CN104988091A - 一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术应用领域。本发明提供了一种新的菌株；一种解淀粉芽孢杆菌，保藏菌株名称为Bacillus amyloliquefaciens F1，其保藏号为CGMCC No.10942，保藏日期为2015年6月1日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的保藏号为CGMCC No.10942的Bacillus amyloliquefaciens F1够产抗真菌蛋白，能够有效抑制黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黄曲霉等真菌生长及产毒。本发明的菌株所产抗菌蛋白能够抵抗霉菌对黑胡椒的侵染，削弱霉菌菌丝的生长能力，保护黑胡椒的有效成分，减少黑胡椒质量的损失和劣变。本发明的菌株及其代谢物可开发成无残留、安全、高效的食品保护剂，延长食品的货架期，提高食品安全性。

Description

一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物与生物技术领域，具体涉及一株从市售黑胡椒表面筛选出的具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其在黑胡椒储藏中的应用。

背景技术

丝状真菌和酵母是导致发酵乳制品、谷类食品、果蔬以及粮食等食品发生腐败的普通微生物类群。据估计，全球5％～10％的食品损失是由真菌引起的。在西欧，每年由霉菌引起的面包腐败导致的经济损失高达20亿英镑。据报道青霉和曲霉是引起食品腐败的主要真菌微生物。我国是一个农业大国，由于农作物病虫害发生普遍和危害严重，每年因病虫害造成的粮食损失1,000万吨以上，其中80％以上的农作物病害是由真菌侵染引起的。黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种常见的霉菌，是子囊菌亚门(Ascomycotina)、曲霉属(Aspergillus)一种常见的腐生型好氧真菌，不仅污染食品和饲料，而且可引起人类和动物的多种疾病。黄曲霉的次生代谢产物黄曲霉毒素具有很强的毒性，研究报道其具有致癌性、致突变、致畸性，降低免疫力，并可引起肝部损伤等危害。目前，防治黄霉菌及其毒素污染的重要手段是使用抗生素及化学制剂，但随之导致耐药性细菌产生及抗生素残留等问题，对食品安全造成重大影响，因此亟需开发新的手段来进行霉菌及其毒素污染的防治。越来越多的研究发现，某些细菌，包括芽孢杆菌，可抑制霉菌的生长及其产毒，在防治黄曲霉及其毒素污染方面显现出广阔的应用前景。许多研究发现，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在生长过程中可以产生一系列抑制真菌和细菌活性的代谢物，已证实的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肽类抗生素、大环类酯类、肽类、聚酮化合物等，在抑制病原菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的用途。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌，可减轻黑胡椒储藏中真菌及其毒素污染，而避免或减少使用化学抑菌剂和抗生素来抵抗霉菌对黑胡椒的侵染，为开发无残留、安全、高效的食品保护剂提供新的手段，以延长食品的货架期，提高食品安全性。

本发明从市售黑胡椒体表分离出一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.10942，保藏日期为2015年6月1日，菌种的分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens F1。

本发明中的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens F1具有以下生物学特性：

(1)形态特征：经革兰氏染色后在生物显微镜下观察，菌体为紫色阳性，短杆状，内生芽孢；透射电镜下可清晰地看到菌体呈典型的棒状杆菌，大小约30μm，单生，有鞭毛，见图1；

(2)菌落特征：将筛选出的拮抗菌F1先在营养肉汤培养基37℃培养24h，可观察到有菌膜产生；后在营养肉汤固体培养基上进行划线培养，37℃培养48h后观察，菌落较大约6.0mm，表面膜状有褶皱，侧面高凸起，幼龄菌挑起十分粘稠，随着培养时间的增加，菌落分散成雪花状，灰白色不透明，见图1；

(3)生理生化特征：不产生吲哚，V-P试验、甲基红试验均为阳性；氧化酶、接触酶、淀粉酶、卵磷脂酶亦均为阳性；糖发酵试验结果为，不能利用甘露醇和乳糖，可发酵麦芽糖、蔗糖、葡萄糖但不产气；

(4)生长特性：对菌株F1进行生长特性研究，获得其最适生长温度为25-32℃，最高可耐受45℃高温，最低可耐受20℃。可生长pH值为5.0-8.0，最适生长pH为5.5。耐盐性试验表明，菌株可在低于10％氯化钠浓度的培养基中生长，最适生长盐浓度为5％；

(5)抗真菌特性：抑制黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黄曲霉等真菌生长及产毒；能产抗真菌蛋白。

本发明的有益效果是：

芽解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在生长过程中可以产生一系列抑制真菌和细菌活性的代谢物，已证实的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肽类抗生素、大环类酯类、肽类、聚酮化合物等，在抑制病原菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的用途，以芽解淀粉芽孢杆菌及其代谢产物研发新型抑菌剂和微生态剂对食品、饲料等加工、储藏过程中真菌的生物防治具有潜在价值和广阔前景。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens F1对黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黄曲霉具有较强抑制作用。本发明的菌株能产抗真菌蛋白，该蛋白具有较强的pH稳定性和热稳定性，其能有效降低黄曲霉浸染黑胡椒模型中的黄曲霉毒素含量。

附图说明

图1为本发明菌株Bacillus amyloliquefaciens F1的菌落形态及微观结构示意图(注A，革兰氏染色；B，平板培养单菌落；图C和D，扫描电镜结果)。

图2为本发明菌株Bacillus amyloliquefaciens F1发酵上清液对毛霉的抑制作用示意图。

图3为本发明菌株Bacillus amyloliquefaciens F1发酵液及其超滤液对黄曲霉的抑制作用示意图。

图4为本发明菌株Bacillus amyloliquefaciens F1抗菌蛋白对黄曲霉菌丝生产的影响示意图。

具体实施方式

实施例1 Bacillus amyloliquefaciens F1对霉菌生长的抑制作用

霉菌培养及孢子悬液制作：将保存在PDA斜面培养基上霉菌接种到PDA平板，28℃培养箱内培养4d后，加入一定量的无菌PBS缓冲液，用灭菌大枪头尖头轻刮培养基上的孢子，然后将含有霉菌孢子和菌丝的混悬液通过灭菌八层纱布的蓝盖瓶中以过滤掉霉菌菌丝，涡旋震荡，10倍稀释法分别稀释10、100、1000倍后，血球计数板计数，然后将计数好的霉菌孢子原液用无菌PBS缓冲液统一调整至10⁵个/mL，4℃冰箱贮藏备用。

抑菌率测定：将分离并保种的Bacillus amyloliquefaciens F1，4℃解冻，吸取100μL菌液于5mL营养肉汤或MRS肉汤中培养活化，24h后取菌液6000r/min离心10min，0.22μm PES水系滤膜过滤除菌收集上清液。吸取1mL无菌上清液倾注至无菌平板内，倒入10mL PDA培养基轻轻混匀，待培养基冷却凝固，用直径为6mm打孔器在中央打孔，向孔中注入20μL浓度为10⁴个/mL的霉菌孢子悬液，空白培养基代替上清液作为对照，30℃培养3d后测霉菌直径，每组三个平行，以抑菌率(％)为拮抗细菌上清液的抑菌效果，抑菌率的计算公式为：抑菌率(％)＝(对照组直径－试验组直径)×100/对照组直径。

在上述测试条件下，Bacillus amyloliquefaciens F1发酵液对黄曲霉、毛霉、黑曲霉、和寄生曲霉的抑菌率分别达到75.2％、62.8％、66.3％和14.3％。其中，Bacillusamyloliquefaciens F1发酵液对毛霉的抑菌效果见图2。

实施例2 Bacillus amyloliquefaciens F1发酵液及其超滤液的抑菌特性

分别选取膜截留分子量100ku、30ku和3ku的超滤膜对菌株F1发酵上清液进行超滤，各部分超滤液的抑菌活性如图3所示，100ku滤过液的抑菌性略高于原上清液的抑菌活性；30ku滤过液和3ku滤过液的抑菌活性分别下降65.31％和80.61％。综上，菌株F1所产抗真菌物质分子量范围在30ku～100ku。为进一步证实该物质是否为蛋白类物质，分别选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K，以菌株F1超滤液(30ku～100ku)为底物进行酶解后检测其抑菌活性。经过三种蛋白酶处理后，超滤液(30ku～100ku)的抑菌活性均出现不同程度的下降，其中胰蛋白酶处理后的超滤液的抑菌活性下降了70％，结果表明，抗菌超滤液对蛋白酶较为敏感，初步确定30ku～100ku超滤液中含有能抑制黄曲霉的蛋白类抗菌物质。

在温度50℃-70℃范围内，抗菌超滤液对黄曲霉的抑菌活性变化不显著(P≥0.05)；当抗菌超滤液温度高于70℃时，随着温度的升高，其对黄曲霉的抑菌活性显著下降(P＜0.05)，但在100℃处理30min后仍能保持87.43％的抑菌活性，121℃高温处理30min后仍保留60.18％的抑菌活性；在pH值3.0-10.0范围内，相对抗菌活性均在70％以上，而在pH值5.0-9.0范围内，其相对抗菌活性均在80％以上。

实施例3 Bacillus amyloliquefaciens F1抗菌蛋白对黄曲霉菌丝生长的影响

黄曲霉孢子悬液制作方法同实施例1，将孢子浓度调整至10⁶个/mL。每个锥形瓶加入PDA(马铃薯葡萄糖液体培养基)150mL，高压灭菌后放至室温，每个锥形瓶加入300μL黄曲霉孢子悬液，空白对照组未加入Bacillus amyloliquefaciens F1超滤抗菌液，其余两组分别加入体积比10％、20％的超滤抗菌液，每组设三个平行，150r/min，30℃摇瓶培养3d，使用中速定性滤纸过滤培养液，蒸馏水冲洗三遍以除去培养基粘性成分，过滤得到的菌丝连同滤纸放入大号平皿中(滤纸和平皿提前烘干至恒重并记下重量)，90℃干燥烘干至恒重，之后将菌丝放入干燥器中充分干燥至恒重，则黄曲霉菌丝质量为干燥后的总体质量与干燥前平皿与滤纸质量之差。

表1

注：表中数据为三次平均结果，表示为平均值±标准差；CK为对照组，表示未添加超滤液；a,b表示培养体系中蛋白浓度分别为10μg/mL和20μg/mL。

由表1可以看出，预设两组试验组黄曲霉菌丝质量均低于仅接种黄曲霉孢子的对照组，分别降低了14.8％和35.7％，且加入20％F1抗菌超滤液的培养液中的菌丝质量显著低于对照组，研究表明B.amyloliquefaciens F1所产抗菌蛋白能够通过抑制孢子萌发而达到抑制黄曲霉生长的能力。本试验在灭菌的PDA培养液中加入了浓度为10⁶个/mL的黄曲霉孢子，由图4可以看出，加入了所筛拮抗菌B.amyloliquefaciens F1抗菌超滤液后，黄曲霉的生长受到一定程度抑制，菌丝抱团生长现象减弱，菌丝球变小，且抑制程度随着加入的超滤液的量的增加而增加。

实施例4 Bacillus amyloliquefaciens F1抗菌蛋白对黄曲霉毒素的抑制效果

黄曲霉孢子悬液制作方法同实施例1，将孢子浓度调整至10⁶个/mL。每个锥形瓶加入PDA(马铃薯葡萄糖液体培养基)150mL，高压灭菌后放至室温，每个锥形瓶加入300μL黄曲霉孢子悬液，空白对照组未加入Bacillus amyloliquefaciens F1超滤抗菌液，其余两组分别加入体积比10％、20％的超滤抗菌液，每组设三个平行，150r/min，30℃摇瓶培养5d，离心，收集上清液，准确量取15mL过滤液于50mL离心管中，加入10mL乙腈，涡旋振荡1min，重复三次后，5000r/min离心5min，取上清10mL过多功能净化柱，从多功能净化柱的收集池内转移3mL净化液到棕色具塞小瓶中60℃±1℃氮气吹干，分别加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，密闭混匀60s后，在40℃±1℃烘箱中衍生15min。样品衍生后于室温下氮气吹干，以600μL水-乙腈(85+15)溶解之，3000r/min离心15min，取上清液过膜到进样瓶中供测定用。色谱条件：色谱柱，RP-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温，20℃；流动相，乙腈(色谱纯)+水；荧光检测器激发波长，360nm；发射波长，440nm；进样量，10μL；流速，5mL/min。梯度洗脱如下：0～10min，15～40％乙腈；10～28min，40乙腈；28～30min，40～15乙腈。

表2

注：表中数据为三次平均结果，表示为平均值±标准差；CK为对照组，表示未添加超滤液；a,b表示培养体系中蛋白浓度分别为10μg/mL和20μg/mL。

由表2可见，未添加抗菌超滤液的黄曲霉培养组AFB1含量最高，达到267.5mg/L，而添加10％超滤液后，AFB1浓度减少了84.45％，添加20％超滤液的则未有真菌毒素检出。研究表明，菌株F1上清超滤液有效抑制了AFB1的生物合成。、

实施例5 Bacillus amyloliquefaciens F1在黑胡椒贮藏中的应用

准确称取50.00g黑胡椒于12cm平皿中，微波炉灭菌后于超净台冷却，转移至已灭菌的300mL锥形瓶中。灭菌黑胡椒为对照组(CK)，加入黄曲霉孢子(10⁴个/g)和无菌水，调整水分至18％后充分振荡混合均匀，只添加黄曲霉孢子为阳性对照组(PositiveControl,PC)，黄曲霉孢子侵染后以F1超滤抗菌液代替无菌水后充分振荡为试验组(Experiment,EP)，培养箱中30℃密闭培养。参照文献报道方法测定受试样品的霉菌含量、胡椒碱含量、精油含量以及黑胡椒失重率。(1)霉菌含量测定：超净台中，称取5g样品于45mL无菌生理盐水中并充分振荡30min，10倍稀释法处理，选取适宜的稀释浓度，孟加拉红培养基涂布，37℃条件下培养24～48h后菌落计数。(2)胡椒碱含量测定：根据石宝俊等提出的方法，超声辅助提取黑胡椒中的胡椒碱，紫外分光光度法制定胡椒碱标准曲线检测样品中胡椒碱含量。(3)4.1.5.7黑胡椒精油含量测定：测定方法同GB 17527-2009《胡椒精油含量的测定》。(4)失重率(％)＝(培养前重量-锥形瓶重量)*100％/(培养前重量-培养后重量)。

微波灭菌后，培养前黑胡椒的质量、胡椒碱和胡椒精油萃取平均值分别为50.00g，5.05％和2.625mL/100g。黄曲霉纯培养阳性对照组(PC)霉菌含量在侵染30天后达到4.5×10⁶个/g，而同时加入了F1超滤抗菌液的试验组(EP)霉菌含量只有3.2×10⁴个/g；霉菌活动会使粮食减产，这点在黑胡椒的霉菌侵染储藏中也得到了证实。PC组干物质损失最多，达到17.18％，EP组也有减少，为8.76％，但与PC组相比干物质损失显著减少；干物质损失的同时，黑胡椒中胡椒碱和胡椒精油的提取量却增加了，PC组提取的胡椒碱和胡椒精油分别增加了10.69％和61.9％，EP组提取出的胡椒碱和胡椒精油分别增加2.98％和18.38％。造成这种现象的可能原因是，菌丝在黑胡椒表面生长，分解黑胡椒木质纤维和其他成分使干物质减少，黑胡椒油囊被破坏，油细胞溶出增加，使得胡椒碱和精油更容易被提取出来；而添加了F1发酵上清液的试验组受霉菌影响发生上述变化的程度较小。抗侵染试验结果表明，含抗菌蛋白的解淀粉芽孢杆菌F1的超滤发酵液能够抵抗霉菌对黑胡椒的侵染，削弱霉菌菌丝的生长能力，保护黑胡椒的有效成分，减少黑胡椒质量的损失和劣变，具有潜在应用价值。

Claims (2)

1.一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该解淀粉芽孢杆菌的名称为Bacillus amyloliquefaciens F1，于2015年6月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10942。

2.权利要求1所述的具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌在黑胡椒贮藏中的应用。