CN110184226B - 芽孢杆菌Mangrove-2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用途和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及芽孢杆菌Mangrove‑2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用途和方法。菌株Mangrove‑2008的保藏编号为CCTCC M 2019355，保藏日期为2019年5月14日。该菌株生长周期较短，所需的发酵条件相对简单，利用菌株Mangrove‑2008拮抗黑曲霉的生长，避免了化学防治对环境和粮食安全的潜在不良影响，且其代谢产物和菌株本身均可以有效的抑制黑曲霉的生长，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，具有十分重要的应用价值。

Description

芽孢杆菌Mangrove-2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用 途和方法

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及芽孢杆菌Mangrove-2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用途和方法。

背景技术

黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，是曲霉属真菌中的一个常见种，存在于潮湿的土壤、空气等环境中。在适宜的条件下，黑曲霉能够大量的生长繁殖，从而造成粮食的营养品质下降、种用品质下降、工艺和食用品质变劣。更有可能产生有毒的代谢产物，严重影响和危害人们的健康。因此如何预防和控制黑曲霉对粮食的影响，人们从粮食的种植、收割、运输到储藏条件都采取了不同的措施。物理法和化学法是目前主要的黑曲霉防治方法，化学方法主要是采用各种化学药剂来实现防治；而物理法主要是采用低温或者辐射等不同的方式来实现。采用化学方法会导致相关药剂残留，对于食品安全产生一定的威胁或者影响，采用物理方法，对仪器要求较高，不便于使用。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一株新的芽孢杆菌Mangrove-2008，其具有抑制黑曲霉生长的作用。

为了实现上述目的，本发明的芽孢杆菌Mangrove-2008是从深圳坝光红树林(N22°39′，E114°30′)采集的海泥中分离获得，采用滤纸片法筛选出的一株对黑曲霉菌丝抑制率达78.7％的拮抗菌株，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC M 2019355，保藏日期2019年5月14日。

菌株Mangrove-2008在LB培养基上培养，对其菌落形态进行观察，菌落形态为圆形，边缘形状不光滑，呈乳白色，该菌株的菌落形态如图1所示，划线培养形态如图2所示，Mangrove-2008菌体呈杆状，芽孢杆类型，革兰氏染色呈阳性，芽孢染色如图3所示。

菌株Mangrove-2008的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供由所述的芽孢杆菌Mangrove-2008制备的菌剂。

所述菌剂中芽孢杆菌Mangrove-2008的活菌浓度≥1×10⁷cfu/ml。

所述菌剂中可以包括其他成分，例如可以含有规定的载体、粘合剂、增稠剂、固着剂、防腐防霉剂、溶剂、稳定化剂、抗氧剂、防紫外线剂、防晶体析出剂、消泡剂、物性提高剂、着色剂等其中的一种或多种。另外，还可以含有其他农药成分、例如杀螨剂、杀线虫剂、杀菌剂、抗病毒剂、诱导剂、除草剂、植物生长调节剂、增效剂等其中的一种或多种。

所述菌剂的剂型没有特别限定，例如可以为乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水合剂、水溶剂、液剂、流动剂、颗粒水合剂、气溶胶剂、糊剂、油剂、乳浊剂等其中的一种或多种形式。

所述菌剂的施用量，根据有效成分的浓度、制剂的形态、施用对象的种类、被害的程度、施用场所、施用方法、施用时期、混用的药剂或肥料等的使用量、种类等各种条件，可以适当选择。

本发明还提供所述的芽孢杆菌Mangrove-2008或由其制备的菌剂在抑制黑曲霉生长中的用途。

本发明进一步提供一种抑制黑曲霉生长的方法，将所述的芽孢杆菌Mangrove-2008的培养液进行离心，所得上清液施用于黑曲霉生长处。

另一种抑制黑曲霉生长的方法：将芽孢杆菌Mangrove-2008的活体菌配制成菌悬液施用于黑曲霉生长处。

进一步地，选择生长成熟的菌株Mangrove-2008，挑取单菌落接种于最佳液体培养基中(所述最佳液体培养基包括以重量百分比计的葡萄糖2％，酵母提取物2.4％，MgSO₄·7H₂O 0.2％，小牛浸膏0.3％，NaCl 0.5％，pH8.0，蒸馏水配制)，200r/min，37℃恒温震荡培养12h，制成菌液。将得到的菌液离心，使用滤网过滤，获得包含芽孢杆菌Mangrove-2008次生代谢产物的上清液和芽孢杆菌Mangrove-2008的活体菌，将活体菌用无菌水配制成菌悬液(活菌浓度≥1×10⁷cfu/ml)，上清液和菌悬液分别施用于黑曲霉生长处，对黑曲霉的生长均有较好的抑制效果，表明该菌株对黑曲霉具有良好的拮抗作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

利用本发明提供的芽孢杆菌Mangrove-2008对黑曲霉进行抑制，与物理防治相比明显提高了抑菌效果和抑菌效率，同时避免了化学防治对环境和粮食安全的潜在不良影响，芽孢杆菌Mangrove-2008活体菌及其代谢产物对黑曲霉均有良好的拮抗作用，平板实验中Mangrove-2008培养上清液含量为8ml时对黑曲霉菌丝生长的抑制效果较好，抑菌率可达到78.70％；培养上清液含量为5ml时对面粉上生长的黑曲霉的抑菌率超过80％；菌悬液浓度为1×10⁷cfu/ml时对黑曲霉的抑菌率超过50％，浓度为1×10⁹cfu/ml时抑制率达到93.6％，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，具有良好的生态效益和经济效益前景。

附图说明

图1为菌株Mangrove-2008的菌落形态。

图2为菌株Mangrove-2008的划线培养形态。

图3为菌株Mangrove-2008的芽孢染色。

图4为菌株Mangrove-2008的系统进化树。

图5为菌株Mangrove-2008在不同培养基上的生长情况。

图6为菌株Mangrove-2008的生长曲线。

图7为不同碳源对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图8为不同氮源对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图9为不同无机盐对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图10为不同浓度葡萄糖对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图11为不同浓度蛋白胨对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图12为不同浓度MgSO₄·7H₂O对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图13为初始pH对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图14为温度对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图15为转速对菌株Mangrove-2008生长的影响。

图16为平板实验中菌株Mangrove-2008的对黑曲霉的抑制效果，图中从左至右分别为培养上清液的含量为8ml、6ml、4ml、2ml和0的带药培养基。

图17为平板实验中菌株Mangrove-2008对黑曲霉的抑制率。

图18为菌株Mangrove-2008的培养上清液在面食制品中对黑曲霉的抑制效果，图中从左至右分别为未加入上清液、加入5ml稀释2倍、稀释1倍和未经稀释的上清液的培养基。

图19为菌株Mangrove-2008的培养上清液在面食制品中对黑曲霉的抑制率。

图20为菌株Mangrove-2008的菌悬液在面食制品中对黑曲霉的抑制率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下具体实施例中所使用的材料均可通过常规方式购买得到，所采用的菌株分离和培养方法均为本领域熟知选用的，涉及到的％除特别指出外都为重量百分比。

实施例1芽孢杆菌Mangrove-2008的分离获得

选取深圳坝光红树林(N22°39′，E114°30′)作为采集点，取少量采集的海泥匀浆，在无菌试管中进行常规10x梯度稀释，获得稀释度为10-²-10-⁷6个梯度样品。从10-⁵-10-⁷3个浓度梯度样品分别取200μL样品稀释液分别涂布于LB、NA、马铃薯培养基PDA、牛肉膏蛋白胨培养基ND的固体分离培养基上，37℃培养2-3天后观察菌落。按其边缘形状、颜色，形态、的差别，从平板中挑取典型菌落利用三区划线法接种于对应的分离培养基上，获取纯单菌株。最终将分离得到的纯培养物接种于相应的斜面培养基，保存在4℃冰箱备用。

挑选已成熟的菌株接种在发酵培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养2d，取上清液测定抗菌活性，设置三个重复组，采用琼脂扩散法。初筛用滤纸片法：用打孔器裁剪出直径为5mm的滤纸片，经高压蒸汽灭菌后取两层滤纸片沾取发酵上清液，放置在已加有黑曲霉的平板表面，每个样品设置3个重复组，培养1-2d，测量后比较产生的抑菌圈直径大小，复筛方法同初筛。筛选得到一株对黑曲霉具有明显拮抗作用的菌株Mangrove-2008。

实施例2芽孢杆菌Mangrove-2008的观察与鉴定

将菌株Mangrove-2008接种于LB培养基上，观察并记录菌落的状态，其菌落形态如图1所示，划线培养结果如图2所示。测量菌落的直径大小，有无菌膜等；并对Mangrove-2008菌株用化学染料进行芽孢染色、革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察并记录其结果。其菌落特征如表1所示，芽孢染色如图3所示。

采用常规方法提取16S DNA，进行PCR扩增，产物由湖南擎科生物技术有限公司测序。测序结果用MEGA 6.0构建系统进化树，如图4所示。

结合该菌的生理生化、微生物学检测结果，以及16S rDNA测序结果(见SEQ IDNO.1)，最终确定菌株Mangrove-2008为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。

表1 Mangrove-2008菌落特征

实施例3芽孢杆菌Mangrove-2008的培养条件优化

1.菌株基础培养基的筛选

选用LB培养基、PDA培养基、YEB培养基、NA培养基、肉汤琼脂培养基五种培养基进行筛选。挑取生长成熟的菌株，接种于基础液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h制成种子液，取3％种子液分别接种于不同的培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h，观察比较结果，菌液浓度均通过分光光度计OD₆₀₀测定，如图5所示，结果显示芽孢杆菌Mangrove-2008在NA培养基上生长效果最佳，因此选用NA培养基作为后续研究的基础培养基。

2.菌株生长曲线的测定

挑取生长成熟的菌株，接种于基础液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养，每隔2h取样一次，在OD₆₀₀下测定菌液的浓度，连续测量24h，绘制生长曲线如图6所示，在基础培养基上Mangrove-2008的生长曲线为典型的“S”型曲线，并且在12h左右达到生长量的高峰。

3.培养条件的优化

在以NA为基础培养基，选择不同碳源、氮源、无机盐等单因素的实验基础上，经过正交实验优化配比，筛选出最佳培养基组合。菌液浓度均通过分光光度计OD₆₀₀测定。

(1)培养基组分种类优化

在NA基础培养基的其它组分不改变的情况下，分别以葡萄糖、木糖、马铃薯淀粉、蔗糖作为碳源，以酵母提取物、蛋白胨、NH₄NO₃、KNO₃作为氮源，以NaCl、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄+K₂HPO₄(1:1)复合盐和ZnSO₄·7H₂O作为基础培养基中的无机盐，分别制成液体培养基，并加入3％种子液，200r/min，37℃恒温震荡培养12小时，设置3个重复组，OD₆₀₀测定菌液浓度，获得最优的碳源、氮源、无机盐。

如图7、图8、图9所示，Mangrove-2008菌株对葡萄糖的利用能力最强，以酵母提取物作为氮源时菌体的生长情况显著优于其他氮源，菌株生长的最佳无机盐为MgSO₄·7H₂O。

(2)培养基组分浓度优化

在已知最优单因素、NA基础培养基中的其他组分不改变的条件下，碳源的质量分数固定为0.1％、0.2％、0.25％、0.4％、1.0％、2.0％，氮源质量分数为0.3％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％和1.5％，无机盐离子质量分数为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，摇瓶培养方法同上，获得最优的单因素浓度。

如图10所示，发酵培养基中葡萄糖质量分数为1.0％时，Mangrove-2008菌体生长量最大，OD值达到2.044，从而确定葡萄糖的最佳质量分数为1.0％。

如图11所示，Mangrove-2008的OD值在0.3％-1.0％之间变化不大，当酵母提取物质量分数达到1.2％时OD值达最大值1.942，然后开始缓慢下降。因此酵母提取物的最佳质量分数为1.2％。

如图12所示，Mangrove-2008的OD值随着MgSO₄·7H₂O的质量分数的增大呈现先上升后下降的趋势，在镁离子浓度达到0.4％时，菌体的生长量处在较高的水平，OD值也达到了最大值。因此Mangrove-2008的最优无机盐MgSO₄·7H₂O的最佳质量分数为0.4％。

(3)正交实验

通过以上的单因素实验，确定了芽孢杆菌Mangrove-2008生长所需的最优碳源、氮源、无机盐及其浓度。选用3因素3水平L9(33)正交表对这三个因素进行实验，以此确定培养基中各组分的最佳配比。

表2 Mangrove-2008正交实验因素和水平

表3 Mangrove-2008正交实验指标结果

表4 Mangrove-2008正交实验方差分析

根据单因素实验Mangrove-2008生长所需最佳培养基的最佳组合，推得Mangrove-2008的最佳培养基为：葡萄糖1％，酵母提取物1.2％，MgSO₄·7H₂O0.4％。由表3可知，极差值的大小为B>A>C，即影响Mangrove-2008菌株菌体生长的因素主次顺序分别为：酵母粉>葡萄糖>MgSO₄·7H₂O。

根据正交实验的结果可以确定各组分的零水平并优化其配比，由此得到的最适培养基为：Mangrove-2008：葡萄糖2％，酵母提取物2.4％，MgSO₄·7H₂O 0.2％，小牛浸膏0.3％，NaCl 0.5％。

4.发酵条件的优化

在以获得的最佳培养基为基础培养基，选择不同pH(6、7、8)、温度(28℃、37℃、46℃)、转速(150r/min、180r/min、210r/min)等单因素进行实验，经过实验得到最佳条件，筛选出最佳发酵条件，菌液浓度测定同上。

(1)将Mangrove-2008最优培养基的初始pH分别调至6、7、8，摇瓶发酵培养12h，利用分光光度计测定OD600，由图13可知，随着pH值的增大，OD值也随之增大，在pH为8时达到了最大值。说明Mangrove-2008在弱酸性和中性条件下可以生长，而在偏碱性条件下生长更好，因此选择8为Mangrove-2008的最适pH值。

(2)将Mangrove-2008最优培养基分别置于28℃、37℃、46℃下进行培养，测定方法同上，由图14可知，Mangrove-2008在46℃培养时菌体中的酶因为温度过高而逐渐失活，因此OD值急剧下降，菌体生长量明显变小。而在28℃、37℃下长势良好，并在28℃时OD值达到了最大，因此选择28℃作为Mangrove-2008的最适温度。

(3)将Mangrove-2008最优培养基分别置于150r/min、180r/min、210r/min下进行培养，测定方法同上，由图15可知，Mangrove-2008在转速为180r/min时OD最大，达到1.92，因此选择180r/min为最佳转速。

实施例4芽孢杆菌Mangrove-2008的抑菌效果

在超净工作台上，选择生长成熟的菌株Mangrove-2008，挑取单菌落接种于最佳液体培养基中，200r/min，37℃恒温震荡培养12h，制成种子液。将得到的菌液离心，使用滤网将菌体过滤，得到上清液，同时将过滤的菌体用无菌水配制成菌悬液。

1.不同浓度Mangrove-2008培养上清液对黑曲霉菌丝生长的抑制作用

在PDA培养基中加入不同量的Mangrove-2008培养上清液制成带药培养基，倒平板，固定平板体积为25ml，使得最终培养上清液的含量分别为2ml、4ml、6ml、8ml，以不加Mangrove-2008培养上清液的平板作为对照，将黑曲霉分别接种于不同梯度浓度培养上清液的PDA平板中间，设置3组重复，28℃恒温培养。每天观察并记录数据，算出抑菌率。

菌落生长抑制率＝(对照生长直径－处理生长直径)/对照生长直径×100％。

如图16和图17所示，正常生长的黑曲霉菌丝体均匀地分布于整个PDA培养基平板上，菌丝体生长良好，孢子成长较好，而经处理的黑曲霉生长出现明显抑制效果。随着发酵液浓度的不断增加其抑制效果越明显，在6mL的发酵液浓度下抑制效果变得明显，8mL的发酵液浓度基本可以抑制住黑曲霉孢子的生长。Mangrove-2008菌株8mL的发酵液对黑曲霉的抑菌率可达到78.70％。

2.不同浓度Mangrove-2008培养上清液和不同浓度Mangrove-2008菌悬液对馒头黑曲霉生长的抑制作用

(1)取适量面粉灭菌后做成糊状均匀平铺在平板中，将在摇床中培养12h的种子液过滤除菌得到上清液，取5ml未经稀释、稀释1倍、稀释2倍的上清液分别加入平板，再将1μl黑曲霉液滴于平板中央，设置3组重复。28℃培养2天，观察黑曲霉生长情况。

如图18和图19所示，三个梯度的滤液平板中黑曲霉均有不同程度的抑制效果，其中未经稀释的滤液对黑曲霉的抑制效果最好，抑菌率超过80％。

(2)取适量面粉灭菌后做成糊状均匀平铺在平板中，将Mangrove-2008培养液过滤得到的菌体用无菌水分别配制成浓度为1×10⁷cfu/ml、1×10⁸cfu/ml、1×10⁹cfu/ml的菌悬液，各取5ml分别加入平板，再将1μl黑曲霉液滴于平板中央，设置3组重复。28℃培养2天，观察黑曲霉生长情况。

如图20所示，三个浓度梯度的菌悬液对黑曲霉均有不同程度的抑制效果，其中浓度为1×10⁷cfu/ml的菌悬液抑菌率为56.3％，浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液抑菌率为85.5％，浓度为1×10⁹cfu/ml的菌悬液抑菌率达到93.6％。

综上所述，菌株Mangrove-2008可以有效防治黑曲霉对面食制品的污染，具有较高的实际利用与开发价值。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 芽孢杆菌Mangrove-2008、菌剂及其在抑制黑曲霉生长中的用途和方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 1

ccttaggcgg ctggctccaa aaaggttacc ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt 60

ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120

gattactagc gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaac 180

ggttttatga gattagctcc acctcgcggt cttgcagctc tttgtaccgt ccattgtagc 240

acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300

gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caacttaatg atggcaacta agatcaaggg 360

ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420

ccacctgtca ctctgctccc gaaggagaag ccctatctct agggttttca gaggatgtca 480

agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg 540

ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc ttgcggccgt actccccagg cggagtgctt 600

aatgcgttaa cttcagcact aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta 660

cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagtgt 720

cagttacaga ccagaaagtc gccttcgcca ctggtgttcc tccatatctc tacgcatttc 780

accgctacac atggaattcc actttcctct tctgcactca agtctcccag tttccaatga 840

ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccacct gcgcgcgctt 900

tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960

agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtgcc agcttattca actagcactt 1020

gttcttccct aacaacagag ttttacgacc cgaaagcctt catcactcac gcggcgttgc 1080

tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140

gccgtgtctc agtcccagtg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgttgcct 1200

tggtgagccg ttacctcacc aactagctaa tgcgacgcgg gtccatccat aagtgacagc 1260

cgaagccgcc tttcaatttc gaaccatgcg gttcaaaatg ttatccggta ttagccccgg 1320

tttcccggag ttatcccagt cttatgggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc 1380

gctaacttca taagagcaag ctcttaatcc attcgctcga cttgcagtat agcacgccgc 1440

gcc 1443

Claims (5)

1.芽孢杆菌(Bacillus sp.)Mangrove-2008，其保藏编号为CCTCC M 2019355，保藏日期2019年5月14日。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌Mangrove-2008在制备治疗黑曲霉病的药物中的应用。

3.一种由权利要求1所述的芽孢杆菌Mangrove-2008制备的菌剂。

4.根据权利要3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中芽孢杆菌Mangrove-2008的活菌浓度≥1×10⁷cfu/ml。

5.根据权利要求3所述的菌剂在制备治疗黑曲霉病的药物中的应用。

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