CN116218929B - 一种发酵粗提物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物应用技术领域，具体公开了一种发酵粗提物、制备方法及应用，所述发酵粗提物为链格孢属真菌CBSX2(Alternaria ochroleuca)发酵液乙醇提取物，包括链格孢属真菌CBSX2菌丝体及链格孢属真菌CBSX2胞外多糖；所述粗提物依次通过液体深层发酵、醇沉、分离、干燥、粉碎制得，制备过程简单，使用方便，克服了使用真菌活体不稳定的缺点；所述粗提物可以用于吸附水或其他物质中的Cd；施用于作物，可减少作物根部可利用Cd的含量，减少作物Cd富集，激发作物抗性，提高作物在重金属Cd胁迫下的抗逆能力，提高叶片叶绿素含量，提高抗氧化能力，促进作物生长。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种发酵粗提物、制备方法及应用。
【背景技术】
南方水稻耕地重金属污染主要表现在Cd含量超标，作物受到重金属的胁迫导致产量下降，污染物会通过富集进入食物链，进而威胁人类健康。每年因重金属污染而损失的粮食约1000×104吨，受污染粮食多达1200×104吨，经济损失至少达200×108元。
修复耕地土壤重金属Cd污染的一种技术路线是减少土壤溶液中的可利用态Cd，可用真菌作为修复菌剂，利用其活体胞内富集或菌丝体残体、以及分泌的多糖EPS吸附土壤溶液的重金属，从而减少重金属向作物根部富集。如CN 112317530 B一种真菌生物修复重金属镉污染水稻的有效方法，利用共培养裂褶菌在水培条件下提高水稻的抗性。另一种技术路线是施用真菌菌剂等间接提高作物对重金属的抗性(微生物缓解镉对水稻的毒害研究进展[J].应用与环境生物学报,2020)，如通过在玉米回接深色有隔内生真菌，在根组织定植后发挥作用，提高作物抗逆的能力(刘加强等镉胁迫下深色有隔内生真菌对玉米生长和根际土壤养分的影响2021)。也有通过免疫诱抗剂提高宿主自身对Cd抗性的的报道，如XinranGuo等施用宛氏拟青霉提取物ZNC来提高玉米在Cd胁迫下的光合作用，进而提高对重金属的抗性(Combining paecilomycesvariotii extracts and biochar for the remediationof alkaline Cd-contaminated soil[J]，Biomass Conversion and Biorefnery，2022)。但这两种技术路线至少存在如下不足：
(1)真菌活体受土壤环境制约，定植能力受影响，难于发挥稳定作用；
(2)施用产品功能单一，只具减少可利用态重金属Cd的功能或者提高作物重金属抗逆性。
【发明内容】
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一种发酵粗提物、制备方法及应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面在于，提供一种发酵粗提物，所述发酵粗提物为链格孢属真菌CBSX2(Alternaria ochroleuca)发酵液的乙醇提取物。
优选地，所述粗提物中包含链格孢属真菌CBSX2菌丝体、链格孢属真菌CBSX2胞外多糖及其他醇沉成分。
优选地，所述粗提物中链格孢属真菌CBSX2菌丝体含量≥0.7g/g；链格孢属真菌CBSX2胞外多糖含量≥0.2g/g。
所述链格孢属真菌CBSX2已于2014年12月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101；保藏编号为CGMCC No.10141；且该菌株已于在先专利CN104673680A一种链格孢属CBSX2菌株及其应用中公开。
本发明的第二方面在于，提供所述发酵粗提物的制备方法，包括如下步骤：
(1)液体深层发酵：取PDA平板上活化的菌丝块接种于含发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养；
(2)醇沉：发酵结束后，向发酵液中加入乙醇，搅拌后静置；
(3)分离：步骤(2)所述发酵液静置一定时间后进行离心或过滤分离，收集沉淀或滤饼；
(4)干燥、粉碎：将步骤(3)收集的沉淀或滤饼加热烘干、粉碎即得所述粗提物。
优选地，步骤(1)中所述菌丝块的直径为5～10mm/块；每100mL接种量大于1个菌丝块。
优选地，步骤(1)中所述的发酵培养基包括如下成分：成品PDA干粉2.0％、大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、硫酸镁0.1％，其余为水，pH自然；121℃蒸汽灭菌20min备用；摇瓶中培养装液量≤50％，透气封口膜封口，设置摇床温度25-32℃、转速150-220r/min，培养5d以上。
优选地，步骤(2)中加入乙醇至发酵液中乙醇的体积浓度≥75％。
优选地，步骤(3)中对发酵液进行离心时的转速为3000～10000r/min。
优选地，步骤(4)中加热烘干时温度为60℃以上，烘干至含水量为2～5％，粉碎至目数大于60目。
本发明的第三方面在于，提供上述粗提物在吸附重金属Cd中的应用；
本发明的第四方面在于，提供上述粗提物在提高作物对Cd抗性中的应用。
具体地，所述粗提物可在浸种或/和育苗时加入。
具体地，所述粗提物浸种处理时的使用浓度为10～150ng/mL，育苗处理时的使用浓度为50～150μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述发酵粗提物中包括链格孢属真菌CBSX2菌丝体、链格孢属真菌CBSX2胞外多糖和其他醇沉成分，能够吸附Cd、降低Cd积累；
本发明所述粗提物施用于作物，可减少作物根部可利用Cd的含量，减少作物Cd富集提高叶片叶绿素含量，提高抗氧化能力，促进作物生长；
本发明所述粗提物在极低浓度下使用即可激发作物抗性，提高作物在重金属Cd胁迫下的抗逆能力，克服了使用真菌活体不稳定的缺点，且使用范围广，可以用于各种作物；
本发明所述粗提物制备过程简单，提取率高，使用所述发酵培养基发酵后，发酵液中粗提物含量高达9.5mg/mL。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1发酵粗提物的制备
(1)液体深层发酵：取PDA平板上活化的菌丝块10mm/块，接种于含200mL发酵培养基的摇瓶(容积为500mL)中，进行发酵培养，每100mL培养基接种5块菌丝块，透气膜封口，置于摇床中28℃、转速160r/min，培养7d；
发酵培养基包括如下成分：成品PDA干粉2.0％、大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、硫酸镁0.1％，其余为水，pH自然；121℃蒸汽灭菌20min备用；
(2)醇沉：发酵结束后，向发酵液中加入3.5倍体积的乙醇(浓度95％以上)，搅拌后静置1h；
(3)分离：将步骤(2)静置后的发酵液置于3500r/min离心机中离心，收集沉淀；
(4)干燥、粉碎：将步骤(3)收集的沉淀于60℃以上加热烘干至含水量为4％，粉碎至过100目筛，即得所述粗提物。
测定发酵液中粗提物含量：粗提物含量mg/mL＝制备好的粗提物mg/发酵液体积mL×100％；最终测得，按照本申请所述方法制备的发酵液中粗提物含量高达9.5mg/mL。
实施例2对粗提物中的成分进行测定
称量发酵粗提物1g溶解到100mL蒸馏水中，过滤或离心收集菌丝体，干燥后测定菌丝体含量；
向过滤或离心后的上清液中加入乙醇至上清液中乙醇的体积浓度为75％，过滤收集沉淀，蒸馏水溶解后用苯酚硫酸法测定多糖含量。
最终测得，粗提物中多糖含量为：0.21g/g，菌丝体含量为0.72g/g。
实施例3所述粗提物吸附Cd能力测定
称取实施例1制得的粗提物1g、2g和5g，分别加入到1L含CdII100、200和500mg/L的溶液中，并设置空白对照(含CdII100mg/L的溶液中不加任何物质)，反应2h后用Cd离子选择电极测定溶液中的CdII离子，并按照下式计算吸附能力，结果如表1所示；
CdII吸附能力：Q(mg/g)＝(Co-Ct)×V/m，其中Ct和Co分别是溶液中CdII最终浓度(mg/L)和初始浓度(mg/L)，V(L)是溶液的体积，m(g)是粗提物的质量；结果如表1所示：
表1粗提物吸附Cd能力测定结果
由表1可知，本申请所述粗提物对Cd具有很好的吸附能力，其吸附能力可达76mg/g，可将其用于吸附水或其他Cd含量较高物质中的Cd。
实施例4本申请所述粗提物对水稻抗Cd能力的影响
1、仅在浸种时施用本申请所述粗提物，对水稻抗Cd能力的影响
水稻种选用两广优香66
水培试验：分别用0、10、50、100和150ng/mL的粗提物浸泡种子，常温下浸泡14小时，2％次氯酸钠消毒后，催芽2d至露白，选择长势一致的种子进行水培，避光烧杯加入1/2霍格兰营养液水培，上部放定植篮，定植篮放1-2mm的脱脂棉，水培营养液加入CdII11mg胁迫。
光照培养16/8h，光强度7000lux，培养10d后测定相关指标，
用直尺测定水稻的长势；
便携式叶绿素仪测定叶片叶绿素含量；
植株杀青后用原子吸收法测定水稻中的Cd含量，并计算Cd富集系数：
BCF Cd＝水稻苗Cd含量/水培溶液Cd含量；
采用FRAP法测定抗氧化能力。
表2粗提物浸种处理的水稻培养10d后各指标情况
注：表中数据为平均值±标准误，不同小写字母表示经DMRT检验α＝0.05下的显著水平
由表2可知，使用本申请所述粗提物对水稻种子进行浸种处理后，水稻株高、叶绿素含量、抗氧化能力均有不同程度的提升，使用浓度为50ng/mL时，效果最好，与不加粗提物的CK组相比，水稻株高增加了23％、叶绿素含量提高了36.3％，抗氧化能力提高了65％，但是并没有减少Cd的富集。
2、水稻浸种和苗期同时施用本申请所述粗提物，对水稻抗Cd能力的影响
按照上述方法，使用50ng/mL粗提物浸泡的水稻种子，在水培时再分别加入50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的粗提物，并设空白对照CK(浸种及水培时均不加粗提物)，培养10d后测定各指标，结果如表3所示；
表3浸种、水培时均加入粗提物处理的水稻培养10d后各指标情况
对比表2和表3可知，在浸种和水培时均加入一定量本申请所述粗提物，培养后，水稻株高、叶绿素含量、抗氧化能力相比于仅在浸种时加入又有了不同程度地提升，且Cd富集系数也有了明显下降；尤其是50ng/mL浸泡处理的种子，水培加入粗提物浓度为100μg/mL时，效果最好，与不做任何处理的CK组相比，水稻株高增加了30.3％，叶绿素含量增加了46.2％，抗氧化能力提高了73.7％，Cd富集系数降低了69％。
实施例5本申请所述粗提物对玉米抗Cd能力的影响
1、仅在浸种时施用本申请所述粗提物，对玉米抗Cd能力的影响
玉米品种选用郑单958
水培试验：分别用0、10、50、100和150ng/mL的粗提物浸泡玉米种子，常温下浸泡20小时，2％次氯酸钠消毒后，催芽2d至露白，选择长势一致的种子进行水培，避光烧杯加入1/2霍格兰营养液水培，上部放定植篮，定植篮放1-2mm的脱脂棉，水培营养液加入CdII 11mg胁迫；光照培养16/8h，光强度7000lux，培养10d后参照实施例4所述方法测定相关指标，结果如表4所示：
表4粗提物浸种处理的玉米培养10d后各指标情况
由表4可知，使用本申请所述粗提物对玉米种子进行浸种处理后，玉米株高、叶绿素含量、抗氧化能力均有不同程度的提升，当所述粗提物使用浓度为50ng/mL时，效果最好，与不加粗提物的CK组相比，玉米株高增加了16.5％、叶绿素含量提高了31.1％，抗氧化能力提高了59.8％。
2、玉米浸种和苗期同时施用本申请所述粗提物，对玉米抗Cd能力的影响
按照上述方法，采用50ng/ml浸泡的玉米种子，在水培时分别加入50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的粗提物，并设空白对照CK(浸种及水培时均不加粗提物)，培养10d后测定各指标，结果如表5所示；
表5浸种、水培时均加入粗提物处理的玉米培养10d后各指标情况
对比表4和表5可知，在浸种和水培时均加入一定量本申请所述粗提物，培养后，玉米株高、叶绿素含量、抗氧化能力相比于仅在浸种时加入又有了不同程度地提升，且Cd富集系数也明显降低；尤其是50ng/mL粗提物浸泡处理的种子，水培加入粗提物浓度为100μg/mL时，效果最好，与不做任何处理的CK组相比，玉米株高增加了27.7％，叶绿素含量增加了32.1％，抗氧化能力提高了72.5％，Cd富集系数降低了63％。
对比例1对比菌株粗提物浸种处理对水稻抗Cd能力的影响
对比菌株选用链格孢菌(Alternaria alternata)CGMCC3.15535；
采用实施例1所述方法制备对比菌株粗提物，并按照实施例4中所述方法采用对比菌株粗提物对水稻进行浸种处理，培养10d后测定各指标情况，测定结果如表6所示：
表6对比菌株粗提物浸种处理的水稻培养10d后各指标情况
由表6可知，使用对比菌株粗提物对水稻种子进行浸种处理后，进行水培培养，水稻长势株高、叶绿素含量、抗氧化能力和Cd富集系数均无明显变化，证明对比菌株链格孢菌(Alternaria alternata)CGMCC 3.15535无免疫诱抗能力。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (5)
1.一种发酵粗提物在吸附重金属Cd中的应用，其特征在于，所述发酵粗提物为链格孢属真菌CBSX2（Alternaria ochroleuca）发酵液乙醇提取物，所述链格孢属真菌CBSX2（Alternaria ochroleuca）已于2014年12月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101；保藏编号为CGMCC No.10141；所述发酵粗提物的具体制备过程如下：
（1）液体深层发酵：取PDA平板上活化的菌丝块接种于含发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养；
（2）醇沉：发酵结束后，向发酵液中加入乙醇，使发酵液中乙醇的体积浓度≥75%，搅拌后静置；
（3）分离：步骤（2）所述发酵液静置一定时间后进行离心或过滤分离，收集沉淀或滤饼；
（4）干燥、粉碎：将步骤（3）收集的沉淀或滤饼加热烘干、粉碎即得所述发酵粗提物。
2.一种发酵粗提物在提高作物Cd抗性中的应用，其特征在于，所述发酵粗提物为链格孢属真菌CBSX2（Alternaria ochroleuca）发酵液乙醇提取物，所述链格孢属真菌CBSX2（Alternaria ochroleuca）已于2014年12月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101；保藏编号为CGMCC No.10141；所述发酵粗提物的具体制备过程如下：
（1）液体深层发酵：取PDA平板上活化的菌丝块接种于含发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养；
（2）醇沉：发酵结束后，向发酵液中加入乙醇，使发酵液中乙醇的体积浓度≥75%，搅拌后静置；
（3）分离：步骤（2）所述发酵液静置一定时间后进行离心或过滤分离，收集沉淀或滤饼；
（4）干燥、粉碎：将步骤（3）收集的沉淀或滤饼加热烘干、粉碎即得所述发酵粗提物；
所述发酵粗提物在浸种或育苗时加入，且浸种处理时的使用浓度为10~150 ng/mL，育苗处理时的使用浓度为50~150μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述发酵粗提物包括链格孢属真菌CBSX2菌丝体、链格孢属真菌CBSX2胞外多糖，所述发酵粗提物中链格孢属真菌CBSX2菌丝体含量≥0.7g/g，链格孢属真菌CBSX2胞外多糖含量≥0.2g/g。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的发酵培养基包括如下成分：成品PDA干粉2.0 %、大豆蛋白胨0.5%、葡萄糖1.0%、硫酸镁0.1%，其余为水，pH自然。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的发酵培养是在摇床中，设置摇床温度为25-32℃、转速150-220r/min，培养5d以上。
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