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。

SL培养基(张刚，2007)：称取酪蛋白水解物10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g， 乙酸钠25g，七水硫酸镁0.58g，琼脂15g，葡萄糖20g，吐温801.0mL，磷酸氢二钾6g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.15g，蒸馏水1000mL。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 5.4，加入已加热溶解的琼脂，混合均匀，边搅拌边煮沸5min，冷却到50℃，倒平板。

KFS链球菌选择性培养基：月示蛋白胨10g，酵母粉10g，甘油磷酸钠10g，氯化钠5g，麦芽糖20g，乳糖1g，叠氮钠0.4g，琼脂13g，溴甲酚紫0.015g，调节pH 7.2。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.2，加入琼脂，121℃灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入无菌1％TTC溶液10mL，混匀，趁热倒平板。

营养培养基(NB)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备营养培养基平板时，加入0.8％的琼脂。

脑心浸液肉汤(BHI)：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备培养基平板时，加入0.8％的琼脂。

双歧杆菌培养基(BS)、伊红美蓝琼脂(EMB)培养基、乳杆菌(LBS)培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

试验中采用的参考菌株

标准乳酸菌：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，CICC23108)，分离基物为酸奶；戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus，CICC23111)，分离基物为自然发酵乳；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，CICC23466)，分离基物为牛奶；副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei，CICC22166)，分离基物为酸乳；耐久肠球菌(Enterococcus durans，CICC20431)，分离基物为酸奶子；屎肠球菌(Enterococcus faecium，CICC20420)，分离基物为酸奶子；粪肠球菌(Enterococcus faecalis，CICC20419)，分离基物为酸牛奶；乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis，CICC22259)，分离基物为自然发酵酸乳；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，CICC6247)，分离基物为市售酸奶；瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus，CICC22171)，分离基物为干酪；乳明串珠菌(Leuconostoc lactis，CICC22183)，分离基物为生乳；肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，CICC20714)，分离基物为酸奶。

标准致病菌：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，CICC10420)，单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，CICC21583)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC10384)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli，CICC20234)。单增李斯特氏菌用脑心浸液培养基培养，其 余致病菌用营养培养基培养。

实施例1：从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离并鉴定乳酸菌

一、样品来源

来源于我国甘肃省天祝藏族自治县传统发酵牦牛乳制品。

二、从传统牦牛乳制品中分离得到乳酸菌

取1mL发酵牦牛乳制品按1:10比例，用灭菌生理盐水稀释，此为10^-1稀释度。然后吸取1mL上述稀释液，再10倍稀释，为10^-2稀释度，以此类推。选取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度，分别吸取100μL稀释液分别均匀地涂布于MRS、M17、KFS和SL(调pH5.4)平板培养基上，分别在37℃、42℃、42℃和37℃厌氧恒温培养48小时，挑取特征菌落，并进一步纯化，得到纯分离的乳酸菌菌株。

三、对菌株进行鉴定

(1)革兰氏染色、过氧化氢酶实验

革兰氏染色：挑取平板上的纯菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染、干燥、油镜镜检。蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

过氧化氢酶实验：将待测菌在空气中暴露30min，用滴管吸取少量3％(体积分数)过氧化氢滴于平板表面所生长的菌落，2-3分钟后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。

该菌株革兰氏染色为阳性，过氧化氢实验为阴性，可初步视为乳酸菌。

(2)16SrRNA鉴定

纯化后的乳酸菌在MRS培养基中培养8h后，10000rpm/min离心3-5min收集菌体，按照试剂盒使用方法提取DNA。然后进行PCR扩增，在细菌的通用引物27F和1492R(Monis et al,2005)的扩增下，进行16SrRNA的扩增。扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min 30s；72℃5min，30次循环。PCR产物送上海美吉生测序公司进行序列分析。将测得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http：//wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，与待测菌株同源性值大于98％，则可认为他们属于同一个种。可鉴定的乳酸菌共403株，全部用于高抗氧化能力乳酸菌的筛选。

实施例2：高抗氧化能力乳酸菌的筛选

一、乳酸菌完整细胞和无细胞提取物的制备

细胞菌液的制备：将实验室-80℃保存的菌液接入已灭菌的MRS培养基中37℃培养过夜，连续传代3次。培养液经12,000g离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数。

无细胞提取液的制备：将菌液在37℃过夜活化两次，8000g，10min，4℃，离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数1×10⁹CFU/mL或1×10¹⁰CFU/mL。冰浴超声破碎细胞，5s，5s，30min，360W。8000g，10min，4℃，收集上清液为无细胞提取物(郭兴华，2008)。

二、初筛

称取0.008g DPPH溶于无水乙醇，定容至100mL，配制成0.2mmol/L DPPH。吸取1.5mL菌液(1×10⁸CFU/mL)加入1.5mL 0.2mmol/L DPPH，室温下(20～25℃)避光反应30min，8000g，4℃，离心10min，取上清液，517nm处测定上清液吸光度，去离子水调零(Shengyu Li，2000)。

DPPH清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A_c]×100

A_i：1mL DPPH+1mL样品；A_j：1mL乙醇+1mL样品；A_c：1mL DPPH+1mL PBS。

试验中筛选出59株高DPPH清除能力的乳酸菌。

三、复筛

将初筛中的59株高DPPH清除能力乳酸菌全部用于复筛。

(1)超氧阴离子(O₂ ^-)清除能力的测定

本实验采用Liu等(2010a)的方法并略做修改。混合反应液包括：2.8mL Tris-HCl(0.05M，pH 8.2)，0.1mL邻苯三酚(0.05M)，0.1mL无细胞提取物。将混合反应液混匀，25℃，黑暗中反应4min。反应结束后，添加1mL 8M HCl终止反应，在320nm下检测吸光度。

超氧阴离子清除能力(％)＝[1-A₁/A₀]×100％

A₀为没有添加样品的空白对照，A₁为添加样品的吸光度(Liu et al.,2010)。

(2)清除羟自由基(HO·)的能力

吸取0.5mL无细胞提取物和1mL O-菲啰啉(浓度0.1％)，加入1mL PBS，1mL 2.5mmol/L FeSO₄，1mL 20mmol/L H₂O₂。37℃恒温水浴反应1.5h后，536nm处测吸光值。利用以下公式计算超氧自由基的清除率：

清除率(％)＝[(A₂-A₁)/(A₀-A₁)]×100％

式中：A₀—不含样品和H₂O₂；A₁—不含样品，含H₂O₂；A₂—含样品和H₂O₂(郭兴华等,2008)。

(3)还原活性

采用Oyaizu(1986)(Oyaizu et al.,1986)的方法进行试验。反应液中加入0.5mL无细胞 提取物，0.5mL铁氰化钾(质量分数为1％)，0.5mL 0.2M PBS，混匀，50℃水浴20min。急速冷却并加入0.5mL三氯乙酸(TCA，质量分数为10％)，4500g，4℃，离心10min。取上清1mL与1mL氯化铁(FeCl₃，质量分数0.1％)反应10min，于700nm测吸光度，A_s为添加样品吸光度，A_b为PBS代替菌液后的吸光度。

还原能力(％)＝(A_s-A_b)/A_b×100％

(4)总抗氧化能力(T-AOC)

定义：在37℃时，每分钟每毫升无细胞提取物使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。采用南京建成总抗氧化能力试剂盒，根据试剂盒说明进行试验。

四、挑选综合抗氧化能力强的菌株

结合初筛和复筛中的各项抗氧化指标，挑选出10株综合抗氧化能力强的菌株，与CICC参考菌株进行对比。图1、2、3、4、5表示筛选出的10株抗氧化能力表现较好乳酸菌的自由基清除能力，本发明乳酸菌F17综合抗氧化能力表现较好，且高于参考菌株。为了进一步在这10株菌中挑选出能作为益生菌的优势菌株，以下试验进行体外益生特性研究，验证本发明菌株是否满足作为益生菌的基本条件。

表1本发明菌株F17抗氧化能力

实施例3：体外益生特性研究

一、发明菌株酶活测定(API-ZYM)

采用法国梅里埃公司API-zym试剂进行检测，该技术为一个半定量的微量方法系统，专为研究酶活所设计的。菌液采用无菌MRS培养液传代培养3次，离心收集菌体，用无菌生理盐水准备1×10⁷CFU/mL的菌悬液进行试验。

表2表明，乳酸菌F17具有较强的肽酶活性，能有效水解氨基酸为挥发性分子，对发酵产品的风味产生承担着非常重要的作用。而F17强的糖苷酶活性可有效利用糖源，决定着乳酸菌发酵能量的提供，半乳糖苷酶活性越高，可有效缓解人体肠道乳糖不耐症。

表2发明乳酸菌F17的酶活

注：“1”相当于释放5微毫克分子浓度(5nM)；“2”相当于10nM；“3”为20nM；“4”为30nM；“5”为40nM或更高。

二、发明菌株抑菌试验

采用琼脂扩散法(Papamaloni et al.,2003)进行抑菌试验。

乳酸菌发酵上清液准备：将乳酸菌过夜活化两次，调整菌数到1×10⁸CFU/mL，2％接种到3个不同的10mL MRS液体培养基中，分别编号1、2、3，37℃，培养24h。将乳酸菌发酵液9500g离心10min，取上清。1、2号管上清液用1N的NaOH调整pH到6.5，排除酸的影响。2号管添加过氧化氢酶溶液(300U/mL，溶于PBS缓冲液)，排除过氧化氢的影响。3号管上清液作为对照管(Aslim et al.,2005)。

将20mL营养培养基或脑心浸液培养基(含0.75％琼脂)灭菌后冷却到45℃，分别接入已过夜培养的不同致病菌，使其终浓度为1×10⁶CFU/mL，混匀，倾倒到无菌培养皿中。冷却凝固后，用无菌打孔器在平板上打8mm的孔，孔内分别加入100μL不同乳酸菌1、2、3号发酵液，4℃扩散5h后放置37℃培养24h。最后量取抑菌圈直径，扣除8mm孔径的大小。

表3表明该发明菌株F17的24h发酵液具有抑制4种常见的极易造成食品污染和人体各种疾病的致病菌的能力，并且表现出较强的金黄色葡萄球菌和李斯特氏菌抑制能力。表4表明，2号管为排除酸和过氧化氢的影响的处理，具有抑菌圈，说明F17产生了细菌素。

表3发明菌株F17的抑菌能力

注：1号管，pH＝6.5，排除酸的影响；2号管，pH＝6.5，添加过氧化氢酶溶液(300U/mL)，排除酸和过氧化氢的影响；3号管，发酵上清液未做处理。

三、发明菌株消化道模拟试验及疏水能力测定

(1)疏水能力

根据Collado等(2008)的方法进行试验，菌体在实验前按1％(v/v)的接种量接种于无菌MRS培养基37℃传代培养3次。离心收集菌体，PBS洗两次，重悬于PBS缓冲液中，调整菌数1×10⁸CFU/mL。将菌悬液放置于室温下，在不同时间(0,2,4,6,8,10,20h)检测600nm下的吸光度。

疏水能力(％)＝(A₀-A_t)/A₀×100

A₀代表0h下的吸光度，A_t代表不同时间(0,2,4,6,8,10,20h)下的吸光度。

(2)模拟胃肠道存活率

采用Carteris等(1998)的方法。具体步骤如下：

模拟胃液的配制：0.35g胃蛋白酶溶于100mL 0.2％的无菌生理盐水，用浓盐酸调节pH到3.0，过0.45μm滤膜除菌。

模拟肠液的配制：0.1g胰蛋白酶，1.8g胆盐溶于无菌溶剂含1.1g NaHCO₃、0.2g NaCl及100mL蒸馏水，用0.5M的NaOH调整pH到8.0。溶液过0.45μm滤膜除菌。

将已活化3次的菌液按10％的接种量接种到模拟胃液(pH3)中，混匀，37℃厌氧培养，分别在0,3h取样平板计数。在模拟胃液中培养3h后，吸取1mL培养液接种到9mL模拟肠 液(pH 8)中，37℃厌氧培养，分别在0,3,6,11,24h取样计数。

计数用MRS培养平板，生理盐水梯度稀释，取样涂布，37℃厌氧培养48h，计数30～300菌数的平皿。

存活率(％)＝(log CFU N₁/log CFU N₀)×100％

N₁代表经过模拟胃肠道培养后的乳酸菌数量；N₀代表模拟胃肠道培养前的乳酸菌数量。(3)耐胆盐能力

无菌MRS-THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠)中添加0.3％(W/V)的牛胆汁，然后接种1％的乳酸菌(已活化三次)，对照组为不含牛胆汁的MRS-THIO培养液。水浴37℃培养，每两小时取样620nm下测定吸光度，用不含乳酸菌的相对应的空白培养基调零。记录OD_620nm变化0.3个单位的时间。推迟时间(LT)的计算为乳酸菌生长到OD_620nm变化0.3个单位时所推迟的时间。LT越小耐胆盐能力越强(Walker和Gilliland，1993)。

表5表明F17具有较好的消化道耐受能力以及疏水能力，能够在消化道环境中保持较高的存活率，且增加了黏附到肠道壁的机会，满足作为益生菌的基本条件。

表5发明菌株F17模拟消化道耐受能力及疏水能力

¹乳酸菌在pH3人工胃液中存活3h后，再在模拟肠液中消化24h后的存活率。

²在吸光度OD_620nm时，MRS-THIO与MRS-THIO(含0.3％胆盐)两种培养基中菌株生长增加0.3个单位所需要的时间差。

实施例4：动物模型试验

一、发明菌株体内抗氧化特性研究

(1)小鼠喂养试验

40只雄性BALB小鼠，体重25g左右，自由采食和饮水，经7天的预试期后，空腹12h，不限制饮水，称重。根据体重随机分为4组，每组10只，每个处理组饲喂基础日粮，试验期为6周。所有处理组每日灌胃0.3mL生理盐水、Vc或乳酸菌，每日注射0.2mL生理盐水或D-半乳糖。D-半乳糖亚急性衰老模型的给药方式采用颈背部皮下注射(Ke et al.,2009)。试验分组及药剂分配见表6。

表6实验动物分组及处理

氧化衰老模型组试验鼠表现出明显的衰老体征(体重减少、毛色暗黄、行为缓慢、精神萎靡等)。最后一次灌胃和注射D-半乳糖后，停止进食8h，不限制饮水。称重，摘眼球取血，室温放置，离心(4000g，10min)分离血清，-80℃保存备用。采血后劲椎脱臼处死，放置于冰上，分离肝、脑、心、肾、脾。用预冷的生理盐水冲洗表面血迹，医用纱布拭干，称重。按下式计算脏器比重：

称重后，将脑和肝脏组织用电动组织研磨器匀浆，并加入9倍体积预冷的生理盐水，混匀。将制备好的10％的匀浆液用低温离心机4000g离心10min。取上清，-80℃保存，待测。

(2)肠道微生物

于6周末无菌条件下取小鼠新鲜粪便保存于无菌EP管中，称重，加入9倍无菌生理盐水，漩涡振荡器上充分振荡混匀。10倍梯度稀释，选择适宜的稀释度分别涂布于双歧杆菌(BS)、乳杆菌(LBS)、伊红美蓝琼脂(EMB)选择性培养基上，肠杆菌培养基置于37℃需氧培养24h，乳杆菌培养基37℃厌氧培养72h，双歧杆菌培养基37℃厌氧培养48h。计数，记录每克粪便所含菌群的数量，并计算双歧杆菌与肠杆菌的数量比值(B/E比值)。

细菌计数：每克湿便中的细菌量＝平均菌落数×稀释倍数×10，并取对数转换(Lg CFU/g)。

(3)小鼠肝脏和脑组织中的蛋白含量

本试验采用考马斯亮蓝法测定蛋白。牛血清蛋白(BSA)为标准品。

(4)小鼠血清、脑组织及肝脏组织中总抗氧化能力(T-AOC)

测定原理：许多抗氧化物质能使Fe³⁺还原成Fe²⁺，而Fe²⁺可与菲啉类物质结合构成稳定的络合物，比色法可检测其氧化能力的高低。具体方法根据南京建成试剂盒步骤进行。

(5)小鼠血清、脑组织及肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力(GSH-Px)

每0.1mL血清或每mg蛋白质，扣除非酶促反应作用的，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位，按照南京建成试剂盒说明书操作进行。

(6)小鼠血清和肝脏组织中丙二醛(MDA)含量

MDA测定采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，按照南京建成试剂盒说明书操作进行。

(7)小鼠血清、脑组织、肝脏组织中总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)

每mL血清或每mg组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。本试验采用黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD。具体方法根据南京建成试剂盒完成。

见表7、8、9、10、11、12动物试验结果表明，F17对小鼠脏器无毒副作用，可减少衰老老鼠脑组织的损伤。发明菌株F17能显著增加小鼠肠道内双歧杆菌与肠杆菌比值(B/E)，调节肠道微生物菌群。F17能提高小鼠肝脏和血清中GSH-Px活性，血清和脑中T-SOD的活性，以及降低小鼠血清中MDA的含量，具有体内抗氧化作用。

表7乳酸菌对小鼠脏器比重的影响

表8各处理组小鼠粪便菌群分布

表9小鼠各组织和血清中GSH-Px的活性

表10小鼠各组织和血清中T-SOD的活性

表11小鼠各组织和血清中T-AOC的活性

表12小鼠肝脏和血清中MDA的含量

二、发明菌株体内免疫特性的研究

(1)小鼠喂养

18只雄性BALB小鼠，体重25g左右，自由采食和饮水，经7天的预试期后，空腹12h，不限制饮水，称重。根据体重随机分为2组，每组9只，每个处理组饲喂基础日粮。小鼠分组处理及剂量见表13，每日灌胃一次，试验期2周。小鼠自然光照，自由采食和饮水。

表13实验动物分组及处理

最后一天灌胃后，停止进食8h，不限制饮水。称重，摘眼球取血，室温放置，离心(4000 g，10min)分离血清，-80℃保存备用。采血后劲椎脱臼处死，放置于冰上，分离肝、心、肾、脾、胸腺。用预冷的生理盐水冲洗表面血迹，医用纱布拭干，分别称重。按下式计算脏器比重：

(2)细胞因子IL-12，IL-10和IFN-γ的测定

血清样品室温融化，按照IL-12，IL-10和IFN-γELISA试剂盒的操作手册进行(购自上海研吉生物科技有限公司)。

(3)分泌型免疫球蛋白sIgA的测定

血清样品室温融化，按照sIgA放射免疫试剂盒的操作手册进行。

见表14试验结果表明，发明菌株对脏器无毒副作用。且图6表明，发明菌株能诱导血清中免疫因子IL-10、IL-12和IFN-γ的增加，具有体内免疫诱导和调节作用。

表14乳酸菌对小鼠脏器的影响

本发明提供的菌株德式乳杆菌保加利亚亚种F17体内体外试验都证明其具有较好的抗氧化能力，能有效促进体内抗氧化酶活性的增加。且该菌株可产生细菌素，对维持肠道微生物菌群平衡具有一定的作用，能调节和诱导体内免疫反应。该菌株满足作为益生菌的基本条件，具有抑制常见致病菌生长的能力，能保持较高存活率通过消化道环境。该菌株较好的疏水能力增加了其黏附到肠道壁并发挥益生作用的机会。该产品无毒副作用，可作为保健食品或药品提高机体免疫力、抗衰老、美容以及调节肠道菌群等。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种具有抗氧化能力并产细菌素的德式乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.11247。

2.一种权利要求1所述的德式乳杆菌的筛选鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离乳酸菌菌株，并纯化，得到纯分离的菌株。

(2)通过过氧化氢酶实验、革兰氏染色、菌体形态和16SrRNA序列分析，鉴定步骤(1)筛选出的乳酸菌菌株，包括本发明菌株F17德式乳杆菌。

(3)通过二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)清除能力，超氧阴离子(O₂ ^-)清除能力、清除羟自由基(HO·)的能力、还原活性、总抗氧化能力(T-AOC)等抗氧化能力的测定筛选出综合抗氧化能力强的本发明菌株F17。

3.一种权利要求1所述的德式乳杆菌的益生特性评定方法，其特征在于，包括以下内容：

(1)通过抑菌试验验证本发明菌株具有产细菌素能力和抑菌能力。

(2)通过体内、体外试验验证本发明菌株具有基本益生菌特性、抗氧化特性以及免疫调节作用。

4.权利要求1所述的具有抗氧化能力并产细菌素的德式乳杆菌在制备发酵乳制品中的应用。

5.权利要求1所述的具有抗氧化能力并产细菌素的德式乳杆菌在制备保健食品和药品中的应用。