CN107873734B - 一种生物防霉剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物防霉剂及其制备方法，按一百份水的重量计，包括以下原料：抗菌蛋白或其粗品2‑8份、成膜剂0.5‑3份、增塑剂0.5‑5份、交联剂0.5‑4份；将成膜剂加水充分溶解，再加入抗菌蛋白、增塑剂及交联剂，混合均匀后，即得生物防霉液。所述抗菌蛋白粗品为B.amyloliquefaciens F1的发酵液，经超滤、硫酸铵分级沉淀所得，而抗菌蛋白为上述粗品进一步经透析、离子交换及凝胶层系等分离手段所得。本发明通过添加主要抑菌物质抗菌蛋白所得生物防霉液，抑制黄曲霉菌的生长，具有安全、高效等特点，解决了物理防腐保鲜价格昂贵、操作复杂的问题，以及化学防腐带来的药物残留的问题。本产品经济高效，使用方便，在农业及食品保鲜领域应用前景巨大。

Description

一种生物防霉剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗菌技术领域，具体涉及一种生物防霉剂的制备方法。
背景技术
黄曲霉属半知菌类，菌落生长迅速，表面黄绿色，背面略呈红褐色。菌体生长通常出现许多分枝菌丝，形成菌丝体。一旦菌丝体形成就分泌降解酶或蛋白质分解复杂的营养物质。单枝菌丝通常不会被肉眼看到，但是分生孢子产生的厚厚的菌丝垫可以很容易看到。黄曲霉菌产生的次级代谢产物黄曲霉毒素属于真菌毒素中的一大类，广泛存在于各类谷物类(玉米、大米)、油及油料作物(花生油、花生、坚果)、果蔬、牛奶以及肉中，具有致畸、致癌的危害。
对于黄曲霉污染的方法有物理法、化学法及生物防治。辐照是一种处理食物的物理过程，不同于化学加工，不属于添加剂范畴。化学防腐剂作为食品保藏的一种辅助手段，对防止某些因微生物而易腐败变质的食品损失有显著效果。然而这两种方法分别存在很大的缺点，物理防治技术的设备昂贵，操作繁琐，且人们还担心辐照对人体有害；化学防腐技术造成药物残留等问题，越来越让人们担忧。因此利用生物间的拮抗作用，抑制产毒菌的生长，进而达到减少黄曲霉毒素的污染的目的，或者利用生物的吸附作用、代谢物酶的分解作用等去除黄曲霉毒素的生物防治法越来收人们关注。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是与枯草芽孢杆菌相似，可产芽孢、革兰阳性(G+)、具有生防活性的益生细菌。其在繁殖与生长阶段能够分泌许多抗菌物质，在抗真菌和细菌等方面起着重要的作用。利用生防菌的产物进行霉菌的防治，在实验室研究的较多，对于其在实际生产中的应用值得关注。
发明内容
本发明目的在于提供一种经济高效的生物防霉剂及其制备方法。通过的单因素及正交试验确定了防霉剂的最佳配方。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种生物防霉剂，按重量份数计由以下配方组成：
抗菌蛋白或其粗品：2-8份；
成膜剂：0.5-4份；
增塑剂：0.5-5份；
交联剂：1-4份。
进一步地，所述成膜剂为海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、大豆蛋白及卡拉胶中的任意一种；增塑剂为甘油、吐温-20、山梨醇、甘露醇中的任意一种；交联剂为氯化钙、柠檬酸钠中的任意一种。
进一步地，所述抗菌蛋白粗品为B.amyloliquefaciens F1的发酵液，经超滤、硫酸铵分级沉淀所得，而抗菌蛋白为上述粗品进一步经透析、离子交换及凝胶层系等分离手段所得。
进一步地，所述抗菌蛋白的制备包括以下步骤：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液。在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，4℃静置过夜，之后8000-10000r/min离心20-30min，收集沉淀。用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
采用NGC层析系统进行初步纯化。透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
本发明所述B.amyloliquefaciens F1菌株具有高真菌抑制活性，由扬州大学食品发酵实验室从香辛料中筛选、鉴定，并申请了专利，专利名称为“一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用”，其专利公开号为CN 102153618 A，公开日为2015年10月21日。B.amyloliquefaciens F1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏号为CGMCCNo.10942，保藏日期为2015年6月1日。
更进一步地，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备条件为30-37℃摇床振荡培养18-24h；发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，氯化钠5.0g，2g柠檬酸铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾(1000mL水)。
进一步地，所述B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取，超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30Kd，硫酸铵饱和度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L、pH 8.0；透析袋孔径为14kDa，透析48-60h，每12-24h更换一次透析液。
进一步地，所述抗菌蛋白的分离纯化，离子交换条件为：离子交换柱为离子交换柱为阴离子交换柱或阳离子交换柱或两类柱子组合使用；平衡缓冲液为10mmol/L、pH5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH 6.0-9.0的PBS(含1mol/L氯化钠)，上样量为5.0-20mg/g柱填料。
更进一步地，所述凝胶层的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH 6.0-9.0的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。
本发明还提供一种生物防霉剂的制备方法，包括以下步骤：
按质量百分比计，称取0.5-4份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解，配制成0.5-4.0份的溶液，再分别加入2.0-8.0份抗菌蛋白、0.5-5.0份增塑剂、1.0-4.0份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉剂。
有益效果，本发明的生物防霉剂主要抑菌物质是从B.amyloliquefaciens F1发酵液中经分离纯化所得，对黄曲霉菌具有较高的抑制效果，而且经济高效。本发明的生物防霉剂解决了传统方法带来的弊端。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)微生物生存广泛，繁殖速度快，而且已从自然界中获得。本发明采用微生物源抗菌蛋白作为主要抑菌物质，所以相对于传统技术，此技术较易得，造价低廉，可行性高。
(2)本发明成膜剂中，壳聚糖也有一定的抑菌作用，增塑剂跟交联剂有助于涂膜剂成膜，有助于抑菌成分均匀附着在被保护的物体上，更好的起到防霉的效果。
(3)本发明的生物防霉剂使用方便，操作简易，无残留，解决了目前化学防腐带来的最大缺点，弥补了物理防腐技术造价高，操作繁琐的不足。
附图说明
图1为实施例1中步骤(2)所得主要抑菌物质抗菌蛋白通过牛津杯法，检测其对黄曲霉的抑制作用，由图可以看出，抗菌蛋白对黄曲霉的抑菌圈非常明显，说明抗菌蛋白对黄曲霉具有抑制作用(A:CK；B：抗菌蛋白；C:抗菌蛋白)。
图2为实施例2中步骤(3)所得主要抑菌物质抗菌蛋白，其不同的浓度对黄曲霉菌丝的抑制作用电镜图。由图可以看出，随着抗菌蛋白浓度的增大，黄曲霉菌丝表面粗糙度增大，说明抗菌蛋白阻碍了黄曲霉菌丝体的正常生长(2000×：(A1)0.0mg/mL；(B1)0.5mg/mL；(C1)1.0mg/mL；(D1)2.0mg/mL
5000×：(A2)0.0mg/mL；(B2)0.5mg/mL，；(C2)1.0mg/mL；(D2)2.0mg/mL)。
图3为实施例3中，防霉剂对花生防霉效果的对比图(A1-A4：CK；B1-B4：双乙酸钠；C1-C4:生物防霉液)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1-3是本发明的一种发酵型醋蛋咀嚼片的制备方法的具体实施方式，其中实施例2为最佳实施例。
实施例1
本发明的一种生物防霉剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中，30℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2％的接种量添加到装载量40％发酵培养基的锥形瓶中，30℃、摇床培养48h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为15kDa的超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到40％，4℃静置过夜，之后8000r/min离心30min，收集沉淀。用原液1/10体积10mmol/L、pH8.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为14kDa透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每12h时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品。
(3)防霉剂的制备
称取0.5份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解。再分别加入2份抗菌粗蛋白、1份增塑剂、1.5份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉液。
所用成膜剂为海藻酸钠，增塑剂为甘油、山梨醇和吐温-20两者的组合，交联剂为柠檬酸钠。
实施例2
本发明的一种生物防霉剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中，30℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2％的接种量添加到装载量20％发酵培养基的锥形瓶中，32℃、摇床培养72h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为15kDa的超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到50％，4℃静置过夜，之后10000r/min离心20min，收集沉淀。用原液1/20体积10mmol/L、pH8.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为30kDa透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每12h时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于HiTrapTMHP-Q，上样量为15mg/g柱填料，，用10mmol/L、pH 8.0PBS缓冲液平衡，10mmol/L、pH 8.0的PBS(含1mol/L氯化钠)进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，上样体积为柱体积的0.5％，以10mmol/L、pH 8.0PBS缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
(4)防霉剂的制备
称取2份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解。再分别加入4份抗菌蛋白、1份增塑剂、2份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉液。
所用成膜剂为淀粉，增塑剂为甘露醇和吐温-20两者组合，交联剂为氯化钙。
实施例3
本发明的一种生物防霉剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中，30℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2％的接种量添加到装载量30％发酵培养基的锥形瓶中，37℃、摇床培养70h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为8kDa的超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使其饱和度达到60％，4℃静置过夜，之后8000r/min离心25min，收集沉淀。用原液1/20体积10mmol/L、pH 8.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为14kDa透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每20h时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于HiTrapTMQ，上样10mg/g柱填料，用10mmol/L、pH 9.0PBS缓冲液平衡，10mmol/L、pH 9.0的PBS(含1mol/L氯化钠)进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，上样体积为柱体积的1％，以10mmol/L、pH 9.0PBS缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
(4)防霉剂的制备
称取1.5份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解。再分别加入6份抗菌蛋白、3份增塑剂、2份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉液。
所用成膜剂为壳聚糖，增塑剂为甘油，交联剂为氯化钙中。
(5)防霉剂的应用
将花生仁用0.5％的次氯酸钠浸泡60s，捞出后在紫外灯下照射3h。将灭菌后的花生仁在加入黄曲霉孢子的生物防霉剂中浸泡30s，使之涂抹均匀。将涂膜后的花生仁放在已灭菌的培养皿中，在40℃的烘箱中烘3h。烘干后，放入30℃的恒温培养箱中培养，培养时间分别为3d、6d、9d、12d。
防霉剂对花生防霉效果的对比图如图3。由图可以明显观察到，双乙酸钠及CK平皿中花生仁表面生长大量寄生曲霉的菌丝和黄绿色孢子，而经过防霉液处理后的花生仁表面未观察到明显的菌丝生长，这就更为直观的表明了防霉剂较好的防霉效果。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (8)

1.一种生物防霉剂，其特征在于，按重量份数计由以下配方组成：
抗菌蛋白或其粗品：2-8份；
成膜剂：0.5-4份；
增塑剂：0.5-5份；
交联剂：1-4份；
所述抗菌蛋白的制备包括以下步骤：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得发酵液；
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液。在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，4℃静置过夜，之后8000-10000r/min离心20-30min，收集沉淀。用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
采用NGC层析系统进行初步纯化。透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得高纯的抗菌蛋白。
2.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于，所述成膜剂为海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、大豆蛋白及卡拉胶中的任意一种；增塑剂为甘油、吐温-20、山梨醇、甘露醇中的任意一种；交联剂为氯化钙、柠檬酸钠中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(1)中，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备，30-37℃摇床振荡培养18-24h；所述摇瓶发酵为30-37℃发酵48-72h。
4.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，氯化钠5.0g，2g柠檬酸铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾，1000mL水。
5.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(2)中，所述超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30kDa，硫酸铵饱和度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L、pH 8.0；透析袋孔径为3-30kDa，透析48-60h，每12-24h更换一次透析液。
6.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(3)中，所述离子交换层析的条件为：离子交换柱为HiTrapTMHP-Q或者HiTrapTMHP-SP；平衡缓冲液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，含1mol/L氯化钠，上样量为5.0-20mg/g柱填料。
7.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(3)中，所述凝胶层的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH 6.0-9.0的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。
8.权利要求1所述生物防霉剂，其特征在于，包括以下步骤：
按质量百分比计，称取0.5-4份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解，配制成0.5-4.0份的溶液，再分别加入2.0-8.0份抗菌蛋白、0.5-5.0份增塑剂、1.0-4.0份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉剂。
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