CN109022303B - 一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物的方法，通过培养溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP来得到；本发明还涉及上述方法得到的具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物及其应用。本发明的组合可用于对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好的杀伤效果，可有效地治理蓝藻水华。此外，该组合物还可用于破坏具有气囊的蓝藻的气囊，一方面提供了治理蓝藻水华的新思路，另一方面有利于对这类蓝藻进行研究。

Description

一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物控藻领域，更特别地，涉及一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物，其制备方法及其应用。
背景技术
水体富营养化特别是湖泊(水库)富营养化已经成为全世界的水环境问题，不管是发达国家还是发展中国家都将面临严重的水体富营养化难题，这将是相当长一段时间内我们将要面临的巨大考验。水体富营养化的一个有害结果是一些微藻的爆发导致水华。淡水水体爆发的水华，多以有害蓝藻水华(Harmful cyanobacterial blooms)为主，形成水华的蓝藻种类主要有微囊藻(Microcystis)、鱼腥藻(Anabaena)、束丝藻(Aphanizomenon)、浮丝藻(Planktothrix)、颤藻(Oscillatoria)等。在我国，微囊藻水华是最主要的水华类型，鱼腥藻水华和束丝藻水华次之。
目前，治理水体中的水华微藻的方法主要分为物理方法、化学方法和生物方法。微生物控藻为是指噬藻体、细菌、真菌以及放线菌等微生物对藻类的生长产生抑制作用或者杀灭藻类的控藻技术。该技术环境友好型、低成本、控藻效果显著，具有很好的应用前景。
一些蓝藻类群具有气囊或气囊群，光镜下气囊由于折光呈现出红、黑、褐等多种颜色。这类蓝藻主要通过气囊来调节浮力，调整在水体中的位置，在水体中占据有利的位置，从而在竞争中获得优势，成为水华优势类群。
发明内容
发明人从野外采集土壤，经分离培养，得到一种溶藻细菌，牛肉膏蛋白胨固体平板上形成的菌落呈圆形，表面湿润，扁平，光滑，边缘整齐，菌落不透明，米黄色，质地疏松，易被接种环挑起。细菌细胞在显微镜下呈棒杆状，长约1.3-1.7μm，宽约0.45-0.55μm，芽孢端生，球形，膨大，革兰氏染色呈阳性，多以单个细胞的形式出现。将所述溶藻细菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093。
通过利用上述菌株WP，本发明提供了一种获得具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物的方法，包括以下步骤：
S1：培养溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP，得到WP培养物；
S2：从所述WP培养中去除所述溶藻细菌菌体，即得到所述具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物。
在一个实施方案中，S1中，培养Lysinibacillus sp.WP的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或R2A培养基或其组合。
在一个实施方案中，S1中，Lysinibacillus sp.WP培养至生长阶段的后期。
本发明还提供了通过上述方法得到的具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物。
本发明还提供了上述组合物在去除水体中水华蓝藻中的应用。
本发明还提供了上述组合物在破坏微藻气囊中的应用。在一个实施方案中，所述微藻为拉式拟柱孢藻C.raciborskii CHAB 3438。
本发明还提供了一种破坏微藻气囊的方法，包括将上述组合物添加至所述微藻的培养物中并培养所述微藻的步骤。
在一个优选实施方案中，所添加的所述组合物的量为所述微藻培养物的体积的5％。
在一个优选实施方案中，添加所述组合物后，培养所述微藻2天以上。
本发明的组合可用于对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好的杀伤效果，可有效地治理蓝藻水华。此外，该组合物还可用于破坏具有气囊的蓝藻的气囊，一方面提供了治理蓝藻水华的新思路，另一方面有利于对这类蓝藻进行研究。
微生物保藏
本发明所涉及的菌株从湖北省武汉市新洲地区的土壤分离得到，经16SrDNA测序和形态学鉴定，该微藻属于Lysinibacillus属。该菌株已于2018年2月7日送至湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093，命名为赖氨酸芽孢杆菌WP，拉丁学名为Lysinibacillus sp.WP。
附图说明
图1为菌株WP的亚甲基蓝染色照片；
图2为菌株WP细胞的扫描电镜照片；
图3为菌株WP的16S rDNA序列通过BLAST比对，相关序列于Bioedit7.1.3.0进行序列比对分析，最后用MEGA 7构建的系统发育树；
图4为菌株WP的生长曲线；
图5为添加菌株WP培养物的不同成分(上清液、菌体、发酵液)处理微囊藻PCC7806、鱼腥藻CHAB 1799、拟柱孢藻CHAB 151后的溶藻率柱状统计图；
图6为向拉式拟柱孢藻CHAB 3438培养物中添加从菌株WP培养物分离的无细胞上清液后，藻液在波长为680、750nm处的吸光度值的时间曲线；
图7为向拉式拟柱孢藻CHAB 3438培养物中添加无细胞上清液后三角瓶中藻液在不同时间点(0-7d)的照片；
图8为另一组向拉式拟柱孢藻CHAB 3438培养物中添加无细胞上清液后三角瓶中藻液第24h和48h的照片，其中，a和c分别为空白对照组第24小时和48小时的照片，b和d分别为处理组第24小时和48小时的照片；
图9为向拉式拟柱孢藻CHAB 3438培养物中添加从菌株WP培养物分离的无细胞上清液后不同时间点的藻丝显微照片，其中，a为添加无细胞上清液前的照片，b为添加后第24小时的照片，c-e为添加后第7天的照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.Lysinibacillus sp.WP的筛选纯化与保藏
称取10g采自湖北省武汉市新洲地区的土壤，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在28℃，180rpm/min的条件下振荡，1h后在超净工作台取上清液，用无菌水进行10倍的梯度稀释，取10-3,10-4,10-5的稀释液100μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，于28℃倒置培养2d，挑取不同形态的菌落进一步用平板划线分离法纯化，纯化后的细菌用甘油保藏法保存在-80℃冰箱。
挑取单克隆于液体牛肉膏蛋白胨培养基中扩大培养，控制其OD600nm值在1.2-1.5之间，使其处于对数生长期后期。以体积比5％添加菌液到藻液中，新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基做空白对照，藻液培养条件同上，7d后测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。
溶藻效率(％)＝(1-处理组叶绿素a浓度/对照组叶绿素a浓度)×100
通过以上方法，筛选出一株溶藻效率较高的菌株，编号WP。菌株WP在牛肉膏蛋白胨固体平板上形成的菌落呈圆形，表面湿润，扁平，光滑，边缘整齐，菌落不透明，米黄色，质地疏松，易被接种环挑起。菌株WP亚甲基染色照片如图1所示，扫描电镜照片如图2所示，呈棒杆状，长约1.3-1.7μm，宽约0.45-0.55μm，芽孢端生，球形，膨大，革兰氏染色呈阳性，多以单个细胞的形式出现。
设计引物扩增其16S rRNA基因进行测序，然后进行BLAST比对，构建系统发育树如图3所示，与菌株WP同源性最近的是L.fusiformis NRS-350(AF169537)，16S rRNA基因相似性达到了99.6％。从系统发育树可以看出，Lysinibacillus属为独立分支，分子生物学鉴定菌株WP属于Lysinibacillus属。
经研究发现，菌株WP对多种水华蓝藻均有良好的溶藻效果，不仅能够杀伤微囊藻，而且能够杀伤鱼腥藻和拟柱孢藻，这是首次发现能够杀伤鱼腥藻和拟柱孢藻的Lysinibacillus属溶藻细菌。在以前的报道中，已经对Lysinibacillus属溶藻细菌有一定研究。卢兰兰等从滇池蓝藻水华聚集区分离获得一株溶藻菌L.fusiformi DC-L4，其对铜绿微囊藻有效(卢兰兰等.溶藻细菌DC-L14的分离、鉴定与溶藻特性.应用与环境生物学报,2009,15(1):106-109)；张菊从黄化的微囊藻藻液和小麦中分离到L.fusiformi的不同菌株，其具有较强的溶解微囊藻的能力(张菊等.小麦内生溶藻细菌ZB1的分离鉴定及其溶藻特性.西南农业学报,2017,30(5):1068-1073)；刘国勇等从香溪河春季水华聚集区分离获得一株溶藻菌L.fusiformis H5，对硅藻、甲藻、隐藻的生长均有一定的抑制效果(刘国勇等.溶藻细菌H5的分离、鉴定及溶藻特性研究.安徽农业科学,2012,40(28):13955-13956，13959)。但是，都未曾分离到对鱼腥藻和拟柱孢藻有杀伤效果的Lysinibacillus属溶藻细菌。
该菌株已于2018年2月7日保藏于送至湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M2018093，命名为赖氨酸芽孢杆菌WP，拉丁学名为Lysinibacillus sp.WP(以下简称菌株WP)。
2.菌株WP的培养
挑取单克隆于新鲜无菌R2A培养基(表1)中扩大培养。扩大培养后的菌液再接种到新鲜R2A液体培养基中，控制其初始OD600nm为0.04，在28℃，180rpm/mi n条件下培养，定时取样，用分光光度计测定其OD600nm。绘制的生长曲线如图4所示，菌株WP的生长分为三个阶段，分别为停滞期(0-2h)，对数期(2-14h)，稳定期(14-28h)。28h之后，菌株WP进入衰亡期。
表1 R2A培养基成分
Figure BDA0001708181300000061
3.菌株WP对水华蓝藻的溶藻方式
取对数后期(OD600nm＝1.2)的发酵液室温离心(10000g，10min)，上清液过0.22μm(Millipore)的膜两次，用牛肉膏蛋白胨固体培养基检测上清液是否除菌完全，完全无菌的上清液用于以下实验。发酵液离心后的沉淀为菌体，用新鲜无菌R2A液体培养基洗菌3遍，最后等体积重悬。以体积比5％添加上清液、菌体、发酵液到藻液中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，7d后测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。
结果如图5所示，上清液、菌体、发酵液这三个处理组的溶藻效率分别为94.75±1.04、87.63±1.76、88.32±1.27％(PCC 7806)；70.15±1.72％、73.64±0.08％、75.21±2.00％(CHAB 1799)；83.77±1.19、83.57±1.06、85.16±1.21％(CHAB 151)。这三者对微囊藻PCC 7806、鱼腥藻CHAB 1799、拟柱孢藻CHAB 151均有较强的溶藻效果。
可见，本发明的菌株WP的发酵液、上清液、菌体对三种蓝藻均有强烈的溶藻作用。其中，经离心、过膜后不含菌体WP的上清液具有较强的溶藻能力，可能是菌株WP在培养过程中分泌了一些胞外溶藻活性物质，因此不需要细菌细胞直接与藻类接触，也能产生溶藻作用。该方式为间接溶藻方式，这与目前报道的Lysinibacillus属的溶藻菌的溶藻方式(卢兰兰等，2009；邱雪婷等，2011；刘国勇等，2012；Liu et al.,2016；张菊等，2017)一致。经新鲜R2A培养基洗菌3遍的菌体基本不含其代谢产物，然而仍对供试藻种有较强的溶藻效果，这区别于已经发现的Lysinibacillus属的一些溶藻菌(卢兰兰等，2009；刘国勇等，2012；张菊等，2017)。
4.菌株WP上清液对拟柱孢藻C.raciborskii CHAB 3438的影响
用CT培养基(表2)培养拟柱孢藻C.raciborskii CHAB 3438，得到藻液。取对数后期(OD600nm＝1.2)的发酵液室温离心(10000g，10min)，上清液过Millipore的0.22μm的膜两次，用牛肉膏蛋白胨固体平板检测上清液是否除菌完全。以体积比5％添加滤液到藻液CHAB3438中，以无菌R2A液体培养基作为空白对照，在25±1℃，光照强度为30μmol·m-2·s-1，光暗周期比为12h:12h条件下共培养，定时取样测定相关指标。
表2 CT培养基成分
Figure BDA0001708181300000081
菌株WP的上清液作用于C.raciborskii CHAB 3438后，其藻液在波长为680、750nm处的吸光度值的变化如图6所示。CHAB 3438初始接种量为0.29±0.00(OD680nm)、0.20±0.00(OD750nm),加入WP上清液后的0-24h，空白对照和处理组的OD680nm、OD750nm值上升相对较快，接种24-48h后，均缓慢上升。接种48h后，空白对照组的OD680nm、OD750nm快速上升，而处理组开始进入缓慢下降的阶段。由此可见，菌株WP的上清液对拟柱孢藻C.raciborskii CHAB 3438具有一定的溶藻效果。
图7和8是培养过程中拍摄的微藻培养液的照片，随着培养时间的推移，对照组的藻液浓度升高并且颜色保持绿色，处理组的悬浮的藻液浓度降低、颜色发黄，并且在加入WP菌株上清液1天后即出现大量藻丝沉底，在三角瓶底部，可以看到部分沉淀下来的藻丝。48h后，藻丝几乎全部沉底。
图9为揭示菌株WP上清液处理后藻丝变化的光学显微镜照片。其中，a是拉氏拟柱孢藻的正常藻丝，直形藻丝单生，周围无粘滞性胶鞘包裹，异形胞端生、圆锥形，细胞横隔不明显，颗粒物不明显，气囊群在光镜下呈现金属光泽。b是菌株WP上清液处理1天后的光学显微镜照片，藻丝较长，藻细胞内气囊群在光镜下呈现的金属光泽较弱，可见零星颗粒物；c-e是菌株WP上清液处理1天后的光学显微镜照片，可见到此时藻丝长度较短，藻细胞气囊群完全被破坏，颗粒物明显，部分颗粒物释放到藻液中，可见藻丝颗粒物脱落后的痕迹。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种获得具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：培养溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP，得到WP培养物；
S2：从所述WP培养物中去除所述溶藻细菌菌体，即得到所述具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物，
所述溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO:M2018093。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，培养Lysinibacillus sp.WP的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或R2A培养基或其组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，Lysinibacillus sp.WP培养至生长阶段的后期。
4.一种具有溶藻和破坏微藻气囊的功能的组合物，其特征在于，通过权利要求1-3中任一项所述的方法得到。
5.权利要求4所述的组合物在去除水体中水华蓝藻中的应用。
6.权利要求4所述的组合物在破坏微藻气囊中的应用，所述微藻为拟柱孢藻。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述微藻为拉式拟柱孢藻C.raciborskiiCHAB 3438。
8.一种破坏微藻气囊的方法，其特征在于，包括将权利要求4所述的组合物添加至所述微藻的培养物中并培养所述微藻的步骤，所述微藻为拟柱孢藻。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所添加的所述组合物的量为所述微藻培养物的体积的5％。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，添加所述组合物后，培养所述微藻2天以上。
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