CN103952333A - 一种镉耐性细菌及其抑制水稻吸收重金属镉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重金属镉耐性细菌及其抑制作物吸收重金属镉的方法，属于农业和环境污染治理技术领域。所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）TCd-1，已于2013年12月11日在武汉大学中国典型培养物保藏中心登记保藏，菌种保藏号为CCTCC M2013649。菌株TCd-1经鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌，对多种重金属具有耐性，对镉、铅和镍的耐性浓度分别达到900mg·L^-1、800mg·L^-1和600mg·L^-1。菌液有效活菌数约为1.85~1.87×10⁹个/毫升。在重金属镉污染的湿润土壤中添加该菌液，每千克土壤添加菌液2mL，能修复镉对水稻生长的抑制作用，并有效降低水稻各部位，特别是糙米的镉含量。

Description

一种镉耐性细菌及其抑制水稻吸收重金属镉的方法

技术领域

本发明涉及一种镉耐性细菌及其抑制水稻吸收重金属镉的方法，属于农业和环境污染治理技术领域。 

技术背景

镉是一种毒性极强的重金属元素，土壤中的镉极易被农作物富集，并通过食物链危害人体健康，而目前我国受有毒重金属污染的耕地面积已达2000万hm²，约占总耕地面积的1/5。因此，治理农田重金属污染的目标，不仅是抑制重金属对作物的毒害和提高其产量，更重要的是减少作物对重金属元素的吸收，抑制其进入食物链。土壤重金属污染的修复方法较多，目前常用的物理和物理化学修复方法一般投资昂贵、设备复杂且易导致土壤结构破坏，而一些微生物具有重金属高耐性和强吸附能力，利用这类微生物吸收固定农田土壤重金属，抑制作物对重金属的吸收，降低其在作物体内的含量，可保障农产品的安全。 

发明内容

本发明的目的是提供一种重金属镉耐性细菌，用于抑制水稻对重金属镉的吸收，降低稻米中镉的含量。通过分离筛选重金属镉耐性细菌，将其菌液接种于重金属镉污染的稻田土壤，通过镉耐性细菌对镉的富集、固定作用，实现降低水稻对重金属镉的吸收。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

本发明所述的重金属镉耐性细菌Pseudomonas sp. TCd-1菌株，于2013年12月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2013649。从福建农林大学教学农场水稻根际土中分离得到，经鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）细菌。主要生物学特性为：G-，菌体杆状，具鞭毛。运动性、荧光、脓青素、氧化酶、接触酶、明胶液化、亚硝酸盐还原、V-P试验为阳性，硝酸盐还原、M.R.、淀粉水解试验为阴性。该菌株的菌落为圆形，直径1.0～1.5 mm，不透明，白色，表面光滑，较粘稠，易挑起。

抑制水稻吸收土壤中重金属镉的方法，在水稻栽种前，往重金属镉污染的湿润土壤中添加假单胞菌Pseudomonas sp. TCd-1菌液，每千克土壤添加1-3 mL。 

通过发酵的方法，可以制备本发明所述的重金属镉耐性细菌TCd-1菌液。菌液制备方法如下：将菌株TCd-1接种于液体培养基（牛肉膏3 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，NaCl 5 g·L^-1，琼脂15~20 g·L^-1，pH7.2~7.4），37 ℃ 150 rpm振荡培养24 h，后用无菌水稀释10倍，制成含菌株TCd-1有效活菌数约为1.85~1.87×10⁹个/毫升的菌液。 

有益效果： 

本发明所提供的菌株TCd-1对重金属具有高耐性，对镉、铅和镍的耐性浓度分别达到900 mg·L^-1、800 mg·L^-1 和600 mg·L^-1。

本发明所述的一种重金属镉耐性细菌TCd-1及其抑制水稻吸收重金属镉的方法有如下优点： 

(1) 本发明所述的菌株TCd-1对镉的富集系数达到101.2。

(2) 本发明所述的菌株TCd-1的菌液极易培养获得。 

(3) 本发明所述的菌株TCd-1对水稻镉毒害具有强的修复效果。 

(4) 本发明所述的菌株TCd-1起富集固定土壤重金属镉的作用，降低水稻糙米镉含量达63.24%。 

(5) 本发明所述TCd-1菌株的菌液对作物种子萌发、幼苗生长无抑制作用。 

具体实施方式

菌株TCd-1从福建农林大学教学农场水稻根际土中分离纯化得到。 

实施例1：菌株TCd-1的筛选

取水稻根际土壤5g溶于50 mL无菌水中，取该溶液150 μL于灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中（培养基：牛肉膏3 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，NaCl 5 g·L^-1，琼脂20 g·L^-1，pH 7.3），于摇床上150 rpm，37℃振荡12 h。后从中吸取0.1 mL分别涂布在含100、200、300、400和500 mg·L^-1等5个不同镉浓度的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，每组设3个重复，于37 ℃恒温箱中倒置培养24 h。根据细菌生长情况，采取300 mg·L^-1镉浓度的平板培养基进行划线培养，重复3次以上的操作，观察菌落生长情况TCd-1，斜面保存于4 ℃冰箱中，待用。

实施例2：菌株TCd-1的镉吸收特性

在无菌条件下，将实施例1保藏的菌株TCd-1转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃ 150 rpm振荡培养12 h后作为种子液。吸取TCd-1种子液1 mL接入100 mL镉浓度为100 mg·kg^-1的牛肉膏蛋白胨液体培养基，于37 ℃下振荡培养24 h。取10 mL培养液，10000 rpm离心10 min，菌体沉淀用无菌水漂洗3次后，烘干称量，用于测定菌体镉含量。同上处理后取菌体沉淀悬浮于10 mL无菌水中，超声破碎140 s后，12000 rpm离心10 min，获得细胞壁沉淀，用于菌体细胞壁镉含量测定，上清液用于测定菌体细胞内镉含量，每个处理5个平行。样品经HNO₃-HClO₄消解后用原子吸收法测定。菌株镉富集系数=菌体镉含量/培养液初始镉含量。经测定，在含镉浓度为100 mg·kg^-1培养基中，菌体镉固定含量为10.12±1.07 mg·g^-1，菌株的镉富集系数菌体细胞壁的镉含量为8.28±1.23 mg·g^-1，菌体细胞内镉含量为7.54±1.08 mg·g^-1，菌株TCd-1的镉富集系数为101.2。(如表1所示)

表1  菌株TCd-1的镉吸收能力测定

 

实施例3：菌株TCd-1对镉胁迫下水稻生长的修复作用

取催芽的水稻种子，均匀植入含5 mg·L^-1 CdCl₂的琼脂糖的培养基，每个培养皿中植入10粒种子，以植入未添加镉处理的琼脂糖培养基为对照，设置添加5ml蒸馏水（处理Ⅰ）、菌株TCd-1菌液（处理Ⅱ）两种处理，每个处理重复5次。各处理分别置于25℃的温室中光照培养。每天定量补充水分，7d后测定水稻生物量。结果表明，在镉胁迫下，添加TCd-1菌液处理的水稻生物量与对照的生物量相近，与未添加TCd-1菌液处理（添加5ml蒸馏水）的水稻相比，添加TCd-1菌液处理的水稻株高和鲜重分别增加了38.4%和38.1%，修复效果极其显著。(如表2所示)

表2菌株TCd-1菌液对镉胁迫下水稻幼苗生长的修复作用

 

实施例4：接种菌株TCd-1菌液对水稻吸收重金属镉的抑制作用

称取含镉50 mg·kg^-1的供试土壤5.0 kg，分别装入6个培养盆钵中并编号（编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6），以不加镉的土壤为对照（编号为B1、B2、B3），进行水稻盆栽试验。每盆施2g尿素，0.5g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）作基肥，2天后分别向A1、A2、A3中加入菌株TCd-1菌液10ml，A4、A5、A6加入等量高温灭菌的菌株TCd-1菌液，充分混匀后，移栽三叶期水稻秧苗到盆钵中，每盆5株，置于玻璃温室中培养，室温24～26℃、光照约14h/d，光强约250 μmol·m^-2·s^-1，7d后每盆施0.5g尿素，幼穗分化期每盆施0.6g尿素，水分管理按常规方法进行。在水稻成熟期，分别采集水稻籽粒、地上部和根系样品，各样品在105℃下杀青后，70℃烘干72h，样品研磨过筛后，用硝酸一高氯酸法消煮，原子吸收分光光度计测定各部分的重金属Cd含量。结果显示，添加TCd-1菌液处理的水稻根、茎和糙米镉含量比加灭菌的TCd-1菌液处理的分别降低了70.40%、69.36%和63.24%（见表3）。

表3  菌株TCd-1菌液对水稻各器官镉含量的影响(镉含量mg·kg ^-1 )

 

实施例5：菌株TCd-1对不同作物种子萌发的影响

选取饱满程度一致的水稻、小白菜、空心菜、绿豆种子，先用10%的NaClO溶液消毒5 ~ 6 min。再用去离子水洗涤种子3次，并用蒸馏水浸泡吸胀后取出，放入铺单层滤纸的培养皿内，每个培养皿中放15粒。分别添加5ml蒸馏水、菌株TCd-1菌液处理，每个处理重复5次。然后放入25℃的温室中光照培养。每天补充水分，观察并记录发芽的种子数。结果发现菌株TCd-1对水稻、小白菜、空心菜种子的发芽没有抑制作用（见表4）。

表4  菌株TCd-1菌液对不同作物种子发芽率的影响(%)

 

实施例6：菌株TCd-1对不同作物幼苗生长的影响

取实水稻、小白菜、空心菜、绿豆吸胀的种子进行催芽，选取萌发一致的种子植入盛有琼脂糖的培养基的培养皿中，每个培养皿中植入8粒萌发的种子。在各培养皿中添加5ml菌株TCd-1菌液处理，以5ml蒸馏水为对照，各处理重复5次。之后，把培养皿放入25℃的温室中光照培养，每天定量补充水分，7d后测定各作物幼苗株高。结果表明，菌株TCd-1不会抑制4种作物幼苗的生长（表5）。

表5菌株TCd-1菌液对不同作物生长的影响(株高cm·株 ^-1 )

 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (4)

1.一种重金属镉耐性细菌，其特征在于：所述菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）TCd-1，已于2013年12月11日在武汉大学中国典型培养物保藏中心登记保藏，菌种保藏号为CCTCC M 2013649。

2.一种如权利要求1所述的一种重金属耐性细菌抑制水稻吸收土壤中重金属镉的方法，其特征在于：在水稻栽种前，往重金属镉污染的湿润土壤中添加假单胞菌（Pseudomonas sp.）TCd-1菌液，每千克土壤添加1-3 mL。

3.根据权利要求2所述的一种重金属镉耐性细菌抑制水稻吸收土壤中重金属镉的方法，其特征在于：通过发酵的方法，菌液制备方法如下：将菌株TCd-1接种于液体培养基，37 ℃ 150 rpm振荡培养24 h，后用无菌水稀释10倍，制成含菌株TCd-1的菌液；所述的液体培养基：牛肉膏3 g·L^-1，蛋白胨10 g·L^-1，NaCl 5 g·L^-1，琼脂15~20 g·L^-1，pH7.2~7.4。

4.根据权利要求2所述的一种重金属镉耐性细菌抑制水稻吸收土壤中重金属镉的方法，其特征在于：所述菌液含菌株TCd-1有效活菌数为1.85~1.87×10⁹个/毫升。