CN108949618B - 一种溶藻细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种溶藻细菌，所述溶藻细菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093；还涉及该溶藻细菌在去除水体中的微藻的应用；还涉及使用上述微藻去除水体中微藻的方法。本发明的溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好的杀伤效果，该溶藻细菌的有效作用条件覆盖了15‑35℃的温度范围和10‑60μmol·m^‑2·s^‑1的光照范围，能够适应水华发生的自然条件，可有效地治理蓝藻水华。

Description

一种溶藻细菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物控藻技术，更特别地，涉及一种溶藻细菌及其应用。

背景技术

水体富营养化特别是湖泊(水库)富营养化已经成为全世界的水环境问题，不管是发达国家还是发展中国家都将面临严重的水体富营养化难题，这将是相当长一段时间内我们将要面临的巨大考验。水体富营养化的一个有害结果是一些微藻的爆发导致水华。淡水水体爆发的水华，多以有害蓝藻水华(Harmful cyanobacterial blooms)为主，形成水华的蓝藻种类主要有微囊藻(Microcystis)、鱼腥藻(Anabaena)、束丝藻(Aphanizomenon)、浮丝藻(Planktothrix)、颤藻(Oscillatoria)等。在我国，微囊藻水华是最主要的水华类型，鱼腥藻水华和束丝藻水华次之。

目前，治理水体中的水华微藻的方法主要分为物理方法、化学方法和生物方法。微生物控藻为是指噬藻体、细菌、真菌以及放线菌等微生物对藻类的生长产生抑制作用或者杀灭藻类的控藻技术。该技术环境友好型、低成本、控藻效果显著，具有很好的应用前景。其核心是有效的溶藻细菌。

发明内容

发明人从野外采集土壤，经分离培养，得到一种溶藻细菌，牛肉膏蛋白胨固体平板上形成的菌落呈圆形，表面湿润，扁平，光滑，边缘整齐，菌落不透明，米黄色，质地疏松，易被接种环挑起。细菌细胞在显微镜下呈棒杆状，长约1.3-1.7μm，宽约0.45-0.55μm，芽孢端生，球形，膨大，革兰氏染色呈阳性，多以单个细胞的形式出现。将所述溶藻细菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093。

本发明还提供了上述溶藻细菌在去除微藻中的应用。

在一个优选实施方案中，所述微藻为一种或多种蓝藻。

在一个优选实施方案中，所述微藻选自微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻、尖头藻、微小平裂藻和聚球藻中的一种或多种组合。

本发明还提供了一种去除水体中微藻的方法，其包括将上述溶藻细菌的菌体或其培养物添加至含有微藻的水体中并进行共培养的步骤。

在一个优选实施方案中，所述溶藻细菌的培养物为液体培养物。

在一个优选实施方案中，向所述水体中添加所述溶藻细菌的量使所述溶藻细菌的含量不低于6×10²cfu/mL。

本发明的溶藻细菌Lysinibacillus sp.WP对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好的杀伤效果，该溶藻细菌的有效作用条件覆盖了15-35℃的温度范围和10-60μmol·m^-2·s^-1的光照范围，能够适应水华发生的自然条件，可有效地治理蓝藻水华。

微生物保藏

本发明所涉及的菌株从湖北省武汉市新洲地区的土壤分离得到，经16S rDNA测序和形态学鉴定，该微藻属于Lysinibacillus属。该菌株已于2018年2月7日送至湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093，命名为赖氨酸芽孢杆菌WP，拉丁学名为Lysinibacillus sp.WP。

附图说明

图1为菌株WP的亚甲基蓝染色照片；

图2为菌株WP细胞的扫描电镜照片；

图3为菌株WP的16S rDNA序列通过BLAST比对，相关序列于Bioedit7.1.3.0进行序列比对分析，最后用MEGA 7构建的系统发育树；

图4为菌株WP的生长曲线；

图5为添加菌株WP培养物后PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151的叶绿素a的时间曲线；

图6为添加不同浓度的菌株WP培养物(使培养体系中的细菌细胞含量分别为6*10⁶、6*10⁵、6*10⁴、6*10³、6*10²cfu/mL)后PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151的叶绿素a的时间曲线；

图7为添加不同生长阶段(停滞期、对数期、稳定期)的菌株WP培养物后PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151的叶绿素a的时间曲线；

图8为在不同生长阶段的PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151中添加WP培养物后的叶绿素a的时间曲线；

图9为添加菌株WP培养物后在不同温度下(15、25、35℃)培养的PCC7806、CHAB 151的叶绿素a的时间曲线；

图10为添加菌株WP培养物后在不同光照强度下(10、30、60μmol·m^-2·s^-1)培养的PCC 7806、CHAB 151的叶绿素a的时间曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.Lysinibacillus sp.WP的筛选纯化与保藏

称取10g采自湖北省武汉市新洲地区的土壤，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠，在28℃，180rpm/min的条件下振荡，1h后在超净工作台取上清液，用无菌水进行10倍的梯度稀释，取10^-3,10^-4,10^-5的稀释液100μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，于28℃倒置培养2d，挑取不同形态的菌落进一步用平板划线分离法纯化，纯化后的细菌用甘油保藏法保存在-80℃冰箱。

挑取单克隆于液体牛肉膏蛋白胨培养基中扩大培养，控制其OD₆₀₀nm值在1.2-1.5之间，使其处于对数生长期后期。以体积比5％添加菌液到藻液中，新鲜的牛肉膏蛋白胨液体培养基做空白对照，藻液培养条件同上，7d后测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。

溶藻效率(％)＝(1-处理组叶绿素a浓度/对照组叶绿素a浓度)×100

通过以上方法，筛选出一株溶藻效率较高的菌株，编号WP。菌株WP在牛肉膏蛋白胨固体平板上形成的菌落呈圆形，表面湿润，扁平，光滑，边缘整齐，菌落不透明，米黄色，质地疏松，易被接种环挑起。菌株WP亚甲基染色照片如图1所示，扫描电镜照片如图2所示，呈棒杆状，长约1.3-1.7μm，宽约0.45-0.55μm，芽孢端生，球形，膨大，革兰氏染色呈阳性，多以单个细胞的形式出现。

设计引物扩增其16S rRNA基因进行测序，然后进行BLAST比对，构建系统发育树如图3所示，与菌株WP同源性最近的是L.fusiformis NRS-350(AF169537)，16S rRNA基因相似性达到了99.6％。从系统发育树可以看出，Lysinibacillus属为独立分支，分子生物学鉴定菌株WP属于Lysinibacillus属。

经研究发现，菌株WP对多种水华蓝藻均有良好的溶藻效果，不仅能够杀伤微囊藻，而且能够杀伤鱼腥藻和拟柱孢藻，这是首次发现能够杀伤鱼腥藻和拟柱孢藻的Lysinibacillus属溶藻细菌。在以前的报道中，已经对Lysinibacillus属溶藻细菌有一定研究。卢兰兰等从滇池蓝藻水华聚集区分离获得一株溶藻菌L.fusiformi DC-L4，其对铜绿微囊藻有效(卢兰兰等.溶藻细菌DC-L14的分离、鉴定与溶藻特性.应用与环境生物学报,2009,15(1):106-109)；张菊等从黄化的微囊藻藻液和小麦中分离到L.fusiformi的不同菌株，其具有较强的溶解微囊藻的能力(张菊等.小麦内生溶藻细菌ZB1的分离鉴定及其溶藻特性.西南农业学报,2017,30(5):1068-1073)；刘国勇等从香溪河春季水华聚集区分离获得一株溶藻菌L.fusiformis H5，对硅藻、甲藻、隐藻的生长均有一定的抑制效果(刘国勇等.溶藻细菌H5的分离、鉴定及溶藻特性研究.安徽农业科学,2012,40(28):13955-13956，13959)。但是，都未曾分离到对鱼腥藻和拟柱孢藻有杀伤效果的Lysinibacillus属溶藻细菌。

该菌株已于2018年2月7日保藏于送至湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M2018093，命名为赖氨酸芽孢杆菌WP，拉丁学名为Lysinibacillus sp.WP(以下简称菌株WP)。

2.菌株WP的培养

挑取单克隆于新鲜无菌R2A培养基(表1)中扩大培养。扩大培养后的菌液再接种到新鲜R2A液体培养基中，控制其初始OD_600nm为0.04，在28℃，180rpm/min条件下培养，定时取样，用分光光度计测定其OD_600nm。绘制的生长曲线如图4所示，菌株WP的生长分为三个阶段，分别为停滞期(0-2h)，对数期(2-14h)，稳定期(14-28h)。28h之后，菌株WP进入衰亡期。

表1 R2A培养基成分

3.菌株WP对微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻的溶藻效果

用CT培养基(表2)分别培养铜绿微囊藻M.aeruginosa PCC 7806、真紧密鱼腥藻A.eucompacta CHAB 1799、拉氏拟柱孢藻C.raciborskii CHAB151，得到藻液。挑取单克隆于液体牛肉膏蛋白胨培养基中扩大培养，控制其OD_600nm值在1.2-1.5之间，使其处于对数生长期后期。以体积比5％添加菌液到藻液中，新鲜的R2A液体培养基做空白对照，在25±1℃，光照强度为30μmol·m^-2·s^-1，光暗周期比为12h:12h条件下共培养，定期测定其叶绿素a的含量，叶绿素浓度稳定后计算溶藻效率。

表2 CT培养基成分

叶绿素浓度的时间曲线如图5所示，菌株WP对7806、1799和151均有强烈的抑制效果。溶藻率的计算结果显示，菌液WP与PCC 7806共培养9天后，溶藻效率达到93.49±0.67％；与CHAB 1799共培养7天后，溶藻效率为66.13±1.24％；与CHAB 151共培养8天后，溶藻效率为89.30±2.09％。可以看出，菌株WP对微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻均有较强的溶藻作用，是一株具有广谱性溶藻效果的菌株。

如图6所示，真紧密鱼腥藻正常细胞，藻丝较长，营养细胞饱满圆润；菌液接种后第二天，藻丝中部分藻细胞出现黄化裂解，藻丝胶被外围细菌增多；接种后第四天，视野中几乎看不到健康的藻丝，大多数营养细胞黄化裂解；接种后第七天，视野中都是细胞碎片，几乎看不到健康的营养细胞，可见到少数的孢子和异形胞与细菌群体汇聚在一起。

4.菌株WP的溶藻条件

4.1溶藻菌阈值

取对数后期(OD_600nm＝1.2)菌液，用无菌R2A液体培养基对菌液进行梯度稀释，用固体平板法对稀释菌液进行计数。稀释菌液分别以体积比5％添加到藻液中，以R2A液体培养基为空白对照，微藻培养条件如前文所述，每隔3天取样测定其叶绿素a的含量。

原始菌液细菌密度为1.2*10⁸cfu/mL，稀释菌液的细菌密度分别为1.2*10⁷、1.2*10⁶、1.2*10⁵、1.2*10⁴cfu/mL。试验体系中细菌密度分别为6*10⁶、6*10⁵、6*10⁴、6*10³、6*10²cfu/mL。M.aeruginosa PCC 7806、A.eucompacta CHAB 1799和C.raciborskii CHAB151的初始接种量分别为0.86±0.01、0.87±0.02、0.65±0.02mg/L。结果如图6所示，当试验体系中细菌密度为6*10²cfu/mL时，CHAB 1799、CHAB 151的生长曲线与空白对照几乎一致，而PCC 7806的生长仍然受到明显抑制。细菌密度为6*10³cfu/mL时，PCC 7806的生长依然受抑制，CHAB 1799的生长受到显著抑制，而CHAB 151在接种后第3天，其叶绿素a含量与空白对照组差值仅为0.14±0.05mg/L，随着共培养时间的延长，CHAB 151的生长受到轻微的影响，其叶绿素a含量能够达到2.13±0.03mg/L，略低于正对照(2.52±0.07mg/L)。当细菌密度分别为6*10⁴、6*10⁵、6*10⁶cfu/mL时，三种藻的生长均受到强烈抑制。综合以上分析，菌株WP抑制微囊藻PCC 7806生长的细胞密度阈值小于或等于6*10²cfu/mL，鱼腥藻CHAB1799和拟柱孢藻CHAB 151分别为6*10³、6*10⁴cfu/mL。

4.2不同生长时期的细菌对溶藻效果的影响

取停滞期(OD_600nm＝0.15)、对数期(OD_600nm＝1.2)、稳定期(OD_600nm＝1.5)的菌液，分别以体积比5％添加到藻液中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，每隔3天取样测定其叶绿素a的含量。

不同生长时期的细菌对PCC 7806、CHAB 1799和CHAB 151的溶藻效果三种藻液的初始叶绿素a含量分别为0.87±0.01、1.00±0.01、0.79±0.03mg/L。结果如图7所示，停滞期、对数期和稳定期的菌液分别与藻液共培养9天后，三个时期的菌液对PCC 7806的溶藻效率分别为89.84±0.28、92.19±0.71、86.31±0.50％，对CHAB 1799的溶藻效率分别为70.72±1.50％、74.66±1.34％、72.57±2.74％，对CHAB 151的溶藻效率分别为84.87±1.24、88.61±0.38、85.83±0.41％。从图中可以明显看出三个处理组的生长曲线几乎一致，三个时期的菌液对这三种藻均有强烈的抑制效果。可见，菌体的生长时机并未对溶藻效率产生很大的影响。

4.3不同生长时期藻液对溶藻效果的影响

取对数后期(OD_600nm＝1.2)的菌液，以体积比5％分别添加到处于停滞期、对数期、稳定期的藻液中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，每隔3天取样测定其叶绿素a的含量。

结果如图8所示：PCC 7806三个时期的初始叶绿素a含量分别为0.82±0.02、1.52±0.01、4.44±0.05mg/L，菌液接种9天内，停滞期对照组和对数期对照组藻的生长曲线一直处于急剧上升的状态，稳定期对照组的叶绿素a含量略有下降，所有处理组的叶绿素a含量均下降，藻的生长均受到抑制。试验结束时，即菌液接种第16天，停滞期、对数期、稳定期的溶藻效率分别为99.86±0.25、97.79±0.73、67.24±4.28％。

停滞期、对数期、稳定期的CHAB 1799的初始叶绿素a含量分别为0.69±0.02、1.30±0.01、2.16±0.02mg/L。菌液接种后第3天，对照组的叶绿素a含量均上升，CHAB 1799生长正常，试验组的叶绿素a含量均下降，藻的生长受到抑制。在接种后第6天，停滞期试验组的叶绿素a含量急剧下降到0.20±0.03mg/L。试验期间，对数期试验组和稳定期试验组的叶绿素a含量几乎均呈直线下降趋势，在菌液接种后第15天，其叶绿素a含量分别下降到0.08±0.02、0.31±0.05mg/L，溶藻效率分别达到96.78±0.88％、88.26±1.91％。

CHAB 151的初始叶绿素a含量分别为0.76±0.03(停滞期)、1.61±0.01(对数期)、2.44±0.02mg/L(稳定期)。试验周期内，所有试验组的叶绿素a的含量缓慢降低，对数期对照组、稳定期对照组的藻的生长曲线呈缓慢上升趋势。停滞期对照组在接种后第3天，叶绿素a的含量相对初始状态只增加0.12±0.03mg/L，CHAB 151在接种后有个短暂的调节适应期，随后其叶绿素a的含量急剧增加，藻迅速生长到稳定期。菌液接种第16天，三个时期的溶藻效率分别为92.05±1.27、80.63±0.95、54.28±0.70％。

可见，菌株WP对微藻的溶菌效率不受微藻生长阶段的影响。

4.4菌株WP的溶藻对象范围

取对数后期(OD_600nm＝1.2)的菌液，以体积比5％分别添加到PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151、乌克兰鱼腥藻A.ucrainica CHAB 3612、尖头藻Raphidiopsis sp.CHAB HB2、微小平裂藻Merismopedia tenuissima CHAB7021、盘星藻Pediastrum sp.CHAB 6560、聚球藻Synechococcus sp.FACHB805、肥壮角星鼓藻Staurastrum pingue FACHB 1449、小空星藻Coelastrum microporum FACHB 1451、双对栅藻Scenedesmus bijuga NIES 2273中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，7天后取样测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。

结果如表3所示，菌株WP对所有试验的蓝藻均有溶藻作用，不同水华蓝藻的溶藻效率不等，同种水华蓝藻不同株的溶藻效率也不尽相同，范围在44-95％之间。而对于绿藻而言，菌株WP对试验的所有绿藻几乎没有溶藻作用，其中菌株WP对Pediastrumsp.CHAB 6560的溶藻效率最高，但也只有23.54±0.85％。

表3菌株WP对各藻株的溶藻效率

注：“—”表示溶藻效率低于10％。

4.5温度对溶藻效果的影响

共设置3个温度梯度，分别为15、25、35℃，每个温度均设置空白对照。取对数后期(OD_600nm＝1.2)的菌液，以体积比5％添加到藻液中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，每隔3天取样测定其叶绿素a的含量。PCC7806、CHAB 151的初始接种浓度分别为0.87±0.01、0.76±0.06mg/L。

结果如图9所示，PCC 7806在菌液接种第3天，所有处理组的叶绿素a的含量均下降，25和35℃对照组的藻正常生长，15℃对照组的叶绿素a的浓度略微下降，藻的生长受到低温的抑制。试验周期内，35℃对照组的叶绿素a的浓度均高于25℃，PCC 7806在35℃条件下生长较25℃好。15℃对照组的藻在接种第6天开始进入快速生长阶段，第9天叶绿素a含量达到1.62±0.18mg/L，与25℃对照组仍差异极显著(p<0.01)。在试验周期内，所有处理组的叶绿素a的含量一直处于下降的状态，在接种第9天，几乎检测不到其叶绿素a。

CHAB 151在接种第3天，所有对照组和处理组的叶绿素a的含量几乎保持不变。25和35℃对照组在接种第3天后开始进入正常生长状态，其叶绿素a的含量均急剧增加，但35℃对照组的叶绿素a的含量一直高于25℃，接种第9天，25和35℃对照组之间叶绿素a的浓度差异显著(p<0.05)。15℃对照组在接种第3天，叶绿素a的含量略微下降，直到接种第6天，略微上升，但其叶绿素a的含量仍低于初始接种量，接种第6天到试验结束期间，其含量才有个缓慢上升的过程，但远低于25和35℃对照组。试验周期内，所有处理组的叶绿素a的浓度均缓慢下降，CHAB 151的生长受到抑制作用，三个温度条件下藻的生长曲线几乎一致，无明显差别。

可见，温度仅对微藻自身的生长有影响，并不会影响菌株WP的溶藻效果。

4.6光照强度对溶藻效果的影响

共设置3个光照强度，分别为10、30、60μmol·m^-2·s^-1，每个光照强度均设置空白对照。取对数后期(OD_600nm＝1.2)的菌液，以体积比5％添加到藻液中，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，每隔3天取样测定其叶绿素a的含量。

不同光照强度下，菌株WP对三种藻的溶藻曲线如图10所示。PCC 7806、CHAB 1799、CHAB 151的初始接种浓度分别为0.87±0.01、1.10±0.03、0.72±0.01mg/L。PCC 7806在菌液接种第3天，所有对照组叶绿素a浓度均上升，所有处理组均下降，随接种时间的延长，对照组与处理组的叶绿素a含量的差值越大。在光照强度为30μmol·m^-2·s^-1时，对照组PCC7806的生长较10、60μmol·m^-2·s^-1好。光照强度为60μmol·m^-2·s^-1时，对照组CHAB 1799的叶绿素a含量先下降、后缓慢回升，直到接种第6天，叶绿素a含量急剧增加。对照组CHAB1799在光照强度为10、30μmol·m^-2·s^-1时，在接种前3天，有个短暂的适应过程，随着时间的延长，CHAB 1799旺盛生长，其叶绿素a含量急剧增加。处理组在三个光照强度下，CHAB1799的叶绿素a含量均缓慢下降，生长受到抑制。同CHAB 1799，所有对照组、处理组的CHAB151在接种前3天均有个短暂的适应过程。处理组在三个光照强度下，CHAB 151的叶绿素a含量均缓慢下降，生长均受到抑制。对照组CHAB 151在光照强度分别为30、60μmol·m^-2·s^-1时，生长曲线几乎一致，无明显差别，较10μmol·m^-2·s^-1生长迅速。

可见，光照强度的差异不会明显影响其溶藻效率。

5.菌株WP菌体对水华蓝藻的溶藻效果

取对数后期(OD_600nm＝1.2)的发酵液室温离心(10000g，10min)，沉淀为菌体，用新鲜无菌R2A液体培养基将沉底洗3遍，最后等体积重悬。以体积比5％将重悬的菌体加到藻液中，发酵液为阳性对照，以R2A为空白对照，培养条件如上文所述，7d后测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。

结果显示，菌体和发酵液溶藻效率分别为87.63±1.76、88.32±1.27％(PCC7806)；73.64±0.08％、75.21±2.00％(CHAB 1799)；83.57±1.06、85.16±1.21％(CHAB151)。

可见，本发明的菌株WP的发酵液、菌体对三种蓝藻均有强烈的溶藻作用。经新鲜R2A培养基洗菌3遍的菌体基本不含其代谢产物，然而仍对供试藻种有较强的溶藻效果，这区别于已经发现的Lysinibacillus属溶藻菌(卢兰兰等，2009；刘国勇等，2012；张菊等，2017)，他们发现的Lysinibacillus属溶藻菌的菌体本身并没有溶藻效果，而是依靠发酵液中的非细胞成分来产生溶藻作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种溶藻细菌，所述溶藻细菌保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏号为CCTCC NO:M2018093。

2.权利要求1所述的溶藻细菌在去除水体中的微藻的应用，所述微藻为一种或多种蓝藻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微藻选自微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻、尖头藻、微小平裂藻和聚球藻中的一种或多种组合。

4.一种去除水体中微藻的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的溶藻细菌的菌体或其培养物添加至含有一种或多种蓝藻的水体中并进行共培养的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述溶藻细菌的培养物为液体培养物。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，向所述水体中添加所述溶藻细菌的量使所述溶藻细菌的含量不低于6×10²cfu/mL。

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