CN117229956B - 一株钝化金属镉的假单胞菌bgb-132r及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及重金属污染下作物生长和土壤修复的技术领域，具体公开了一种假单胞菌BGB‑132R及其应用。该假单胞菌BGB‑132R于2023年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27751。本申请还提供了包括上述菌株的培养物、发酵液、菌悬液、菌剂、菌粉；利用上述菌株制得的发酵上清液；以及上述菌株及其培养物、发酵液、菌悬液、菌剂、菌粉、发酵上清液在含Cd2+的环境下促进植物种子发芽中以及在重金属污染土壤修复中的应用。本申请提供的假单胞菌BGB‑132R能够在Cd2+环境下正常生长，并促进种子萌发。
Description
技术领域
本申请涉及重金属污染下作物生长和土壤修复的技术领域，更具体地说，涉及一株钝化金属镉的假单胞菌BGB-132R及其应用。
背景技术
重金属污染已经成为威胁农业安全的主要因素。农业重金属污染的主要过程如下：植物吸收土壤中的重金属，使其进入食物链；随着食物链的循环，这部分重金属最终会富集在人体内，从而危及人类健康。镉（Cd）具有高流动性、高毒性和大的流通富集区等特点，是目前最重要的金属污染物之一，严重威胁着农作物的生产。水稻是全世界最主要的经济作物和粮食作物之一，其籽粒中重金属累积含量需要引起关注。被镉污染后的稻田中会长出富集镉的稻米，且容易通过食物链在人类体内积累，从而对人体的健康产生严重的危害。
作为农业生产的重要手段，施肥不仅能够调节和促进农作物的生长发育，而且能够改善土壤属性，使土壤中某些重金属的生物活性降低，从而抑制农作物富集重金属。因此，运用科学合理的施肥策略钝化土壤重金属，提高农作物品质，已成为改善农田土壤环境、促进农业经济快速健康稳定发展的核心技术。
目前，生物肥料的研究成为近来研究的热门项目。故急需获得既能够在重金属环境下生长，又能够促进作物在重金属环境下生长的微生物菌种。
发明内容
本申请提供一株钝化金属镉的假单胞菌BGB-132R及其应用。该假单胞菌BGB-132R能够在Cd2+环境下正常生长，并促进种子萌发。
第一方面，本申请提供一种假单胞菌BGB-132R，采用如下的技术方案：
本申请提供的假单胞菌（Pseudomonas adaceae）BGB-132R于2023年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27751。
该菌株是从湖北省大冶市金山店镇具有重金属污染的土壤样本中分离获得的。菌株营养细胞呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28-32℃，最高生长温度为37℃，最低生长温度为22℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养24h的菌落呈透明色，表面光滑湿润，边缘有褶皱，挑取为粘稠状或冻状。
从NCBI（GenBank）数据库中获取多个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株和参比菌株的16S rDNA序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树，从而确定上述分离菌株的菌株系为假单胞菌（Pseudomonas adaceae）的菌株系（如图3所示），并命名为BGB-132R。
该菌株应用于重金属污染土壤中，主要功能为可在一定浓度Cd2+的条件下生长及增殖，并对其Cd2+具有一定的钝化作用，在一定浓度Cd2+的条件下可促进种子萌发，降低Cd2+对种子的毒害作用。菌体来源于自然环境，而又被释放到土壤中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。
第二方面，本申请提供一种培养物。该培养物包括上述假单胞菌BGB-132R。
本申请中，培养物可以是发酵液以及利用发酵液获得的发酵上清液。
第三方面，本申请提供一种发酵液。该发酵液包括上述假单胞菌BGB-132R。
第四方面，本申请提供一种发酵上清液。该发酵上清液利用上述假单胞菌BGB-132R制得。
第五方面，本申请提供一种菌悬液。该菌悬液包括上述假单胞菌BGB-132R。
第六方面，本申请提供一种菌剂。该菌剂包括上述假单胞菌BGB-132R。
第七方面，本申请提供一种菌粉。该培养物包括上述假单胞菌BGB-132R。
第八方面，本申请提供一种上述假单胞菌BGB-132R、培养物、发酵液、发酵上清液、菌悬液、菌剂或菌粉在含Cd2+的环境下促进植物种子发芽中的应用。
第九方面，本申请提供一种上述假单胞菌BGB-132R、培养物、发酵液、发酵上清液、菌悬液、菌剂或菌粉在Cd2+污染土壤修复领域中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1. 本申请提供一种假单胞菌，命名为假单胞菌BGB-132R，该菌株于2023年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27751。
2. 该假单胞菌BGB-132R呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构，在营养琼脂培养基中，所述假单胞菌BGB-132R的菌落呈透明色，表面光滑湿润，边缘有褶皱，挑取为粘稠状或冻状。
3. 将该菌株应用于重金属污染土壤中，可在一定浓度Cd2+的条件下生长及增殖，并对其Cd2+具有一定的钝化作用。在一定浓度Cd2+的条件下，该菌株可促进种子萌发，种子发芽指数达到186%，降低Cd2+对种子的毒害作用。
4. 该菌株来源于自然环境，而又被释放到土壤中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。
附图说明
图1为分离菌株的镜检观察结果（1000×）。
图2为分离菌株在营养琼脂培养基上的生长状态。
图3为分离菌株的系统发育树。
图4为菌种BGB-132R在不同Cd2+浓度LB营养液体培养基中的生长情况。
图5为菌株BGB-132R在Cd2+浓度为20mg/L时对黄瓜种子发芽指数的影响。
具体实施方式
本申请提供一种假单胞菌（Pseudomonas adaceae）BGB-132R，该假单胞菌BGB-132R保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27751。此外，本申请还提供了该菌株的分离、纯化及培养方法。并且提供了包括该菌株的培养物、发酵液、菌悬液、菌粉、菌剂以及利用该菌株制备的发酵上清液。
将本申请提供的假单胞菌BGB-132R以及包括该菌株的培养物、发酵液、菌悬液、菌粉、菌剂以及利用该菌株制备的发酵上清液可在含Cd2+的环境下促进植物种子发芽中以及在重金属污染土壤修复中的应用。
本申请提供的假单胞菌BGB-132R能够在Cd2+低于50mg/L的环境下生长。同时，该假单胞菌BGB-132R能够在Cd2+浓度为20mg/L时促进黄瓜种子发芽，种子发芽指数为186%。
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
以下各实施例中所使用的试剂、溶剂和其它试验材料均可以通过商购获得。
本申请中所用到的仪器设备：培养箱（上海精宏-DHG-9030A）、低速离心机（四川蜀科-DD5000）、振荡培养箱（上海知楚-ZQZY-78BV）、pH计（上海雷磁PHS-3E）、紫外可见分光光度计（青岛-聚创UV759CRT）。
以下结合实施例、附图以及性能检测结果对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1——菌种的分离、纯化
本实施例提供了一种新菌种的获得过程。具体如下：
（1）土壤样品采集：采集来自湖北省大冶市金山店镇具有重金属污染的土壤（东经114°49′38″，北纬30°08′10″），并进行日期及其他信息登记。
（2）目标菌种初步分离：称取上述采集的土壤样品10g，无菌条件下加入到预先灭菌的盛有100ml生理盐水的三角瓶中，室温下充分振荡30min后，按比例稀释至10-5，选择稀释浓度为10-3、10-4、10-5的稀释度分别吸取0.1-0.2ml，在加入Cd2+浓度为20mg/L的营养琼脂、PDA、高氏Ⅰ号固体培养基中进行涂布平板，待液体吸尽，28℃倒置培养24-48h。于平板上挑取单克隆，根据板上微生物形态，挑取不同菌落划线分离纯化（按照上述培养条件培养）2-3次，直至菌落单一，编号，记录，保存。
（3）初步鉴定：将分离纯化得到的菌株（即分离菌株）于显微镜下镜检并观察，结果如图1所示。
实施例2——单菌株性质和16S rDNA序列测序
本实施例提供了实施例1获得的分离菌株的单菌株性质和16S rDNA序列测序结果。具体如下：
（一）单菌株性质
（1）形态特征
分离菌株：营养细胞呈杆状、圆端，多数为单个、少数成对或链状排列，细胞壁为革兰阳性结构。最佳生长温度为28-32℃，最高生长温度为37℃，最低生长温度为22℃，需氧或兼性厌氧。在营养琼脂培养基28℃培养24h的菌落呈透明色，表面光滑湿润，边缘有褶皱，挑取为粘稠状或冻状，如图2所示。
（2）培养特性
菌株最适生长条件为：pH＝7.0，温度28-32℃，转速180r/min，可利用广泛的碳源和氮源。
（3）功能特性
应用于重金属污染土壤中，主要功能为可在一定浓度Cd2+的条件下生长及增殖，并对其Cd2+具有一定的钝化作用，在一定浓度Cd2+的条件下可促进种子萌发，降低Cd2+对种子的毒害作用。菌体来源于自然环境，而又被释放到土壤中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，还可在一定情况下丰富自然界菌群结构，提高自然界菌群多样性。
（二）16S rDNA序列测序
为鉴定本菌株的系统发育地位，对该分离菌株的16S rDNA序列进行测序，获得分离菌株的16S rDNA序列。
从NCBI（GenBank）数据库中获取多个参比菌株序列，运用软件BioEdit和MEGA11对分离菌株的16S rDNA序列和参比菌株的16S rDNA序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定上述分离菌株的菌株系为假单胞菌（Pseudomonas adaceae）的菌株系（如图3所示），并命名为BGB-132R。
与相关技术相比，本申请分离获得的菌株BGB-132R具有如下效果：菌株BGB-132R具有耐一定浓度Cd2+生长和在一定浓度Cd2+的条件下促进种子萌发的特性。通过黄瓜种子萌发试验发现，与不接种相比，接种该菌株可显著促进种子萌发，提高种子萌发率，促进生长，可用于实际生产。
将假单胞菌（Pseudomonas adaceae）BGB-132R于2023年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27751。
实施例3
本实施例提供了一种假单胞菌BGB-132R的发酵液。
上述发酵液的制备方法具体如下：
将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养琼脂培养基中，在28℃条件下培养24h，获得假单胞菌BGB-132R的发酵液。
实施例4
本实施例提供了一种假单胞菌BGB-132R的发酵上清液。
上述发酵上清液的制备方法具体如下：
将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养琼脂培养基中，在28℃条件下培养24h，获得假单胞菌BGB-132R的发酵液；将发酵液上清液离心，留上清，即为假单胞菌BGB-132R的发酵上清液。
实施例5
本实施例提供了一种假单胞菌BGB-132R的菌悬液。
上述菌悬液的制备方法具体如下：
将实施例1获得的分离菌株进行活化，并转接于营养琼脂培养基中，在28℃条件下培养24h，获得假单胞菌BGB-132R的发酵液；将发酵液上清液离心，留沉淀，并用无菌水重悬沉淀，即为假单胞菌BGB-132R的菌悬液。
性能检测试验一——耐Cd2+试验
对假单胞菌BGB-132R进行耐Cd2+试验。具体如下：
（1）利用上述分离筛选得到的菌种BGB-132R，在LB营养液体培养基中进行培养，在30℃、220rpm的条件下培养40h，调整OD值为0.5，留存备用。
（2）在不同Cd2+浓度（0、10、20、30、40、50、100mg/L）的LB营养液体培养基中接种相同量的上述菌液进行培养，重复3次，并设对照，在30℃、220rpm的条件下培养28h，观察OD值及菌量，并拍照统计。
（3）试验结果如图4和表1所示。
表1 菌种BGB-132R在不同Cd2+浓度LB营养液体培养基中的生长情况
由表1和图4可知，假单胞菌BGB-132R能够在Cd2+低于50mg/L的环境下生长。
性能检测试验二——促进黄瓜种子萌发试验
对假单胞菌BGB-132R进行促进黄瓜种子萌发试验。具体如下：
（1）将菌种BGB-132R置于LB营养液体培养基中进行培养，在30℃、220rpm的条件下培养28h，制备菌种BGB-132R的发酵液。利用平板计数法检测发酵液活菌量为1.84亿CFU/ml。离心发酵液并去除上清，制备发酵浓缩液，发酵浓缩液的活菌量为56亿CFU/ml，并用无菌水将发酵浓缩液稀释至10亿CFU/ml，留存备用。
（2）取新鲜饱满的黄瓜种子，利用溶质质量分数为0.2%次氯酸钠灭菌冲洗15s，反复冲洗2-3次，确保黄瓜种子表面灭菌完全而不损伤黄瓜种子。在9cm无菌培养皿放置1张无菌滤纸，其上放置10粒大小基本一致、饱满的已灭菌的黄瓜种子，加入上述10亿CFU/ml的发酵浓缩液1ml，并加入9ml一定浓度的Cd2+无菌水，使其混合后Cd2+浓度为20mg/L，活菌量为1亿CFU/ml，作为处理组，并以无菌水做对照试验，且均设置3次重复。盖上培养皿盖，在28℃培养箱避光培养72h，统计发芽种子的粒数，并用直尺逐一测量主根长，计算种子发芽率。
种子发芽指数的计算公式为：G=（A1×A2）/（B1×B2）。
注：G-种子发芽指数，以%表示；
A1-处理组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；A2-处理组全部种子的平均根长数值；B1-对照组种子中发芽粒数占放入总粒数的百分比；B2-处理组全部种子的平均根长数值。
试验结果如图5和表2所示。
表2 菌株BGB-132R在Cd2+浓度为20mg/L时对黄瓜种子发芽指数的影响
计算：种子发芽指数G=（96.7%*3.92cm）/（73.3%*2.78cm）=1.86。
结合图5和表2可知，假单胞菌BGB-132R能够在Cd2+浓度为20mg/L时促进黄瓜种子发芽，种子发芽指数为186%。
实施例6
本实施例提供了一种假单胞菌BGB-132R的菌剂。
上述菌剂的制备过程具体如下：
将-80℃保存的实施例1获得的假单胞菌BGB-132R 3次活化后转接于营养液体培养基培养，培养至对数期，作为种子液，待使用。在300L液体发酵罐进行发酵，利用培养基为酵母粉（10g/L）、糖蜜（10g/L）、玉米蛋白粉（30g/L）及少量无机盐成分进行发酵，发酵接种量为1%（体积比），转速为200rpm，温度为28℃，通气量为1vvm，发酵45h，待芽孢率达到90%以上，下罐。利用桶式离心机对上述发酵液进行离心，将浆液添加保护剂，即为假单胞菌BGB-132R的菌剂。
实施例7
本实施例提供了一种假单胞菌BGB-132R的菌粉。
上述菌粉的制备过程具体如下：将实施例6制得的菌剂进行低温干燥，干燥成为菌粉，即得假单胞菌BGB-132R的菌粉，菌粉菌含量为250亿/g。
实施例8
本实施例提供了一种利用假单胞菌BGB-132R制得的镉钝化剂。
上述镉钝化剂的制备方法具体如下：
（1）假单胞菌BGB-132R菌粉的制备：利用实施例7所述的制备过程制备假单胞菌BGB-132R的菌粉，菌粉菌含量为250亿/g。
（2）将上述假单胞菌BGB-132R的菌粉放置于滚筒中，利用基质（竹炭，颗粒范围在6-8mm）对假单胞菌BGB-132R的菌粉进行吸附，吸附完成利用传送带传送至糖蜜喷雾设备中进行糖蜜包被，包被完成在滚筒中包被镉络合物（玉米芯粉、活性炭、谷糠的添加比例为2:2:1，三者混合均匀置于滚筒中），镉络合物的包被厚度为3mm，在低温干燥设备中进行烘干，样品制备完成，获得镉钝化剂。
性能检测试验三——利用镉钝化剂治理镉污染的土壤、水体
对实施例8提供的镉钝化剂进行测定。具体如下：
（1）处理镉污染的土壤
供试土壤：黄石市大冶市陈贵镇某典型镉污染稻田，土壤中pH为6.44，有机质含量36.5g/kg，碱解氮101.5mg/kg，速效磷25.7mg/kg，速效钾91.3mg/kg，总镉含量为2.05mg/kg，有效镉含量0.98mg/kg。
试验方法如下：
将供试土壤风干，研磨过20目筛，分别取6份100g的筛下物置于烧杯中，分为2组，分别对应实施例8的镉钝化剂、不添加镉钝化剂作为空白对照。按照镉钝化剂/供试土壤中镉含量的重量比30：1加入镉钝化剂，充分混匀。
加入pH调节剂水溶液调节pH至6-9，加水保持土壤水分含量为32％。
用塑料膜封口，并设置多个小孔以保证烧杯内外空气自由流通，定期加入去离子水，使土壤水分含量保持32％，于室温下养护15d。
养护15d后，镉含量采用《水质铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法》（GB7475-1987）测定。
检测结果如表3所示。
（2）处理镉污染的废水
供试水样：黄石市大冶市某厂区废水，水样中镉含量为50mg/kg。
试验方法如下：
分别取6份100mL废水置于烧杯中，分为2组，分别对应实施例8的镉钝化剂不添加镉钝化剂作为空白对照。按照镉钝化剂/供试水样中镉含量的重量比30：1加入镉钝化剂，充分混匀。
加入pH调节剂水溶液调节pH至6-9，室温下反应2h。
离心过滤，测定处理后废水中的镉含量。镉含量采用《水质铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法》（GB 7475-1987）测定。
检测结果如表3所示。
表3有效镉含量检测结果
由表3可知，利用本申请的假单胞菌BGB-132R制得的镉钝化剂除了能够降低土壤中有效镉的含量外，还能够降低废水中镉的含量。对土壤中有效镉的含量能够降低67.7%，对水样中镉含量能够降低68.5%。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种假单胞菌BGB-132R，其特征在于，假单胞菌（Pseudomonas adaceae）BGB-132R保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27751。
2.一种培养物，其特征在于，所述培养物包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
3.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
4.一种菌悬液，其特征在于，所述菌悬液包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
6.一种菌粉，其特征在于，所述菌粉包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
7.一种镉钝化剂，其特征在于，所述镉钝化剂包括权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R。
8.一种权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R、权利要求2所述的培养物、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液、权利要求5所述的菌剂、权利要求6所述的菌粉或权利要求7所述的镉钝化剂在含Cd2+的环境下促进植物种子发芽中的应用。
9.一种权利要求1所述的假单胞菌BGB-132R、权利要求2所述的培养物、权利要求3所述的发酵液、权利要求4所述的菌悬液、权利要求5所述的菌剂、权利要求6所述的菌粉或权利要求7所述的镉钝化剂在Cd2+污染土壤修复领域中的应用。
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