CN117070414A - 一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌及其在奶粉中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌及其在奶粉中的应用，该菌株为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD‑3，已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2023479。所述瑞士乳杆菌KD‑3具有镉抗性基因czcD、铬抗性基因chrA和铅抗性基因pbrT，能耐受单一及复合的重金属(镉、铬和铅)，同时对单一及复合的重金属(镉、铬和铅)去除效率高。本发明瑞士乳杆菌KD‑3可以用于制备冻干菌粉，利用其开发了瑞士乳杆菌KD‑3羊奶粉，菌粉及其羊奶粉均能有效去除重金属。

Description

一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌及其在奶粉中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌及其在奶粉中的应用。
背景技术
重金属是全球污染最严重的物质之一，其可通过食物链进入人体，给人类带来健康隐患。重金属污染的处理方法有许多种，简单的物理化学方法无法高效的除去环境中的铅、镉、铬等重金属离子。微生物处理具有处理能力强、适应环境能力强、低成本且环境友好等明显优势。
迄今为止，已经发现了几种微生物制剂(细菌、真菌和微藻类)作为生物清除方法。乳酸菌作为食品安全级微生物在人体肠道中发挥着重要作用。基于乳酸菌的重金属清除技术越来越被研究者重视。现有技术中，乳酸菌可通过表面吸附和体内蓄积等作用有效清除食品中的重金属，目前研究集中在筛选去除单一重金属的乳酸菌，如L.plantarumCICC21805可以清除大米中的镉，清除效率为85.73％；L.plantarum CCFM8610可以清除水溶液中的镉，清除效率为31.34％；E.faecium EF031能够清除水溶液中的铅，清除效率为66.9％；E.faecium JT1能够清除水溶液中的铅，清除效率为66.95％；L.plantarum TW1-1能够清除小鼠胃肠液中的铬。但环境及食品中污染经常存在污染多种重金属的情况，因此筛选对多种重金属同时具有耐受和去除能力的乳酸菌很有必要。
发明内容
本发明的目的提供一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌及其在奶粉中的应用，所述瑞士乳杆菌KD-3能耐受单一及复合的重金属(镉、铬和铅)，对单一及复合的重金属(镉、铬和铅)去除效率高。
本发明提供了一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3，该菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2023479。
优选的，所述瑞士乳杆菌KD-3培养时应用的培养基包括MRS肉汤液体培养基，所述培养的pH值为5～8，培养的温度为37～40℃，培养时的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％；所述瑞士乳杆菌KD-3能够耐受质量浓度为2％的NaCl溶液。
本发明提供了上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3在用于去除重金属镉、铬和铅中的应用。
优选的，所述应用包括：将所述瑞士乳杆菌KD-3接种在含有镉、铬和铅的MRS肉汤液体培养基中进行培养，去除MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅；所述培养时瑞士乳杆菌KD-3的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％，培养的温度为37～40℃，pH值为5～8，培养的时间为24h；
或者，
将所述瑞士乳杆菌KD-3的菌体直接与含镉和铅的溶液或单独含铬的溶液混合后进行吸附；
所述瑞士乳杆菌KD-3的菌体的制备包括：瑞士乳杆菌KD-3按照上述技术方案所述的培养条件培养后得到培养液，培养液在4℃下离心后得到菌体，所述菌体利用无菌生理盐水洗涤2次后得到菌体。
优选的，MRS肉汤液体培养基中的Pb2+的浓度为≤1500mg/L，MRS肉汤液体培养基中的Cd2+浓度为≤150mg/L，MRS肉汤液体培养基中的Cr6+浓度为≤1500mg/L；
当所述MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅含量均为60mg/L时，瑞士乳杆菌KD-3对镉的去除率为37.54±0.85％，吸附量为159mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铬的去除率为60.44±1.28％，吸附量为207mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铅的去除率为34.01±0.12％，吸附量为142mg/g。
优选的，当瑞士乳杆菌KD-3菌体的添加量为含镉和铅的溶液体积的5～7‰，溶液的pH值为6.5～7.5，吸附温度为35～45℃和吸附时间为1.5～3.5h时，含镉和铅的溶液中镉的清除率为36.50％～65.67％，铅的清除率为72.45％～94.17％；
当瑞士乳杆菌KD-3菌体添加量单独含铬的溶液体积的2～10‰，溶液的pH值为2～4，吸附温度为32～37℃和吸附时间为3～4h时，铬的清除率为24.08％～57.16％。
本发明提供了上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3在制备具有抗氧化性的产品或提高乳酸产量中的应用。
本发明提供了一种去除重金属污染的清除剂，包括上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3的活菌体、死菌体或添加保护剂的冻干粉。
本发明提供了一种去除重金属的功能性益生菌奶粉，所述功能性益生菌奶粉中包括将上述技术方案所述瑞士乳杆菌KD-3制备的冻干粉。
优选的，所述功能性益生菌奶粉中的瑞士乳杆菌KD-3的有效活菌数为≥3.0×107CFU/g。
本发明的有益效果：本发明提供了一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3，该菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2023479。所述瑞士乳杆菌KD-3具有镉抗性基因czcD、铬抗性基因chrA和铅抗性基因pbrT，能耐受单一及复合的重金属(镉、铬和铅)，同时对单一及复合的重金属(镉、铬和铅)去除效率高。本发明提供的是瑞士乳杆菌KD-3可以用于制备冻干菌粉，利用其开发了瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉，菌粉及其羊奶粉均能有效去除重金属。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。注：图1、3、4～6、9～10中不同字母标注代表组间具有显著性差异，p<0.05。
图1为抗铅乳酸菌筛选结果；
图2为高浓度铬盐对9株乳酸菌生长的影响；
图3为乳酸菌在60mg/L镉浓度下的吸附情况；
图4为乳酸菌在60mg/L金属浓度下的铅吸附情况；
图5为不同菌株在60mg/L金属浓度下的铬吸附情况；
图6为不同菌株的DPPH清除率和乳酸产量；
图7为三种重金属抗性基因的PCR扩增结果，其中1、2、3、4、5分别表示菌株KD-3、S7、S8、S5、S2；
图8为三种抗性基因的扩增曲线(左侧)与溶解曲线(右侧)，其中a代表chrA；b代表czcD；c代表pbrT)；
图9为镉抗性基因在乳酸菌中的绝对定量表达水平；
图10为铬抗性基因在乳酸菌中的绝对定量表达水平；
图11为瑞士乳杆菌KD-3菌落形态；
图12为扫描电镜下的瑞士乳杆菌KD-3菌体表面微观形态；
图13为瑞士乳杆菌KD-3的系统发育树；
图14为温度对L.helveticus KD-3吸附重金属的影响；
图15为不同菌体添加量对L.helveticus KD-3吸附重金属的影响；
图16为不同吸附时间对L.helveticus KD-3吸附重金属的影响；
图17为不同起始pH值对L.helveticus KD-3吸附重金属的影响；
图18为不同状态的瑞士乳杆菌KD-3对吸附铅镉的影响；
图19为瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉对模拟胃肠液中铅镉的清除。
生物保藏证明
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3，于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023479，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
具体实施方式
本发明提供了一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3，保藏编号为CCTCC NO：M2023479。本发明所述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)KD-3的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1序列：ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCAGA ACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTAGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAATAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAATTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATCCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAA AGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAGATGACTGGG。
本发明所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3从乳开菲尔粒中筛选得到，菌落呈乳白色凸起状，外表较为光滑，细胞形态符合典型的乳酸菌形态特征。扫描电镜结果显示菌体表面光滑无异物，杆状饱满。显微镜观察为杆状。
本发明利用菌株KD-3的16S rDNA序列与NCBI数据库中的数据进行比对，初步确定菌株的分类信息，构建菌株KD-3的系统发育树，鉴定结果表明菌株KD-3为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株。
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3具有镉抗性基因czcD、铬抗性基因chrA和铅抗性基因pbrT，能耐受单一及复合的重金属(镉、铬和铅)，同时对单一及复合的重金属(镉、铬和铅)去除效率高。所述瑞士乳杆菌KD-3的DPPH自由基清除率高及乳酸产量高。
在本发明中，所述瑞士乳杆菌KD-3培养时应用的培养基优选包括MRS肉汤液体培养基，所述培养的pH值优选为5～8，更优选为7；培养的温度优选为37～40℃，更优选为37℃；所述培养时的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％，更优选为3％；所述瑞士乳杆菌KD-3能够耐受质量浓度为2％的NaCl溶液。
本发明提供了上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3或上述技术方案所述的菌剂在用于去除重金属镉、铬和铅中的应用。本发明中所述重金属镉、铬和铅通均是指含有重金属镉、铬和铅的化合物，未涉及重金属单质。
在本发明中，所述应用优选包括所述瑞士乳杆菌KD-3接种在含有镉、铬和铅的MRS肉汤液体培养基中进行培养，去除MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅；所述培养时瑞士乳杆菌KD-3的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％，培养的温度为37～40℃，pH值为5～8，培养的时间为24～48h；
或者，
将所述瑞士乳杆菌KD-3菌体直接与含镉和铅的溶液或单独含铬的溶液混合后进行吸附；
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3菌体的制备包括：将所述瑞士乳杆菌KD-3接种于MRS肉汤液体培养基中进行培养，得到瑞士乳杆菌KD-3发酵液，所述发酵液离心后收集菌体，所述菌体利用无菌生理盐水洗涤2次再次离心得到菌体。本发明所述生理盐水洗涤次数优选为2次。本发明所述培养的温度优选为37～40℃；所述培养的时间优选为24h。本发明所述离心的时间优选为9～11min，更优选为10min；所述离心的转速优选为7800～8200rpm，更优选为8000rpm。本发明所述洗涤优选利用无菌生理盐水洗涤2次完成。
在本发明中，所述MRS肉汤液体培养基中的Pb2+的浓度优选为≤1500mg/L，更优选为1500mg/L；MRS肉汤液体培养基中的Cd2+浓度优选为≤150mg/L，更优选为150mg/L；MRS肉汤液体培养基中的Cr6+浓度优选为≤1500mg/L，更优选为1500mg/L。
在本发明实施例中，当所述MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅含量均为60mg/L时，瑞士乳杆菌KD-3对镉的去除率为37.54±0.85％，吸附量为159mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铬的去除率为60.44±1.28％，吸附量为207mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铅的去除率为34.01±0.12％，吸附量为142mg/g。
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3在同时添加Pb2+浓度1500mg/L、Cd2+150mg/L、Cr6+1500mg/L的MRS肉汤琼脂培养基上能生长良好，其菌落数为10～100个，在同时添加Pb2+浓度1000mg/L、Cd2+100mg/L、Cr6+1000mg/L的MRS琼脂培养基上生长情况优秀，其菌落数为100～300个。
本发明将所述瑞士乳杆菌KD-3菌体直接与含镉和铅的溶液或单独含铬的溶液混合后进行吸附。本发明所述含镉和铅的溶液优选为含镉的化合物和含铅的化合物利用溶剂水直接配制的溶液。本发明所述含镉和铅的溶液中的镉的浓度优选为100mg/L，铅的浓度优选为100mg/L。本发明所述含镉和铅的溶液优选为含镉的化合物和含铅的化合物利用溶剂水直接配制的溶液。
本发明所述单独含铬的溶液优选为含铬的化合物利用溶剂水直接配制的溶液。本发明所述含铬的溶液中的铬的浓度优选为100mg/L。
在本发明实施例中，瑞士乳杆菌KD-3菌体的添加量为含镉和铅的溶液体积的5～7‰，溶液的pH值为6.5～7.5，吸附温度为35～45℃和吸附时间为1.5～3.5h时，含镉和铅的溶液中镉的清除率为36.50％～65.67％，铅的清除率为72.45％～94.17％；在本发明实施例中，当瑞士乳杆菌KD-3菌体的添加量为单独含铬的溶液体积的2～10‰，溶液的pH值为2～4，吸附温度为32～37℃和吸附时间为3～4h时，铬的清除率为24.08％～57.16％。
当所述瑞士乳杆菌KD-3菌体吸附镉离子时，吸附温度优选为40℃，镉清除率最大为29.08±1.13％；吸附铅离子时，吸附温度优选为37℃，铅离子清除率最大值75.88±2.54％；吸附铬离子时，吸附温度优选为32℃，铬离子清除率最大值为38.85±1.45％。
本发明瑞士乳杆菌KD-3菌体的吸附pH值优选为4～7，更优选为5～6。当吸附镉离子时，pH值优选为7；吸附铅离子时，pH值优选为6；吸附铬离子时，pH值优选为4。
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3菌体的吸附时间优选为1～3h，更优选为3h。当吸附镉离子时，吸附时间优选为3h；当吸附铅离子时，吸附时间优选为2h；当吸附铬离子时，吸附时间优选为3h。
当所述瑞士乳杆菌KD-3菌体吸附镉离子时，菌体的添加量优选为含镉和铅的溶液体积的6‰；吸附铅离子时，菌体的添加量优选为含镉和铅的溶液体积的6‰；吸附铬离子时，菌体的添加量优选为含铬的溶液体积的8‰。菌体的添加量优选为含镉和铅的溶液体积的6‰时铅和镉离子清除率最大值分别为65.87±1.55％和28.64±0.48％；菌体的添加量优选为含铬的溶液体积的8‰时，对铬离子的清除率最大值46.74±1.52％。
在本发明实施例中，瑞士乳杆菌KD-3按照MRS肉汤液体培养基体积5％的接种量接种在MRS肉汤液体培养基中，该MRS肉汤液体培养基中的镉、铬和铅浓度均为60mg/L；瑞士乳杆菌KD-3菌体吸附去除重金属溶液中的铅、镉、铬，铅离子、镉离子和铬离子浓度均为100mg/L；这些重金属的浓度已经远高于自然界中实际样品中的重金属浓度，说明本发明的瑞士乳杆菌KD-3对重金属的吸附效果好。
本发明提供了上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3在制备具有抗氧化性的产品或提高乳酸产量中的应用。
本发明提供了一种去除重金属污染的清除剂，包括上述技术方案所述的瑞士乳杆菌KD-3的活菌体、死菌体或添加保护剂的冻干粉。
本发明所述冻干粉的制备方法优选包括：将所述瑞士乳杆菌KD-3菌体离心、洗涤后得到菌体，所述菌体与保护剂混合后进行真空冷冻干燥得到瑞士乳杆菌KD-3冻干粉。所述瑞士乳杆菌KD-3菌体的制备方法在上文已经论述，在此不再赘述。本发明所述保护剂添加时优选先将对应质量的葡萄糖、D-半乳糖、抗坏血酸溶解到无菌水中即得保护剂溶液，以此溶液的体积为标准，再与菌体混合。本发明所述菌体与保护剂溶液混合时优选按质量体积比1:1混合。本发明所述保护剂优选为添加了葡萄糖，D-半乳糖，抗坏血酸的磷酸缓冲液，所述葡萄糖、D-半乳糖、抗坏血酸的添加量分别为菌体重量的2％、2.5％和0.1％。本发明所述真空冷冻干燥的参数优选为放入-35℃环境中预冻5h，然后再-55℃真空度5pa冻干24h。
当清除剂的有效成分为瑞士乳杆菌KD-3的死菌体，所述清除剂中瑞士乳杆菌KD-3的死菌体的添加量为0.5g/L。
当清除剂中的有效成分为瑞士乳杆菌KD-3的活菌体或冻干粉时，本发明所述清除剂中的瑞士乳杆菌KD-3的活菌数为≥1×1011CFU/g，更优选为3.25×1011CFU/g。本发明所述清除剂可以应用在含有重金属污染的水样或者食品中。
本发明所述清除剂的工作温度优选为32～40℃，进一步优选为34～38℃，更优选为36～37℃。
本发明提供了一种去除重金属的功能性益生菌奶粉，所述功能性益生菌奶粉中包括上述技术方案所述的瑞士乳杆菌D-3制备的冻干粉。
本发明所述冻干粉中的瑞士乳杆菌KD-3的活菌数优选为≥1×1011CFU/g，更优选为1×1011CFU/g。本发明所述功能性益生菌奶粉中的瑞士乳杆菌D-3的有效活菌数为≥3×107CFU/g，更优选为3.25×107CFU/g。本发明所述奶粉优选包括山羊奶粉、牛奶粉、绵羊奶粉和骆驼奶粉。
本发明所述去除重金属功能性奶粉食用后可以清除人体中的镉、铬和铅。本发明所述去除重金属功能性奶粉优选包括瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉。本发明所述瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉的制备方法优选包括瑞士乳杆菌KD-3冻干粉与羊奶粉在无菌条件下按等量递增混合后得到。
在本发明实施例中所述功能性益生菌奶粉中的瑞士乳杆菌KD-3有效活菌数优选为3.25×107CFU/g。
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉在人工肠液环境中对铅镉的清除率较高，分别达到了56.31±1.72％和23.87±1.97％；所述瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉在人工胃液中铅镉清除率较低，分别为24.12±1.34％和12.02±0.98％。
本发明所述瑞士乳杆菌KD-3直接添加在冲调食品中可以吸附食品中的重金属，食品食用后可以清除人体中的镉、铬和铅，重金属被吸附到益生菌菌体上随粪便排出。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中添加铅离子Pb2+应用的化合物为硝酸铅；添加铬(Cr6+)应用的化合物为重铬酸钾，添加镉(Cd2+)应用的化合物为硝酸镉。MRS肉汤液体培养基和MRS肉汤琼脂培养基均为市售产品。本发明所述镉清除率均为镉离子清除率；铅清除率均为铅离子清除率，铬清除率均为铬离子清除率。
实施例1瑞士乳杆菌KD-3的分离、筛选及鉴定
1.瑞士乳杆菌KD-3分离
在超净工作台中，将购自辽宁抚顺的乳开菲尔粒无菌条件下搅碎，以添加硝酸镉(添加量为60mg/kg)的MRS琼脂培养基(乳酸菌鉴别培养基)为筛选培养基，采用平板分离法从中筛选获得了对镉有抗性的9株菌株，由于该9株菌株利用乳酸菌鉴别培养基分离得到，并进行了菌落形态及革兰氏染色的初步判断，判定该9株菌株均为乳酸菌，分别命名为S1、KD-3、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8。
2.抗铅乳酸菌筛选
(1)将步骤1得到的S1、KD-3、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8共9株抗镉乳酸菌菌株分离纯化培养，得到单菌落；
(2)将硝酸铅(铅离子Pb2+)母液稀释加入10mL不同的MRS肉汤液体培养基中，具体为：
处理1：配制铅终浓度为60mg/L的含铅MRS肉汤液体培养基；
处理2：配制铅终浓度为80mg/L的含铅MRS肉汤液体培养基；
(3)步骤(1)培养好的9株抗镉乳酸菌的单菌落分别接入处理1～处理2的培养基中，监测乳酸菌生长第0h、12h、15h、18h的培养基的pH值动态变化，并采用稀释涂布平板法测定各测试菌株在高浓度铅离子环境中培养24h后的活菌数，判断不同种类的乳酸菌对铅离子的抗性。
释涂布平板法：将处理1～处理3的培养24h后的菌液制成均匀的稀释液，用无菌注射器取1mL，均匀涂布于MRS琼脂培养基上，48h后进行活菌计数，其中S1的活菌数为(16±1.93)×108CFU/mL、S2的活菌数为(2±0.38)×108CFU/mL、S3的活菌数为(6±1.06)×108CFU/mL、S4的活菌数为(48±3.72)×108CFU/mL、S5的活菌数为(5±1.06)×108CFU/mL、S6的活菌数为(3±0.48)×108CFU/mL、S7的活菌数为(10±2.09)×108CFU/mL、S8的活菌数为(29±3.02)×108CFU/mL、KD-3的活菌数为(76±4.31)×108CFU/mL。结果见如图1所示。由图1可知，KD-3、S4、S8这3株乳酸菌对Pb2+抗性较好，S2和S6这两株菌相对较差，但是在高浓度铅的平板上均有菌落生长，说明乳酸菌有自动调节机制去减除Pb2+对菌体的损伤，因此，将9株菌全部用于Cr6+抗性筛选试验。
3.抗铬(Cr6+)乳酸菌筛选
处理组1：将步骤1的抗镉的9株乳酸菌分别接种于含重铬酸钾的MRS肉汤液体培养基中进行培养，MRS肉汤液体培养基的铬离子浓度为300mg/L；
处理组2：将上述抗镉的9株乳酸菌分别接种于含重铬酸钾的MRS肉汤液体培养基中进行培养，MRS肉汤液体培养基的铬离子浓度为500mg/L；
对照组：将上述抗镉的9株乳酸菌分别接种于不含铬的MRS肉汤液体培养基中进行培养。
处理组1、处理组2、对照组培养24h后测定所得培养液的OD600值，计算抑菌率。
抑制率(％)＝100％×[1-OD600(样品)/OD600(空白对照)]
结果见图2，除S1外，其余菌株在高铬浓度(500mg/L)中的生长均被显著抑制，抑制率达70％以上；低铬浓度(300mg/L)下，各菌株对铬的抗性显示出了显著的差异性，低铬浓度(300mg/L)下，菌株S1、S2、S3、KD-3、S4、S5、S6、S7、S8的铬抑制率分别为9.34±0.7％、53.54±1.2％、63.13±1.1％、32.79±0.89％、21.4±0.72％、61.73±0.65％、64.69±0.53％、40.98±0.47、64.15±0.76，在高铬浓度(500mg/L)下，菌株S1、S2、S3、KD-3、S4、S5、S6、S7、S8的铬抑制率分别为12.65±0.7％、69.72±1.2％、67.95±1.1％、66.26±0.89％、73.94±0.72％、72.87±0.65％、72.48±0.53％、78.19±0.47％、73.97±0.76％，低铬浓度(300mg/L)下，其中编号为S1、KD-3、S4的3株菌抑制率低于40％，显示出了良好的铬抗性。
4.复合重金属抗性菌株最小抑菌浓度(MIC)测定
培养基为MRS肉汤液体培养基中添加不同浓度的重金属Cd2+、Pb2+、Cr6+配制得到。培养基的组成见表1中的培养基1～培养基5。
分别选取S1、KD-3、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8细菌培养液，稀释一定的倍数后取1mL涂布于培养基1～培养基5平板上，48h后活菌计数观察生长情况，结果见表1。根据表1可知，在培养基5的复合金属环境下，Pb2+、Cd2+、Cr6+浓度分别为1500mg/L、150mg/L、1500mg/L，仅编号为S8、S2、KD-3的3株菌可以生长。由于KD-3在培养基5中培养得到的菌落数多于S8，综合最小抑菌浓度得出9株菌对复合重金属的耐受性顺序为：KD-3、S8、S2、S4、S5、S1、S3、S7、S6。S3和S6在培养液中未生长，因此，初筛的抗性菌株为KD-3、S8、S2、S4、S5、S1、S7。
表1复合重金属对抗性菌株的MIC结果
注：“+++”表示菌落数达到100～300CFU/mL；“++”表示菌落数在10～100CFU/mL；“+”表示菌落数在0～10CFU/mL；“-”代表平板上无菌落生长。
5.抗性菌株的重金属吸附性能测试
利用原子吸收光谱法(AAS)分别对筛选出的抗性菌株的单一重金属吸附能力进行测试。
(1)三种重金属标准曲线的绘制
镉(Cd2+)标准曲线：1000mg/L的镉标准溶液取37.5μL，定容到50mL，即为0.75mg/L的镉溶液；分别取上述镉溶液8、6、4、2mL加入2、4、6、8mL超纯水中，定容至10mL，配制得到浓度分别为0.6、0.45、0.3、0.15mg/L的样品，用火焰原子分光光度计测定吸光度，绘制镉标准曲线。镉标准曲线：y＝0.0463x-0.0023，R2＝0.9994。
铅(Pb2+)标准曲线：取1000μg/mL的铅标准溶液1mL，加入9mL水，配制成100mg/L的铅溶液，从中分别取2、1.6、1.2、0.8、0.4mL，加入8、8.4、8.8、9.2、9.6mL水，配制成为20、16、12、8、4mg/L的铅离子系列溶液，测定吸光度，绘制铅标准曲线。铅标准曲线：y＝0.0209x-0.0037，R2＝0.9986。
铬(Cr6+)标准曲线：取1000μg/mL的铬标准液125μL加水定容至50mL，即为2.5mg/L的铬离子溶液，从50mL中分别取8、6、4、2mL，加入2、4、6、8mL水，配制成2.0、1.5、1、0.5mg/L的铬系列溶液，测定吸光值，绘制铬标准曲线。铬标准曲线：y＝0.0427x-0.0023，R2＝0.9997。
(2)吸附重金属能力测定
处理组1：将初筛出的抗性菌株KD-3按照5％(v/v)的接种量分别接入含镉离子60mg/L的MRS肉汤液体培养基中，在37℃培养24h后测定培养液的pH，所得培养液在8000rpm离心10min，测定菌体质量，取离心所得上清液加入微波消解仪，加入5mL硝酸，加盖放置1h，按照仪器标准步骤依次进行消解(120℃下消解10min、150℃下消解15min、190℃下分别消解25min)，冷却后取出，再水浴锅100℃加热30min，之后用水定容到10mL。定容后取1mL加入9mL水，再在0.45μm无菌滤膜过滤后放入10mL离心管中，4℃冰箱分别保存KD-3待测样品，设置3个平行实验。S2待测样品、S4待测样品、S5待测样品、S1待测样品、S8待测样品、S7待测样品的制备同KD-3待测样品的制备方法。
以不加菌的含镉离子60mg/L的MRS肉汤液体培养基作为空白对照，设置3个平行实验。
上述菌株的待测样品通过火焰原子分光光度计测定每个样品的吸光值，每个样品3次平行，带入铅、铬、镉标准曲线中计算得到待测样品中Cd2+、Pb2+、Cr6+的残留浓度。得到残留浓度后，计算清除率和吸附量：
清除率(％)＝100×(C0-C1)/C0；吸附量＝(C0-C1)/m×V；
式中C0(mg/L)代表溶液中初始金属离子浓度；C1(mg/L)代表经过吸附后上清液中金属残留浓度；m为菌体质量(g)；V代表溶液体积(L)。
测定培养液的pH值和菌体质量，对比观察乳酸菌在结合金属过程中的生长情况。
通过原子吸收光谱测定乳酸菌在MRS肉汤液体培养基中对镉的清除率，如图3所示，菌株S5、S2、S4、S7、S1、KD-3、S8的镉清除率分别为22.22±0.76％、22.67±0.71％、22.41±0.73％、10.92±0.56％、22.13±0.69％、37.54±0.85％、19.53±0.62％，KD-3表现出最佳的镉清除效果，达到了37.54±0.85％，吸附量达到159mg/g；清除率最低的菌株为S7，为10.92±0.56％，吸附量仅为28mg/g；镉清除率由高到低排序为：KD-3、S2、S4、S5、S1、S8、S7。用吸附后的培养液pH值表征菌体生长情况，菌株S5、S2、S4、S7、S1、KD-3、S8的培养液pH值分别为3.77±0.04、3.74±0.03、4.19±0.07、3.76±0.05、3.74±0.04、3.85±0.06、3.74±0.02，由图3可知，镉离子对菌株S4的生长影响较大。
处理组2：同处理组1，唯一的区别在于将初筛出的抗性菌株KD-3、S2、S4、S5、S1、S8、S7按照5％(v/v)的接种量分别接入含铅离子60mg/L的MRS肉汤液体培养基中进行培养。
测定培养液的pH值和菌体质量，对比观察乳酸菌在结合金属过程中的生长情况。
对KD-3吸附铅离子Pb2+的效果进行分析(见图4和表2)可知，吸附铅离子效果最好的为菌株S2，清除率达到了69.41±0.19％，吸附量为247mg/g；KD-3的清除率达到了34.01±0.57％，吸附量为142mg/g，最差的是菌株S7，清除率仅为1.11±0.09％；吸附效果排序为：S2、KD-3、S1、S8、S4、S5、S7。由pH值测定结果可知，铅离子对S2和S1生长情况影响显著，其余菌株生长均未受显著性影响。
表2菌株KD-3吸附铅离子的效果数据
处理组3：同处理组1，唯一的区别在于将初筛出的抗性菌株KD-3、S2、S4、S5、S1、S8、S7按照5％(v/v)的接种量分别接入含铬离子60mg/L的MRS肉汤液体培养基中。
测定培养液的pH值，对比观察乳酸菌在结合金属过程中的生长情况。
由乳酸菌对铬离子的吸附结果(图5)可得，S5、S1、KD-3、S2、S8、S7、S4的铬清除率分别为71.13±0.97％、27.15±0.56％、60.44±1.28％、34.57±0.79％、14.71±0.85％、10.49±0.38％、36.32±0.73％，菌株S5对铬的吸附效果最佳，清除率达到71.13±0.97％；吸附量为342mg/g；菌株KD-3对铬的去除率为60.44±1.28％，吸附量为207mg/g；吸附效果最差的是菌株S7，清除率为10.49±0.67％；吸附量为9.76mg/g；综合铬清除率排序为：S5、KD-3、S4、S2、S1、S8、S7。菌株S5、S1、KD-3、S2、S8、S7、S4培养液的pH值分别为3.84±0.08、4.29±0.11、3.72±0.06、4.15±0.09、3.75±0.05、3.79±0.07、3.92±0.1，由pH值测定结果可知，铅离子对S2和S1生长情况影响显著，其余菌株生长均未受显著性影响。
6.抗性乳酸菌产酸能力及抗氧化能力测定
(1)产酸能力测试
分别将KD-3、S2、S4、S5、S1、S8、S7接种于MRS肉汤液体培养基中发酵24h得到乳酸菌发酵液，乳酸菌发酵液在8000rpm高速离心15min，取一定量的上清液稀释，加入生物传感器中，即可测出发酵液中的乳酸产量。
(2)DPPH自由基清除率测定
处理组：将步骤(1)的乳酸菌发酵液筛选得到的抗性菌株KD-3、S2、S4、S5、S1、S8、S7在10000rpm低温(4℃)离心15min得到菌体沉淀，再用pH值为7.2的磷酸缓冲溶液(PBS)反复洗涤三次，最后重悬于PBS中，得到菌体；菌体中抗性菌株的细胞浓度达到1.0×109CFU/mL；取1mL菌体按1:1(v/v)加入刚配制的DPPH无水乙醇溶液；
对照组：1mLDPPH无水乙醇溶液与1mL磷酸缓冲溶液混合溶液作为对照组；
处理组和对照组均在室温避光保存30min，随后8000rpm离心10min，测定样品在517nm处的吸光值，DPPH自由基清除率计算公式如下：
DPPH清除率(％)＝100％×[1-A517(实验组)/A517(对照组)]
对测试菌株的DPPH自由基清除率及乳酸产量进行测定，表征菌株的抗氧化能力以及实际应用潜力，如图6所示。菌株S1、S5、S7、KD-3、S4、S8、S2的DPPH自由基清除率分别为(48.41±1.01)％、(52.38±0.89)％、(42.82±2.31)％、(50.81±1.23)％、(22.32±0.41)％、(44.11±2.11)％、(19.1±1.28)％，菌株S1、S5、S7、KD-3、S4、S8、S2的乳酸产量分别为(2.72±0.21)g/L、(7.53±0.67)g/L、(7.1±0.41)g/L、(7.78±0.3)g/L、(7.18±0.51)g/L、(6.85±0.42)g/L、(2.63±0.31)g/L，菌株S5、KD-3、S1、S8的DPPH自由基清除率显著高于菌株S4和S2；菌株KD-3、S5、S7、S4、S8的乳酸产量均大于6g/L。其中菌株S5和KD-3的两项指标均高于其它测试菌株。
实施例2抗性基因检测
选用5株具有三种重金属抗性及良好吸附性能的菌株S8、S7、KD-3、S5、S2进行抗性基因检测试验。
1.引物设计与合成
根据目前报道的微生物重金属抗性基因序列，设计合成抗重金属镉的czcD基因，抗重金属铅的pbrT基因，抗重金属铬的chrA基因等三对引物，然后用上述基因对抗性菌株的总DNA进行扩增，设计荧光定量PCR产物，绝对定量荧光PCR研究乳酸菌抗性形成原因。
抗性基因pbrT，引物为pbrT-F：AGCGCGCCCAGGAGCGCAGCGTCTT(SEQ ID NO:2)；pbrT-R：GGCTCGAAGCCGTCGAGRTA(SEQ ID NO:3)；
抗性基因chrA，上游引物为chrA-F：TGGCTCTCGCTGTTCTTTGT(SEQ ID NO:4)；下游引物为chrA-R：TAAGTGCGACAAGGGCAACT(SEQ ID NO:5)；
抗性基因czcD，上游引物为czcD-F：TCATCGCCGGTGCGATCATCAT(SEQ ID NO:6)；下游引物为czcD-R：TGTCATTCACGACATGAACC(SEQ ID NO:7)。
2.定性检测
对各抗性菌株S8、S7、KD-3、S5、S2的总DNA进行提取后，利用步骤1的抗性基因引物进行绝对定量荧光PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳得出了与预期相符的基因片段(图7)。
由图7可知，编号为KD-3菌株中同时具有铅、镉、铬抗性基因，S2、S5、S7、S8菌株中同时具备镉、铬抗性基因。
3.定量检测
(1)标准品构建
具体步骤如下：1)利用步骤1的引物获取铅、镉、铬抗性基因的目的片段；2)目的片段纯化；3)目的片段连接；在无菌的PCR管中配制下列DNA溶液，全量为5μL。连接反应体系成分：pMD18-T Vecter(50ng/μL)1μL，Insert DNA(目的片段)1～2μL，ddH2O补加至5μL。4)转化感受态大肠杆菌细胞；5)复苏：利用2YT培养基复苏；6)涂板；7)挑单菌落接种培养；8)菌检；在无菌的PCR小管中按照表3体系加入各种成分；电泳出现亮条带进行质粒抽提；9)质粒抽提；将菌液充分振荡悬浮，离心后加入Buffer，进行质粒抽提；(10)测序；按照质粒提取试剂盒使用手册加样测序，利用NanoDrop 2000测定质粒的浓度和纯度。通过质粒的浓度换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数。将质粒用进行10倍系列稀释后作为标准品。
表3PCR反应体系成分表
(2)荧光定量PCR方法重复性及稳定性试验
将制备的标准品进行稀释，建立扩增曲线和溶解曲线，见图8。通过已知浓度的标准品可以得到扩增反应存在的线性关系。由图8可知，三种抗性基因溶解曲线均显示单一的峰，扩增产物均一，没有特异性峰出现，符合试验要求，结果稳定可靠。
4.三种重金属抗性基因real-time PCR标准曲线的建立
将定量检测中步骤(1)所得质粒用进行10倍系列稀释，稀释到8个梯度模板，每个重复三次；根据Ct值、扩增曲线绘制出标准曲线。通过已知浓度的标准品可以得到扩增反应存在的线性关系。引物扩增效率见表4。
表4引物扩增效率
由表4可得，铅抗性基因pbrT片段回归方程为：Y＝-4.1X+53.59，相关系数R2＝0.9986；铬抗性基因chrA片段回归方程为：Y＝-3.88X+46.7，相关系数R2＝0.9997；镉抗性基因czcD片段回归方程为：Y＝-3.88X+47.58，相关系数R2＝0.9988；三个线性关系都较好。X为logCo(基因拷贝数)，Y为Ct(即扩增产物荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数)。
5.分别提取五株菌株S8、S7、KD-3、S5、S2的基因组DNA，将菌株的基因组DNA和抗性基因标准品同时进行绝对定量荧光PCR扩增。从而最终得出五株菌株的基因组DNA的抗性基因的拷贝数，结果如图9所示。利用SPSS16.0对三种抗性基因在不同菌株中的表达水平进行显著性差异分析(p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著)。
可知，其中镉抗性基因片段czcD在菌株S5中表达量为2430.74±35.2拷贝数/μL显著高于其它菌株，czcD在菌株KD-3中表达量为1719.47±21.5拷贝数/μL，见图9。
铬抗性基因片段chrA在各菌株中的表达水平如图10所示，菌株S2中的表达量达到了3.57×105拷贝数/μL，chrA在菌株KD-3中表达量为24474.05±572.4拷贝数/μL。
铅抗性基因片段pbrT仅在菌株KD-3中检测到了表达，表达量为1.26×104拷贝数/μL，其余菌株中均未检测到此基因片段。
综上，KD-3同时具有多种优良特性的抗Cd2+、Pb2+、Cr6+基因片段，作为目标菌株进行菌种鉴定。
6.菌株KD-3的鉴定
将瑞士乳杆菌KD-3在37℃下培养24h置于显微镜及扫描电镜下观察其菌落特征结果如图11，12所示，显微镜下菌体呈杆状，甲苯胺蓝染色后显微镜下观察有菌体聚集现象；菌落呈乳白色凸起状，外表较为光滑，细胞形态符合典型的乳酸菌形态特征。扫描电镜结果显示菌体表面光滑无异物，杆状饱满。
提取菌株KD-3的16S rDNA基因片段，进行菌种鉴定，16S rDNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。将测得的16S rDNA基因片段序列与NCBI数据库中的碱基序列进行比对和分析，构建菌株的系统发育树，如图13所示。
从图13中可以看出，菌株KD-3为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，即瑞士乳杆菌KD-3。
实施例3
利用MRS肉汤液体培养基测定瑞士乳杆菌KD-3的最佳生长温度、pH值、接种量及NaCl浓度对瑞士乳杆菌KD-3生长的影响。通过控制变量法改变培养液pH值、接种量、培养温度和培养时间，以及在不同渗透压条件下，测定瑞士乳杆菌KD-3菌株的OD(600nm)值表示菌株实时生长情况。
经测定，瑞士乳杆菌KD-3的最适宜培养温度在37～40℃，最佳培养温度为37℃；瑞士乳杆菌生长最适pH值范围为5～8，最佳pH值为7；接种量为培养基体积的2～5％，接种量为培养基体积的3％培养效果最佳；培养时间为24～48h，最佳培养时间为24h，NaCl浓度对瑞士乳杆菌KD-3的生长影响比较大，随着NaCl浓度的增大，培养基中NaCl浓度为1％～2％，菌株的生长无显著性差异，菌株能够耐受质量浓度为2％的NaCl溶液。
1.吸附条件对瑞士乳杆菌KD-3吸附铅镉和铬离子的影响分析
(1)瑞士乳杆菌KD-3菌体制备
为避免保护剂对金属吸附的影响，采用菌体进行吸附。将分离纯化后的瑞士乳杆菌KD-3接种于MRS肉汤液体培养基中，于恒温培养箱中37℃培养24h后，8000rpm离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次后，再次离心获得菌体。
(2)将上述菌体分别接入铅镉混合溶液(100mg/L)和铬溶液(100mg/L)对重金属进行吸附，基础吸附条件设置为吸附时间3h，菌体的添加量为含镉和铅的溶液体积的5‰，pH为6，温度37℃。分别设置不同的温度(4℃、28℃、32℃、37℃、40℃)、菌体的添加量(即菌体占含重金属镉和铅溶液的质量体积比)为含镉和铅的溶液体积以及单独含铬的溶液体积的2‰、4‰、6‰、8‰、10‰；吸附时间(0.1h，0.5h，1h，2h，3h，6h)；初始pH值(2、4、6、7、8)进行吸附。其中，初始pH值的调整通过加入稀硝酸或氢氧化钠溶液实现。实验过程中每个处理设定3个平行实验。
(3)吸附完成后利用ICP测定所得上清液中的金属离子浓度，与对照组相比，计算金属清除率，对照组为同等培养条件下不接种瑞士乳杆菌KD-3的铅镉混合溶液或同等培养条件下不接种瑞士乳杆菌KD-3的铬溶液。清除率的计算公式同实施例1，结果见图14～图17和表5～表8。
镉清除率在40℃达到最大为29.08±1.13％；铅离子清除率37℃时达到最大值75.88±2.54％；铬离子清除率在32℃时达到最大值为38.85±1.45％。
随着菌体添加量的增加，瑞士乳杆菌KD-3菌体接入铅镉混合溶液的体积比为6‰的时候铅和镉离子清除率均达到最大，铅清除率、镉清除率最大值分别为65.87±1.55％和28.64±0.48％；对铬离子的吸附随着菌体添加量的缓慢增长，到瑞士乳杆菌KD-3菌体接入铬溶液的体积比为8‰时达到最大值46.74±1.52％。
随着吸附3h的时候，镉清除率达到最大值44.53±1.31％；铅离子的吸附2h达到75.81±1.42％，随后降低后逐渐平缓；铬清除率吸附3h后达到最大值24.08±1.2％，后逐渐降低。
pH为7的时候，镉清除率达到最大，为54.1±2.54％；铅离子清除率最大时pH为6，达到83.37±3.1％；pH达到4的时候，瑞士乳杆菌KD-3对铬离子的清除率最高，达到57.16±1.4％；说明酸性环境更利于铬离子的吸附。
表5不同吸附温度下的瑞士乳杆菌KD-3的镉清除率和铅清除率
吸附温度(℃) 镉清除率(％) 铅清除率(％) 铬清除率(％)
4 18.3±1.42 19.47±2.12 16.09±1.21
28 23.17±1.56 42.4±2.41 26.1±2.1
32 26.06±1.89 44.18±1.56 38.85±1.45
37 27.19±2.1 75.88±2.54 38.34±1.31
40 29.08±1.13 61.84±2.13 31.29±1.67
表6不同菌体添加量下瑞士乳杆菌KD-3的镉清除率和铅清除率
菌体的添加量 镉清除率(％) 铅清除率(％) 铬清除率(％)
2‰ 7.2±0.31 29.92±1.68 37.82±1.63
4‰ 8.35±0.22 42±1.22 38.31±1.76
6‰ 28.64±0.48 65.87±1.55 38.79±1.52
8‰ 11.37±0.51 54.26±1.25 46.74±1.52
10‰ 8.01±0.87 53.88±1.31 39.39±2.13
表7不同吸附时间下瑞士乳杆菌KD-3的镉清除率和铅清除率
吸附时间(h) 镉清除率 铅清除率 铬清除率
0.1 12.59±0.21 45.92±1.53 3.02±0.72
0.5 19.73±1.53 52.39±1.52 4.85±0.4
1 20.32±3.31 54.63±3.1 14.04±1.1
2 32.55±2.54 75.81±1.42 14.44±1.21
3 44.53±1.31 65.94±2.12 24.08±1.2
4 34.03±1.53 66.22±1.67 23.82±1.42
6 26.88±1.42 66.57±2.1 14.93±1.1
表8不同pH值下瑞士乳杆菌KD-3的镉清除率和铅清除率
pH 镉清除率(％) 铅清除率(％) 铬清除率(％)
2 3.9±0.21 17.48±1.53 45.08±2.1
4 28.16±1.53 25.63±1.52 57.16±1.4
6 37.9±3.31 83.37±3.1 21.58±1.1
7 54.1±2.54 67.49±1.42 18.29±1.21
8 49.94±1.31 66.46±2.12 9.51±0.12
2.瑞士乳杆菌KD-3吸附铅镉离子条件优化
瑞士乳杆菌KD-3菌体的制备方法同步骤1。
为对铅镉混合环境下的吸附工艺进一步优化，利用同时含重金属镉和铅的溶液进行，选取吸附时间(A)、温度(B)、初始pH值(C)、菌体的添加量(即菌体占含重金属镉和铅溶液的质量体积比)(D)进一步优化吸附条件，试验设计及结果如表9，清除率的计算公式同实施例1。
表9瑞士乳杆菌KD-3吸附重铅镉离子试验结果
由表9可知，菌体添加量为含重金属镉和铅的溶液的体积的5～7‰，pH为6.5～7.5，温度为35～45℃及吸附时间为1.5～3.5h的条件下，镉铅混合溶液中镉的清除率为36.50％～65.67％，铅的清除率为72.45％～94.17％，优选地，当菌体添加量为5.25‰，pH为7.50、温度为45℃，吸附时间为1.5h时，镉铅混合溶液中镉的清除率为364.56％，单位菌体的吸附量为127mg/g，铅的清除率为87.93％，单位菌体吸附率为378mg/g。
瑞士乳杆菌KD-3重金属清除性能与现有技术中的菌株进行比较，结果见表10。
表10瑞士乳杆菌KD-3重金属清除性能与现有技术中的菌株比较结果
大多数单一金属的清除比多元金属的清除效果好，对复合重金属的吸附研究如表10所示，瑞士乳杆菌KD-3在发酵环境中对铅、镉和铬单一重金属的吸附能力高于大多数细菌；在复合重金属铅镉的体外溶液吸附中，对铅镉的吸附能力优于多数已报道菌株。瑞士乳杆菌KD-3在发酵环境中对铅、镉和铬单一重金属的吸附能力高于大多数细菌；在复合重金属铅镉的体外溶液吸附中，对铅镉的吸附能力优于多数已报道菌株。
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实施例4瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉开发及体外去除重金属评价
1.不同状态下的瑞士乳杆菌KD-3对铅镉吸附的比较
为促进瑞士乳杆菌KD-3在发酵食品中的应用，设计对比不同状态菌体对菌株去除铅镉的影响。
处理1：将瑞士乳杆菌KD-3新鲜菌液按体积比5％接种于MRS肉汤液体培养基中，培养24后于4℃和8000rpm冷冻离心10min得到活菌体；
处理2：取出活菌体后于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min得到死菌体。
处理3：在活菌体中添加保护剂(葡萄糖，D-半乳糖，抗坏血酸)得到加入保护剂的菌体。葡萄糖、D-半乳糖和抗坏血酸的添加量分别为菌体重量的2％、2.5％和0.1％。
处理1～处理3分别按终浓度为0.5g/L的添加量加入到含铅镉离子10mg/L的水溶液中，吸附37℃振荡吸附3h后所得物在8000rpm离心10min后用ICP(电感耦合等离子发射光谱仪)测定上清液中铅镉的含量，对比不同状态下KD-3的吸附能力。
结果见图18，可知，死菌体铅吸附率为83±1.2％，镉吸附率为43±0.92％；活菌体铅吸附率为76±1.1％，镉吸附率为32±0.78％；活菌体中添加保护剂铅吸附率为71±0.97％，镉吸附率为30±0.89％，三种状态下的瑞士乳杆菌KD-3对铅镉的吸附并无显著性差异(p>0.05)，死菌体对铅镉的清除率略有提高；可能是由于菌体表面被高温高压破坏，暴露出了更多的吸附位点，从而促进了表面吸附作用。加了保护剂之后的清除率反而有所下降，可能添加了保护剂导致实际菌体量变少导致的。
2.瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉对模拟胃肠液中铅镉的去除效果
瑞士乳杆菌KD-3按照体积比3％的接种量接入500mLMRS肉汤液体培养基中，40℃下培养24h后，8000rpm高速离心10min，所得沉淀用无菌生理盐水洗涤三次，弃去上清液，收集菌体，加入保护剂混匀后，通过将瑞士乳杆菌KD-3进行真空冷冻干燥制备菌粉，真空冷冻干燥的参数为放入-35℃环境中预冻5h，然后再-55℃真空度5pa冻干24h；将干燥后的菌粉0.01g与100g羊奶粉干混均匀，平板计数法测定活菌数量，开发出具有除重金属功能性羊奶粉产品。瑞士乳杆菌KD-3菌粉的活菌数为3.25×1011CFU/g。羊奶粉中的瑞士乳杆菌KD-3活菌数为3.25×107CFU/g。
将制备好的具有除重金属功能性的羊奶粉按质量浓度12.5％的比例用蒸馏水冲调，取10mL冲调液加入至20mL模拟胃液中消化2h，模拟胃液中的铅镉浓度为10mg/L，之后离心得到上清液和菌体沉淀，测定上清液中铅镉残留量；后将20mL的人工肠液加入到菌体沉淀中继续吸附3h，人工肠液中的铅镉浓度10mg/L，之后离心得到上清液中的铅镉残留量。
以不含瑞士乳杆菌KD-3菌粉的羊奶粉加入胃肠液处理作为对照组，测定瑞士乳杆菌KD-3在模拟胃肠液中的重金属清除率。
由图19可得，在人工肠液环境中对铅镉的清除率较高，分别达到了56.31±1.72％和23.87±1.97％。在人工胃液中铅镉清除率较低，分别为24.12±1.34％和12.02±0.98％；可能是由于胃液中的低酸性环境影响了菌株的吸附性能，肠液中的pH环境更接近最佳吸附环境，从而有利于重金属的清除，较胃液吸附率有显著性提高(p<0.05)。
对于不需要发酵的液体食品或者溶液体系，可直接添加灭活的瑞士乳杆菌KD-3以去除食品中的重金属，吸附过后通过离心过滤等方法分离出去；也可将瑞士瑞杆菌KD-3菌粉直接添加到发酵食品中以缓解重金属积累的影响。
综上，瑞士乳杆菌KD-3在发酵环境中对铅、镉和铬单一重金属的吸附能力高于大多数细菌；在复合重金属铅镉的体外溶液吸附中，对铅镉的吸附能力优于多数已报道菌株。本发明瑞士乳杆菌KD-3能耐受单一及复合的重金属(镉、铬和铅)，同时对单一及复合的重金属(镉、铬和铅)去除效率高。本发明瑞士乳杆菌KD-3可以用于制备冻干菌粉，利用其开发了瑞士乳杆菌KD-3羊奶粉，菌粉及其羊奶粉均能有效去除重金属。通过将制备的瑞士乳杆菌KD-3冻干菌粉加入羊奶粉中开发出活菌数为3.25×107CFU/g益生菌羊奶粉，将其应用于模拟胃肠液中除铅镉离子，发现具有良好的去除效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株去除多种重金属的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KD-3，其特征在于，该菌株已于2023年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023479。
2.根据权利要求1所述的瑞士乳杆菌KD-3，其特征在于，所述瑞士乳杆菌KD-3培养时应用的培养基包括MRS肉汤液体培养基，所述培养的pH值为5～8，培养的温度为37～40℃，培养时的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％；所述瑞士乳杆菌KD-3能够耐受质量浓度为2％的NaCl溶液。
3.权利要求1或2所述的瑞士乳杆菌KD-3在用于去除重金属镉、铬和铅中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述瑞士乳杆菌KD-3接种在含有镉、铬和铅的MRS肉汤液体培养基中进行培养，去除MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅；所述培养时瑞士乳杆菌KD-3的接种量为MRS肉汤液体培养基体积的2％～5％，培养的温度为37～40℃，pH值为5～8，培养的时间为24～48h；
或者，
将所述瑞士乳杆菌KD-3的菌体直接与含镉和铅的溶液或单独含铬的溶液混合后进行吸附；
所述瑞士乳杆菌KD-3的菌体的制备包括：瑞士乳杆菌KD-3按照权利要求2所述的培养条件培养后得到培养液，培养液在4℃下离心后得到菌体，所述菌体利用无菌生理盐水洗涤2次后再次离心得到菌体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，MRS肉汤液体培养基中的Pb2+的浓度为≤1500mg/L，MRS肉汤液体培养基中的Cd2+浓度为≤150mg/L，MRS肉汤液体培养基中的Cr6+浓度为≤1500mg/L；
当所述MRS肉汤液体培养基中的重金属镉、铬和铅含量均为60mg/L时，瑞士乳杆菌KD-3对镉的去除率为37.54±0.85％，吸附量为159mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铬的去除率为60.44±1.28％，吸附量为207mg/g；瑞士乳杆菌KD-3对铅的去除率为34.01±0.12％，吸附量为142mg/g。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当瑞士乳杆菌KD-3菌体的添加量为含镉和铅的溶液体积的5～7‰，溶液的pH值为6.5～7.5，吸附温度为35～45℃和吸附时间为1.5～3.5h时，含镉和铅的溶液中镉的清除率为36.50％～65.67％，铅的清除率为72.45％～94.17％；
当瑞士乳杆菌KD-3菌体添加量单独含铬的溶液体积的2～10‰，溶液的pH值为2～4，吸附温度为32～37℃和吸附时间为3～4h时，铬的清除率为24.08％～57.16％。
7.权利要求1或2所述的瑞士乳杆菌KD-3在制备具有抗氧化性的产品或提高乳酸产量中的应用。
8.一种去除重金属污染的清除剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的瑞士乳杆菌KD-3的活菌体、死菌体或添加保护剂的冻干粉。
9.一种去除重金属的功能性益生菌奶粉，其特征在于，所述功能性益生菌奶粉中包括将权利要求1所述瑞士乳杆菌KD-3制备的冻干粉。
10.根据权利要求9所述的功能性益生菌奶粉，其特征在于，所述功能性益生菌奶粉中的瑞士乳杆菌KD-3的有效活菌数为≥3.0×107CFU/g。
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