CN109517763A - 瑞士乳杆菌h11及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)H11及其用于制备褐色活性乳饮料的方法，包括MRS培养基制备、活化菌株、菌株培养、制备含葡萄糖的脱脂乳液与制备褐色活性乳酸菌饮料等步骤。本发明的优点在于所制备的褐色活性乳饮料能够降低发酵时间、缩短发酵成本，在贮藏期间口感、风味良好，并且具有较好稳定性；同时在发酵期间产生了具有降血压功能的ACE抑制活性和生物活性肽Val‑Pro‑Pro和Ile‑Pro‑Pro，增加了乳饮料产品的功能性和保健性。

Description

瑞士乳杆菌H11及其应用
【技术领域】
本发明属于生物应用技术领域。特别涉及瑞士乳杆菌 (Lactobacillushelveticus)H11及其制备具有降血压功能的益生菌褐色发酵乳饮料。
【背景技术】
随着我国经济发展，人民生活改善和生活节奏加快，由此带来的众多不健康生活方式导致高血压患病人群趋于年轻化，发病率呈逐年上升趋势。目前，治疗高血压药物主要是化学合成的血管紧张素转化酶(Angiotensin-I-convertingen enzyme,ACE)抑制剂。它虽然能有效降低血压，但在临床使用中显现出血压过低、肾功能衰竭、咳嗽、皮肤过敏和血管性水肿等诸多毒副作用。因此，食源性天然ACE抑制肽引起众多科学家的浓厚兴趣，研制安全、无毒、高效的抗高血压功能性食品日益尤其成为治疗和预防高血压的研究热点。其中，乳源ACE 抑制肽及其功能性食品备受瞩目。
乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是目前通过发酵获得天然ACE 抑制肽方面利用最多的微生物之一。乳酸菌作为公认的安全微生物，广泛用于发酵食品加工。在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)以其蛋白水解能力强、生长迅速、产酸速度快著称，也是抗高血压活性研究最多的乳酸菌。目前，制作褐色活性乳饮料的发酵菌种以干酪乳杆菌为主，而瑞士乳杆菌在褐色活性乳饮料中的应用较少。
褐色活性乳酸菌饮料是采用乳酸菌菌种，经37℃发酵原料乳，再经配料、均质等工艺制成的清新爽口、风味独特的低热量、富含有生物活性物质、蛋白质、维生素的发酵型乳酸菌饮料。为避免发酵期间杂菌污染，对用于发酵的脱脂乳液进行115℃灭菌15min，而导致发酵乳在高温下发生美拉德反应，故呈褐色。在日本、韩国、欧美等国家均已有工业化的产品，且市场前景良好。目前，制作褐色活性乳酸菌饮料的发酵菌种以干酪乳杆菌为主，因此，研究和选育一种发酵时间短、具有优良的感官品质及风味特性，开发产品的益生特性具有重要意义。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus) H11及其用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)H11，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No16405.。
本发明还涉及瑞士乳杆菌H11在制备褐色活性乳饮料中的用途。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的褐色活性乳饮料制备步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/L MgSO4·7H2O、 50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌 10min，得到所述的MRS培养基；
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤2～3次，然后把洗涤的菌体悬浮于4～8ml 灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计1～3％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养16～20h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将8～16重量份脱脂乳粉与1.5～2.5重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度62～65℃，接着均质化处理与灭菌褐变处理，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照4～6×106cfu/ml 接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养30～40h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:10～15:56～68混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，脱脂乳粉与葡萄糖的重量比是13：2。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述的脱脂乳粉是低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，含葡萄糖的脱脂乳粉溶液在均质压力16～25MPa的条件下均质化处理14～35min，接着在温度115℃的条件下灭菌褐变处理8～12min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，接种的含葡萄糖脱脂乳液中在温度37℃的条件下培养35h。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述褐色活性乳酸菌饮料在35h到达发酵终点同时开始贮藏，贮藏期间的pH值是 3.51～3.60，滴定酸度为56.10～63.53°T。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的血管紧张素转换酶抑制率是60.97％～ 70.13％；生物活性肽Val-Pro-Pro的含量是1.10～1.34μM；Ile-Pro-Pro 的含量是0.19～0.28μM。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤E中，所述的褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间含有1.72×108cfu/g～3.84×108cfu/ml瑞士乳杆菌H11。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)H11，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.16405。
本发明的瑞士乳杆菌H11是从新疆地区伊犁州酸马奶中分离获得的，它具有优异的发酵速率。
它是按照下述筛选方法筛选得到的：
I、菌株分离方法
制备MRS培养基：按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L 酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/L K2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、 200mg/L MgSO4·7H2O、50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌10min，得到所述的MRS培养基；往所述的MRS 培养基中添加15g/L琼脂粉，在温度115℃下灭菌10min，得到MRS 琼脂培养基。
上述的酸马奶样品用涡旋振荡器混匀，称取0.5g或0.5ml样品放入4.5ml浓度为以重量计0.85％的灭菌生理盐水中，采用十倍稀释法对样品进行梯度稀释(10-4，10-5，10-6)，然后涂布在含有放线菌酮(浓度以重量计0.1％，OXID公司销售产品)和硫酸粘菌素(浓度以重量计0.1％，OXID公司销售产品)的MRS琼脂培养基或者M17琼脂平板培养基(OXID公司销售产品)上，在温度30℃下厌氧培养48h～ 72h，挑取单菌落，转接种于TPY增菌培养液(见下面的说明)中，在温度30℃下培养24h～48h，观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌暂定名为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h～48h，再进行下述鉴定、保存。
II、分子生物学鉴定
制备TPY增菌培养液：按照10g/L乳糖、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、10g/L酪蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、2.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L 磷酸二氢钾、100mg/L MgSO4·7H2O、250mg/LTween-80、500mg/L L- 半胱氨酸盐酸盐、15g/L琼脂称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于软化水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌10min，得到所述的TPY增菌培养液。
将冷冻保存的供试菌株接种于5ml TPY增菌液体培养基中，震荡混匀，在温度30℃下恒温培养24h，以同样方式连续活化两代，取2mL 对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管中，在温度4℃下8000×g 离心3min，收集菌体，弃去上清，采用乳酸菌CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
采用通用引物，正向引物是27f(对应于Escherichia coil8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物是1495r (对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5′ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，以菌体DNA为扩增模板PCR扩增16S rRNA基因区域，扩增产物纯化，再进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定。从酸马奶采集到的菌株显示出了与瑞士乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。将上述微生物鉴定为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，并命名为瑞士乳杆菌H11，其系统发育树状图参见附图1。
III、形态学特性
本发明瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus H11具有如下形态学特征：细胞呈长杆状，末端钝圆，长2.0～6.0μm，宽0.6～1.0μm，呈单个或链状，具体参见附图2。
IV、菌落形态特性
本发明瑞士乳杆菌H11在MRS琼脂培养基上形成乳白色菌落，不透明，圆形，边缘整齐，中央凸起，直径约1.1～1.4mm，具体参见附图3。
V、菌株发酵速率测定
制备浓度为以重量计10％的脱脂乳液：将10重量份脱脂乳粉溶解于100重量份软化水中，在温度115℃下进行灭菌10min，然后冷却至温度37℃以下，得到所述的脱脂乳液；
由内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区传统发酵食品分离得到的194株瑞士乳杆菌作为筛选快速发酵瑞士乳杆菌的来源。该194株瑞士乳杆菌由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。把冻存管中的保藏液接种到5ml的 MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃下恒温培养24h，连续活化两代，然后按照以脱脂乳液重量计2％接种量接种到上述脱脂乳液中，在恒温培养箱中于温度37℃下培养24h后，选择pH值≦4.0的菌株作为复筛菌株。
VI、菌株模拟胃肠液耐受性
使用1mol/L HCl溶液将灭菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)的pH值调节至2.5，加入胃蛋白酶，使其浓度达到3.0mg/ml，然后用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟胃液；
使用0.1mol/L NaOH溶液将灭菌PBS的pH值调节至8.0，加入胰蛋白酶使其浓度达到以重量计0.1％，同时加入牛胆汁使其浓度达到以重量计1.8％，混合均匀，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成人工模拟肠液。
模拟胃肠液耐受性：将步骤V筛选出的瑞士乳杆菌菌株在MRS 培养基中活化培养两代，用灭菌生理盐水离心洗涤3次，然后悬浮于 5ml灭菌生理盐水中制成菌悬液。
把1ml上述菌悬液加入9ml上述制备的pH值2.5的人工胃液中，在温度37℃下培养3h，于0、3h分别取样，采用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。然后，把1ml已消化3h的含菌人工模拟胃液加到9ml上述制备的人工模拟肠液中，继续在温度37℃下培养，并分别于0、4、8h采用MRS琼脂培养基倾注法测定活菌数。
由下述公式计算菌株存活率：
式中：
N1代表菌株处理后的活菌数；
N0代表菌株初始活菌数。
VII、接种量及发酵时间的确定
制备褐变脱脂乳液：将13重量份脱脂乳粉和2重量份葡萄糖完全溶解于100重量份温度为45℃的软化水中，静置30min，在温度 115℃下灭菌10min，制得所述的褐变脱脂乳液。
将步骤V筛选的瑞士乳杆菌菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤2～3次，然后把洗涤的菌体悬浮于4～8ml灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液。
按照以脱脂乳液重量计2％接种量传代接种于100mL浓度为以重量计10％的脱脂乳液中，在温度37℃下培养12h，采用平板计数法计活菌数，然后分别以1×106、2×106、5×106、1×107cfu/ml接种于3瓶100g褐变脱脂乳液中，在温度37℃下在水浴中培养30min，再于在恒温培养箱中在温度37℃下发酵至滴定酸度(Titration acidity,TA)为 200°T，确定发酵时间以及最佳接种量。
本发明还涉及所述的瑞士乳杆菌H11在制备褐色活性乳饮料中的用途。
所述的褐色活性乳饮料制备步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/L MgSO4·7H2O、 50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌 10min，得到所述的MRS培养基；
制备MRS培养基所使用的化学物质都是目前市场上销售的产品。
MRS培养基灭菌使用的设备是本领域通常使用的在目前市场上销售的产品。
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤2～3次，然后把洗涤的菌体悬浮于4～8ml 灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
在本发明中，恒温培养使用的设备是本领域通常使用的、在目前市场上销售的产品。
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计1～3％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养16～20h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将8～16重量份脱脂乳粉与1.5～2.5重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度62～65℃，接着均质化处理与灭菌褐变处理，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
本发明使用的脱脂乳粉是低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉，它们都是目前市场上销售的产品，例如由新西兰进口的低热脱脂乳粉。
本发明使用的软化水是将原水通过交换器树脂床，水中的钙、镁离子被树脂吸附，同时释放出钠离子，得到一种软化水。当树脂吸附钙、镁离子饱和时，软水器按照预定的程序自动进行树脂再生，将高浓度氯化钠水溶液通过树脂床，使树脂再生成钠型树脂。本发明使用的软水器是目前市场上普遍销售的产品。
均质化处理是一项食品工业生产的常用技术。在食品加工中，所述的均质应该理解是物料料液在挤压、强冲击与失压膨胀三重作用下使物料细化，从而使物料达到更均匀地混合。例如在奶制品加工中使用均质机将牛奶中的脂肪破碎得更小，从而使整个产品体系更加稳定。均质主要使用均质机实现，均质机是食品、乳品、饮料行业中的重要加工设备。在本发明中，所使用的均质机是目前市场上广泛销售的产品。
在本发明中，含葡萄糖的脱脂乳粉溶液进行均质化处理的目的在于使脱脂乳粉更加细化，从而使葡萄糖与脱脂乳粉更均匀地混合，该体系更加稳定。具体地，含葡萄糖的脱脂乳粉溶液在均质压力16～ 25MPa的条件下均质化处理14～35min。
在均质化处理后接着进行灭菌褐变处理。本发明灭菌褐变处理的目的在于消除在发酵过程中可能发生的杂菌污染。
灭菌系指用热力或其他适宜方法将物质中的微生物杀死或除去的方法。本发明采用的灭菌方法是本技术领域里通常采用的方法，例如湿热灭菌法、干热灭菌法、过滤除菌法等。湿热灭菌法系指在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段将物质中的细菌杀灭的方法。该方法灭菌能力甚强，为热力学灭菌中最有效及用途最广的方法。
具体地，均质化处理的含葡萄糖脱脂乳粉溶液需要在温度115℃的条件下进行灭菌褐变处理8～12min。灭菌褐变处理的温度与时间超过所述的范围也是不可取的。
将经均质化处理与灭菌褐变处理的含葡萄糖脱脂乳液冷却至温度37℃。在本发明中，可以采用各种冷却方式进行冷却，例如用冷却水进行冷却，或者使用目前市场上销售的各种冷却设备进行冷却。
优选地，含葡萄糖的脱脂乳粉溶液在均质压力16～25MPa下均质化处理14～35min，在温度115℃的条件下灭菌褐变处理10min。
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照4～6×106cfu/ml 接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养30～40h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:10～15:56～68混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
优选地，接种的含葡萄糖脱脂乳液在温度37℃的条件下培养35h。
优选地，含葡萄糖脱脂乳液、白砂糖与软化水的重量比是25:13: 62。
本发明褐色活性乳酸菌饮料特性包括在温度4℃下储藏期间活菌数、pH值、ACE抑制率、生物活性肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro含量；它们的检测方法如下：
一、瑞士乳杆菌H11活菌数检测方法：
发酵液用灭菌生理盐水梯度稀释到合适倍数后，采用MRS琼脂培养基平板倾注法，在培养皿中在温度37℃下培养48h后计菌落总数，计数应选取菌落数在30～300之间的平板作为活菌总数测定的指标。计数单位为CFU/mL。
二、pH值测定方法
使用由上海精密科学仪器有限公司销售的雷磁PHS-3C型pH计测量pH值。
三、酸度测定方法
准确称量5.00g发酵液样品加到100ml三角瓶中，再加入40ml 软化水、0.5ml浓度为以重量计0.5％酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用浓度0.1mol/L氢氧化钠标准水溶液滴定至微红色在1min内不消失为止。消耗0.1mol/L氢氧化钠标准水溶液毫升数除以样品重量，再乘以 100，得到酸度(°T)。
四、ACE抑制率测定方法
测定步骤如下：
a、将发酵液以4500g离心10min，上清液用10mol/L NaOH溶液将其pH调节至8.3，接着以12000g离心10min，得到的上清液用于ACE抑制活性的测定。
b、将马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)和血管紧张素转换酶(ACE) 分别溶解于含0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液(pH 8.3) 中。在1.5mL离心管中加50μL0.010mol/L HHL和50μL待测样品，充分震荡混匀，在温度37℃下孵育2min，再加50μL0.010U/mL ACE 溶液，充分震荡混匀，在37℃下反应40min，然后在水浴中在温度85℃下加热10min，使酶失活终止反应，接着加入200μL 0.1mol/L EDTA 溶液，采用下述方法测定反应液中马尿酸含量。
c、采用RP-HPLC法测定马尿酸(Hippruic acid，HA)含量：
色谱柱：ZORBAX C18(4.6×250mm，5μm，Agilent，USA)；流动相：它由以体积计22％乙腈(含0.1％TFA)与78％去离子水(含 0.1％TFA)组成；流速：1.0mL/min；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20μL。
根据下述公式计算ACE抑制率：
ACE抑制率(％)＝([HA]c–[HA]s)/([HA]c–[HA]h×100％
式中：
[HA]c为对照样品马尿酸浓度(加缓冲液)；
[HA]s为待测样品的马尿酸浓度；
[HA]h为HHL标准品中所含马尿酸浓度。
五、生物活性肽Val-Pro-Pro(VPP)和Ile-Pro-Pro(IPP)测定方法
测定步骤如下：
a、样品处理：
将4500g制备的褐色活性乳饮料样品离心10min，移取4ml上清液，使用10MNaOH水溶液将其pH调节至8.3，添加16ml色谱纯乙腈，摇匀，在12000rpm下离心10min，取上清液浓缩，再加13％乙腈溶液复溶，在下述的条件下测定上清液(pH8.3)中的VPP和IPP含量：
仪器：目前市场上销售的液质联用仪(LC-ESI-MS/MS)；
色谱条件：色谱柱：CAPCELL PAK C18(MG，2.0×100mm，5μm，资生堂，日本)；流速：0.2mL/min；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含有以体积计0.1％三氟乙酸的去离子水；流动相B：含有以体积计0.1％三氟乙酸乙腈的去离子水；梯度洗脱(B％)：0min(5％)—25min(35％)—25.5min(100％)—35min (100％)—35.5min(5％)—45min(5％)。
ESI-MS/MS条件：POSITIVE MODE，Shealth gas flow rate：35 arb； Aux/sweepgas flow rate：5 arb；I spray voltage：5.50 Kv；Capillary temp： 300℃；Capillaryvoltage：16Kv；二级碰撞能量为30％；碎片扫描范围为100-400m/z。
采用上述检测方法检测得到，所述的褐色活性乳酸菌饮料在1～28天储藏期内，含有1.72×108cfu/ml～3.84×108cfu/ml瑞士乳杆菌 H11活菌，pH值为3.51～3.60，滴定酸度为56.10～63.53°T，ACE抑制率为60.97％～70.13％，生物活性肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的含量分别为1.10～1.34μM和0.19～0.28μM。
[有益效果]
本发明的有益效果如下：
(1)本发明瑞士乳杆菌H11具有较快的发酵速率；
(2)本发明瑞士乳杆菌H11在模拟胃肠液中有较高的存活率；
(3)本发明瑞士乳杆菌H11为胆盐微耐受菌株；
(4)含有本发明瑞士乳杆菌H11的褐色活性乳酸菌饮料在温度 4℃下储藏1～28天期间，活菌数(3.96×108cfu/ml～5.87× 108cfu/ml)、pH值(3.59～3.68)、滴定酸度(52.60～54.13°T)无明显变化，具有良好的储藏稳定性。
(5)本发明褐色活性乳酸菌饮料的ACE抑制率可以达到 60.97％～70.13％，生物活性肽Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的含量分别可以达到1.10～1.34μM和0.19～0.28μM，显著高于商业化菌株副干酪乳杆菌LC-01。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)H11菌株已于2018年8月 30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.16405。
【附图说明】
图1是本发明瑞士乳杆菌H11系统发育树状图；
图2是本发明瑞士乳杆菌H11菌落形态图；
图3是本发明瑞士乳杆菌H11菌体显微镜图(X1000)；
图4是含有本发明瑞士乳杆菌H11与商业化菌株副干酪乳杆菌 LC-01褐色活性乳酸菌饮料在温度4℃下储藏期间活菌数变化图。
图5是含有本发明瑞士乳杆菌H11和商业化菌株副干酪乳杆菌 LC-01褐色活性乳酸菌饮料在温度4℃下储藏期间pH值变化图。
图6是含有本发明瑞士乳杆菌H11和商业化菌株副干酪乳杆菌 LC-01的褐色活性乳酸菌饮料在温度4℃下储藏期间滴定酸度变化图。
图7是含有本发明瑞士乳杆菌H11和商业化菌株副干酪乳杆菌 LC-01的褐色活性乳酸菌饮料在温度4℃下储藏期间ACE抑制率变化图。
图8是含有本发明瑞士乳杆菌H11和商业化菌株LC-01褐色活性乳饮料在温度4℃下储藏期间生物活性肽Val-Pro-Pro含量变化图。
图9是含有本发明瑞士乳杆菌H11和商业化菌株LC-01褐色活性乳饮料在温度4℃下储藏期间生物活性肽Ile-Pro-Pro含量变化图。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明褐色活性乳饮料的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/L MgSO4·7H2O、 50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌 10min，得到所述的MRS培养基；
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤2次，然后把洗涤的菌体悬浮于6ml灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计1％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养18h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将13重量份低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉与2 重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度62℃，接着在均质压力20MPa的条件下均质化处理21min，与在温度115℃的条件下灭菌褐变处理8min，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照5×106cfu/ml接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养30h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:10:62混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
采用本说明书描述的方法检测，该实施例制备的褐色活性乳酸菌饮料含有1.72×108cfu/ml瑞士乳杆菌H11，它的pH值是3.51；在储藏期间的血管紧张素转换酶抑制率是65.24％；生物活性肽Val-Pro-Pro 的含量是1.22μM；Ile-Pro-Pro的含量是0.19μM。
实施例2：本发明褐色活性乳饮料的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/L MgSO4·7H2O、 50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌 10min，得到所述的MRS培养基；
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤3次，然后把洗涤的菌体悬浮于4ml灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计3％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养16h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将8重量份低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉与1.5 重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度64℃，接着在均质压力16MPa的条件下均质化处理35min，与在温度115℃的条件下灭菌褐变处理10min，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照4×106cfu/ml接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养40h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:13:56混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
采用本说明书描述的方法检测，该实施例制备的褐色活性乳酸菌饮料含有2.68×108cfu/ml瑞士乳杆菌H11，它的pH值是3.60；在储藏期间的血管紧张素转换酶抑制率是60.97％；生物活性肽Val-Pro-Pro 的含量是1.10μM；Ile-Pro-Pro的含量是0.28μM。
实施例3：本发明褐色活性乳饮料的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/L NaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/L MgSO4·7H2O、 50mg/L MnSO4·5H2O与1g/L Tween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌 10min，得到所述的MRS培养基；
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤3次，然后把洗涤的菌体悬浮于8ml灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计2％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养20h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将16重量份低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉与2.5 重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度65℃，接着在均质压力25MPa的条件下均质化处理14min，与在温度115℃的条件下灭菌褐变处理12min，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照6×106cfu/ml接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养35h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:15:68混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
采用本说明书描述的方法检测，该实施例制备的褐色活性乳酸菌饮料含有3.84×108cfu/ml瑞士乳杆菌H11，它的pH值是3.56；在储藏期间的血管紧张素转换酶抑制率是70.13％；生物活性肽Val-Pro-Pro 的含量是1.34μM；Ile-Pro-Pro的含量是0.24μM。
试验实施例1：本发明褐色活性乳酸菌饮料的储藏稳定性
该试验实施例的实施方式如下：
实施例1制备的褐色活性乳酸菌饮料储藏在冰箱冷藏室内在温度 4℃的条件下储藏28天。根据本说明书描述的检测方法检测所述褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的pH值、滴定酸度与活菌数变化，确定其储藏稳定性。
本发明褐色活性乳酸菌饮料储藏稳定性检测结果列于表1-6与附图4-9。
表1：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的活菌数检测结果(108cfu/ml)
表2：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的pH值检测结果
表3：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的滴定酸度检测结果(°T)
表4：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的ACE抑制率(％)检测结果
表5：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的VPP含量(μM)检测结果
表6：本发明发酵褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的IPP含量(μM)检测结果
表1-6与附图4-9的结果清楚表明，本发明褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的pH值变化呈降低趋势，滴定酸度呈上升趋势，但变化平稳；活菌数无显著变化，且均在108cfu/ml以上；ACE抑制率和VPP、 IPP含量显著高于对照组。这些试验结果表明，由瑞士乳杆菌H11发酵制备的褐色活性乳酸菌饮料具有良好的储藏稳定性。
试验实施例2：瑞士乳杆菌H11对人工模拟胃肠液耐受性试验
试验实施例的实施方式如下：
制备人工模拟胃肠液：
使用浓度1mol/L盐酸溶液将灭菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)的 pH值调节至2.5，然后加入胃蛋白酶，达到其浓度为3.0mg/ml，接着使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到人工模拟胃液；使用浓度为0.1mol/L NaOH溶液将灭菌PBS的pH值调节至8.0，加入胰蛋白酶，达到其浓度为以重量计0.1％，加入牛胆汁，达到其浓度为以重量计 1.8％，接着使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到人工模拟肠液。
测定活菌数：
将复筛菌株活化培养两代，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5ml灭菌生理盐水中制成菌悬液。将1ml所述菌悬液加到 9ml pH值为2.5的人工模拟胃液中，在温度37℃下培养3h，于0、3h 分别取样，采用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。然后取1ml已消化3h的含菌人工模拟胃液，加到9ml人工模拟肠液中，继续在温度37℃下培养，并分别于0、4、8h采用MRS琼脂培养基倾注法测定活菌数。
根据下述公式计算菌株的存活率：
式中：
N1代表菌株处理后的活菌数；
N0代表菌株初始活菌数。
测定结果列于表7中。
表7：瑞士乳杆菌H11人工模拟胃肠液耐受性试验结果
本发明瑞士乳杆菌H11在人工模拟胃肠液中的存活率如表7所示。在模拟胃液(pH2.5)条件下瑞士乳杆菌H11在3h时的存活率为 95.55％，对模拟胃液有一定的耐受性；转入pH8.0的人工肠液中在4 h时的存活率为97.33％，在8h时存活率为97.71％，这些试验结果充分证明瑞士乳杆菌H11具有较好的胃肠液耐受性。
试验实施例3：瑞士乳杆菌H11褐变脱脂乳液发酵时间测定
将瑞士乳杆菌H11活化培养两代，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5ml灭菌生理盐水中制成菌悬液，以脱脂乳液重量计 2％传代接种于100mL浓度为以重量计10％的脱脂乳液中，在温度 37℃下培养12h，计活菌数。瑞士乳杆菌H11和对照菌株商业化发酵剂副干酪乳杆菌LC-01均按照5×106cfu/ml分别接种于3瓶100g褐变脱脂乳液中，在水浴中在温度37℃下培养30min，然后在恒温培养箱中在温度37℃下发酵至TA为200°T，确定发酵时间。其中，褐变脱脂乳为13重量份脱脂乳粉和2重量份葡萄糖完全溶解于100重量份温度45℃的软化水中，静置30min，在温度115℃下灭菌10min褐变制得。试验结果列于表8中。
表8：由瑞士乳杆菌H11制备褐变脱脂乳液的发酵时间
表8的结果表明，相同接种量的瑞士乳杆菌H11和对照菌株副干酪乳杆菌LC-01发酵至酸度200°T的时间分别为35h和66h。瑞士乳杆菌H11的发酵速度显著高于对照菌株，将其应用于活性乳酸菌饮料的制备可以显著缩短发酵时间，降低成本。
试验实施例4：产品口味程度测试
尽管乳酸菌或乳杆菌均可用于制备发酵饮料，然而，不同的乳酸菌/乳杆菌制备得到的发酵饮料存在较大风味差异，饮料风味是决定其是否适用于商业化制备发酵饮料的重要因素，因此，本发明对瑞士乳杆菌H11发酵饮料进行感官评定。
取上述实施例3所制备的瑞士乳杆菌H11和对照菌株商业化发酵剂副干酪乳杆菌LC-01的发酵乳饮料产品以贮藏0d，7d，14d，21d 和28d作为实验对象，进行产品口味测试，测试人数25人。品尝方式：采用不记名方式进行品尝，分别对两组发酵乳饮料产品进行口感、滋味、色泽和状态进行单独打分，口感和状态满分20分，滋味和色泽满分30分，计算平均分及总分，统计结果记录于表9。
表9：产品口味测试结果数据统计表
从产品口味测试的统计结果可以看出，本发明通过瑞士乳杆菌 H11所制得的发酵乳饮料不仅富含降血压活性肽，而且其口感、滋味、色泽和状态方面与商业化菌株LC-01的发酵饮品品相接近，具有良好的口感、滋味和香气，可被大部分消费者所接受，因此适用于商业化应用和推广。

Claims (10)

1.一种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)H11，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo 16405。
2.根据权利要求1所述的瑞士乳杆菌H11在制备褐色活性乳饮料中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的褐色活性乳饮料制备步骤如下：
A、MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖、10g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L牛肉膏、5g/LNaAc、2g/LK2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、200mg/LMgSO4·7H2O、50mg/LMnSO4·5H2O与1g/LTween-80称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度115℃下灭菌10min，得到所述的MRS培养基；
B、活化菌株
将冷冻保存的瑞士乳杆菌H11菌株接种到MRS培养基中，震荡混匀，在温度37℃的条件下恒温培养24h，以相同方式连续活化两代，再用灭菌生理盐水离心洗涤2～3次，然后把洗涤的菌体悬浮于4～8ml灭菌生理盐水中，制成一种菌悬液；
C、菌株培养
按照以MRS培养基重量计1～3％接种量，把步骤B得到的菌悬液添加到步骤A得到的MRS培养基中，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养16～20h，得到瑞士乳杆菌H11培养液；
D、制备含葡萄糖的脱脂乳液
将8～16重量份脱脂乳粉与1.5～2.5重量份葡萄糖混合均匀，溶解于软化水中，再用这种软化水补充至总量为100重量份，加热至温度62～65℃，接着均质化处理与灭菌褐变处理，然后冷却至温度37℃以下，得到含葡萄糖的脱脂乳液；
E、制备褐色活性乳酸菌饮料
将步骤C得到的瑞士乳杆菌H11的培养液按照4～6×106cfu/ml接种于步骤D得到的含葡萄糖脱脂乳液中，混合均匀，在恒温培养箱中在温度37℃的条件下培养30～40h，然后取出急冷，再将其与白砂糖和软化水按照重量比25:10～15:56～68混合配制成褐色活性乳酸菌饮料。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，脱脂乳粉与葡萄糖的重量比是13：2。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于在步骤D中，所述的脱脂乳粉是低热脱脂乳粉、中热脱脂乳粉或高热脱脂乳粉。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，含葡萄糖的脱脂乳粉溶液在均质压力16～25MPa的条件下均质化处理14～35min，接着在温度115℃的条件下灭菌褐变处理8～12min。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤E中，接种的含葡萄糖脱脂乳液在温度37℃的条件下培养35h。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤E中，所述褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的pH值是3.51～3.60，滴定酸度为56.10～63.53°T。
9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤E中，所述褐色活性乳酸菌饮料在储藏期间的血管紧张素转换酶抑制率是60.97％～70.13％；生物活性肽Val-Pro-Pro的含量是1.10～1.34μM；Ile-Pro-Pro的含量是0.19～0.28μM。
10.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤E中，所述的褐色活性乳在储藏期间含有1.72×108cfu/g～3.84×108cfu/ml瑞士乳杆菌H11。
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