CN113303183B - 一种降低水稻中总汞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降低水稻中总汞的方法，包括独特的菌种P11培养液的制备、P11处理水稻、分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥、日常管理等步骤。采用本发明方法种植水稻，能显著降低水稻中总汞含量；水稻种植生产过程相对简单，只比常规的水稻种植方法多了一步叶面喷施的过程，喷施操作简单，工作量较小，人力成本和经济成本低；所使用的菌株来自土壤环境，其培养基原料简单易得，其培养液制备工艺简单，耗能少，成本低廉；喷施的培养液环境安全性较高，对环境危害小，几乎不会造成二次污染，几乎不会改变土壤基质和影响土壤结构。

Description

一种降低水稻中总汞的方法

技术领域

本发明涉及农作物安全生产技术领域，尤其涉及一种降低水稻中总汞的方 法。

背景技术

随着我国工业化的发展，环境污染问题越来越严峻，2014年国家环境保护 部和国土资源部联合发布了关于全国土壤污染状况的调查，指出全部污染物总超 标率为16.1％，其中排名前三的无机污染物依次为Cd、Hg、As。其中，汞破坏 中枢神经系统，对口、粘膜和牙齿有不良影响，汞可以在生物体内积累，很容易 被皮肤以及呼吸道和消化道吸收，长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死 亡。

由于汞具有长程跨界污染，易滞留于土壤，易被植物吸收的特点，所以汞污 染广受关注。水稻可以富集汞，汞污染农田会严重影响水稻的质量安全，因此针 对消除汞污染的危害开发高效的水稻安全生产技术，对社会的经济发展和居民的 身体健康都具有重要的积极意义。

目前，常用的汞污染土壤治理修复技术是钝化技术，但是有一些不足，如成 本高、技术复杂、易改变土壤的理化性质等。在现有技术中，存在一些旨在降低 水稻种汞含量的方法。中国专利CN 109719123 A公开了一种利用亚硒酸钠改性 生物炭降低水稻富集无机汞和甲基汞的方法，包括以下步骤：选用水稻秸秆生物 炭，研磨后用水清洗数次，低温烘干备用；取亚硒酸钠溶于水中，加入生物炭搅 拌混匀，保持硒炭质量比为1:1000，震荡均匀24h；置于真空干燥箱干燥至恒重； 采集受汞污染严重的水稻土，晾干至可以过筛；向土壤中添加上述亚硒酸改性生 物炭的比例为土壤质量的5％。该发明方法能有效降低水稻对无机汞和甲基汞的 吸收，但是该方法的不足之处在于亚硒酸钠改性生物炭制备比较复杂，成本高， 且不环保，亚硒酸钠剧毒，有危害土壤生态系统的可能。中国专利CN 109588218 A公开了一种用于降低农作物汞含量的种植方法，所述种植方法包括：用施加了 土壤调理剂的汞污染土壤做为种植土壤种植所述农作物，其中土壤调理剂包括如 下原料：石灰石粉、有机碳粉、方解石粉、石英石粉、海泡石粉。该方法能降低 农作物对汞的吸收，但是该方法的不足之处在于不清楚野外非精细化处理的效 果，另每次种植水稻时均需要添加此土壤调理剂，长期添加矿质材料有改变土壤 结构的风险。中国专利CN 108178709 A公开了一种水稻吸收汞抑制剂的制备方 法及其施用方法，其中水稻吸收汞抑制剂包括制备的生物质炭，其施用方法主要 为将水稻吸收汞抑制剂和以氮肥、磷肥和钾肥组成的基肥翻埋于汞污染土壤耕层 再种植水稻，该方法能降低无机汞在水稻中的富集，抑制水稻对甲基汞的吸收，但是该方法的不足之处在于生物炭的制备高耗能。重金属污染的微生物修复技 术，是利用微生物对重金属的生物转化，主要指微生物对重金属进行溶解、生物 氧化与还原、矿化、甲基化与去甲基化以及改变重金属的价态达到转化重金属的 目的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种能有效降低水稻中总汞 含量，工艺相对简单，成本低，耗能低，环境安全性高，对土壤结构无破坏性影 响的降低水稻中总汞的方法。

为实现上述目的，本发明提供的一种降低水稻中总汞的方法，其特征在于包 括如下步骤：

①P11培养液制备：

取保存的P11菌种即台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis 11，保藏于中 国典型培养物保藏中心，中国，武汉，武汉大学，保藏日期2016年11月30日， 保藏编号为CCTCCNo:M 2016700)活化，得到P11的活化菌液；培养所述 P11的活化菌液，得到P11培养液；

②P11处理水稻：在水稻生长至分蘖末期即分蘖至8叶期、孕穗期和灌浆期 时，将所述P11培养液稀释20倍，以喷雾的形式将其喷在水稻叶片和根部，连 续喷施3天，每天喷施1次；

③施肥：分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥；

④日常管理：根据常规的水稻种植技术进行日常管理。

作为一个可选择的方案，在步骤②之前，将微生物有机肥作为底肥，在插秧 前按照每公斤土150g的量施加微生物有机肥；所述的微生物有机肥是往粉碎的 千禧果秸秆中加入含有链霉菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样 芽孢杆菌、假单胞菌的堆肥菌剂，然后发酵制成。

优选地，步骤①所述的P11培养液制备方法为，将所述的P11的活化菌液按 照1:100的体积比接种在改良的M9培养基中，在30℃，180rpm的振荡摇床中 培养48h，得到P11培养液；所述改良的M9培养基包括磷酸氢二钾6g/L、磷 酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L、七水硫酸镁0.2g/L和甘油4g/L，pH 6.8±0.2；

在步骤②中，所述以喷雾的形式进行操作时，水稻植株均匀出现小水滴即可， 每亩喷施量为40升；

步骤③所述的复合肥是含氮、磷、钾等主要元素的化肥，是以尿素、磷铵和 硫酸钾为主要原料制成的，氮、磷、钾有效养分含量≥25％。

本发明的有益效果是：能显著降低水稻中总汞含量；水稻种植生产过程相对 简单，只比常规的水稻种植方法多了一步叶面喷施的过程，喷施操作简单，工作 量较小，人力成本和经济成本低；所使用的菌株来自土壤环境，其培养基原料简 单易得，其培养液制备工艺简单，耗能少，成本低廉；喷施的培养液环境安全性 较高，对环境危害小，几乎不会造成二次污染，几乎不会改变土壤基质和影响土 壤结构。

附图说明

图1为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis显微镜(1000X)观察照片图；

图2为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis平板菌落形态图；

图3为进化树图；

图4为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis处理不同时长的汞离子浓度变 化图；

图5为双硫腙法测汞的标准曲线；

图6为种植水稻过程中不同处理方式所获得的稻谷总汞含量图；

图7为对照组汞含量检测报告页一图；

图8为对照组汞含量检测报告页二图；

图9为对照组汞含量检测报告页三图；

图10为P11组汞含量检测报告页一图；

图11为P11组汞含量检测报告页二图；

图12为有机肥+P11组汞含量检测报告页一图；

图13为有机肥+P11组汞含量检测报告页二图。

具体实施方式

实施例1本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis的检测

(1)形态

本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis显微镜(1000X)观察照片见图1， 平板菌落形态图见图2。

(2)16S rRNA基因序列分析

①16S rRNA基因序列

②16S rRNA基因测序BLAST结果

16S rRNA基因测序BLAST结果见表1。

表1本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis 16S rRNA基因测序BLAST结果

③进化树

进化树见图3。

(3)本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis生理生化特性

本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis生理生化特性检测结果见表2、表3， 结果为革兰氏阴性菌。

表2菌株生理生化特性–酶活、碳源氧化

+：阳性反应；-：阴性反应；

表3菌株生理生化特性—利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；w：弱阳性反应

实施例2P11菌株处理水环境汞的试验分析

(1)汞速测试剂盒分析：

1)试验步骤：

①配制培养基：配制稀释10倍的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，然后往培养液 中加入HgCl₂，使Hg²⁺的终浓度为1mg/L；

②P11菌种的活化：取保存的P11菌种(活化的P11菌液Abs600(600nm处 的吸光度值)在0.4-0.5时，与30％甘油等体积比混合即为所述保存的P11菌种， P11菌种保存于-20℃以下)，按照1:100的体积比接种于稀释10倍的胰蛋白胨大 豆肉汤培养基中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养10-12小时，即菌液Abs600 在0.4-0.5之间，即得到P11的活化菌液。

③培养：按照1:100的体积比接种上述P11的活化菌液于步骤①所配制的含 汞培养基中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养。

④取样：在培养0,12,36,60小时后取样放置4℃保存备用。

⑤测汞：使用食安迅达科技有限公司的汞速测试剂盒，根据其使用说明对上 述保存的样品先稀释50倍，然后进行测试。

2)试验结果：

实验结果见附图4，发现随着处理时间的推移，试纸颜色逐渐变浅，36h之 后汞离子含量仅有约0.1mg/L，而原始汞离子含量为1mg/L，则汞离子降低约 (1-0.1)/1＝90％。

(2)双硫腙法分析：

1)试验步骤：

①绘制标准曲线：吸取0，0.5，1，2，3，4，5，6mL的1mg/L汞标准使用 液，分别置于125mL分液漏斗中，加5％硫酸10mL，再加水至40mL，混匀。 在各加20％盐酸羟胺溶液1mL，放置20min，并时时摇动。上述溶液摇动放冷后 置于分液漏斗中加5mL双硫腙使用液，剧烈摇动2min，静止分层，经脱脂棉将 三氯甲烷层滤入比色杯，以三氯甲烷调节零点，在波长490nm处测Abs值(吸光 度值)。绘制汞含量-Abs值的曲线。

②P11处理：取P11活化菌液按照1:100的体积比加入到稀释10倍的胰蛋白 胨大豆肉汤培养基中，在30℃、180rpm的振荡摇床中培养12h，加入HgCl₂， 使得Hg²⁺的终浓度为1mg/L，继续处理72h。

③处理样品的测定：取2mL上述P11的处理液，同绘制标准曲线的测定方 法一样。

2)试验结果：

P11处理1mg/L的Hg²⁺溶液3天后，取2mL样品测汞含量，Abs₄₉₀＝0.113， 则根据图5可知P11处理后的汞含量为0.26μg，则汞离子降低约(2-0.26)/2＝87％。

实施例3本发明方法降低水稻中总汞的效果试验

1)试验步骤：

①分组：将汞污染土壤分成三组，A组为空白对照组，B组为P11培养液处 理组，C组为用微生物有机肥(千禧果秸秆用链霉菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、 巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、假单胞菌等发酵制成)作为底肥后再用P11 培养液处理组。

②水稻种植：将土壤按照分组分装在盆里，C组施加150g/Kg(土)的步骤① 所述微生物有机肥，然后往所有的盆里浇水，没过土壤即可，然后将培育13天 左右的秧苗插好。

③P11培养液制备：实施例2所述的P11的活化菌液按照1:100的体积比接 种在改良的M9培养基(磷酸氢二钾6g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸铵1g/L,七水 硫酸镁0.2g/L,甘油4g/L,pH 6.8±0.2)中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养 48h，得到P11培养液。

④B组和C组的P11培养液处理：在种植水稻50天后，水稻生长至分蘖末 期(分蘖至8叶期)时，将P11培养液稀释20倍，以喷雾的形式将其喷在水稻叶 片和根部，水稻植株均匀出现小水滴即可，连续喷施3天，每天喷施1次。

⑤B组和C组的P11培养液继续处理：在种植水稻65天后到孕穗期以及之 后在过15天到灌浆期的时候，同步骤④方法用P11培养液处理。

⑥施肥：分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥，大约1Kg的土壤施加15g复 合肥(复合肥是含氮、磷、钾等主要元素的化肥，是以尿素、磷铵和硫酸钾为主 要原料制成的，氮、磷、钾有效养分含量≥25％)。

⑦日常管理：根据常规的水稻种植技术进行日常管理。

⑧检测汞含量：将收获的水稻稻谷送至具有IMA资质的大连产品质量检验 检测研究院有限公司，按照我国《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)总汞的检测方法，测水稻稻谷的总汞含量。

2)试验结果：

实验结果见图6，发现与对照相比，加了P11培养液的稻谷总汞含量均降至 国家最低标准。(图6数据来自于检测报告，所述检测报告结果见图7、8、9、 10、11、12、13)

需要说明的是，用P11菌和有机肥共同用于汞污染土壤的水稻种植和单独用 P11菌用于汞污染土壤的水稻种植相比，稻谷总汞含量虽然在国家最低标准之下 有所升高，但是水稻稻谷的产量却增加了15％以上。

实施例4用本发明方法在汞污染土壤中种植水稻(P11菌用于汞污染土壤 的水稻种植)

①P11培养液制备：实施例2所述的P11的活化菌液按照1:100的体积比接 种在改良的M9培养基(磷酸氢二钾6g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸铵1g/L,七水 硫酸镁0.2g/L,甘油4g/L,pH 6.8±0.2)中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养 48h，得到P11培养液。

②P11处理水稻：在水稻生长至分蘖末期(分蘖至8叶期)、孕穗期和灌浆期 时，将P11培养液稀释20倍，以喷雾的形式将其喷在水稻叶片和根部，水稻植 株均匀出现小水滴即可(一般每亩40升)，连续喷施3天，每天喷施1次。

③施肥：分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥，大约1Kg的土壤施加15g复 合肥(复合肥是含氮、磷、钾等主要元素的化肥，是以尿素、磷铵和硫酸钾为主 要原料制成的，氮、磷、钾有效养分含量≥25％)。

④日常管理：根据常规的水稻种植技术进行日常管理。

实施例5用本发明方法在汞污染土壤中种植水稻(P11菌和有机肥共同用于 汞污染土壤的水稻种植)

①微生物有机肥获得：利用常规的堆肥技术，往粉碎的千禧果秸秆中加入含 有链霉菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、假单胞菌 等的堆肥菌剂，然后发酵制成。

②P11培养液制备：实施例2所述的P11的活化菌液按照1:100的体积比接 种在改良的M9培养基(磷酸氢二钾6g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸铵1g/L,七水 硫酸镁0.2g/L,甘油4g/L,pH 6.8±0.2)中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养 48h，得到P11培养液。

③微生物有机肥处理：步骤①所述的微生物有机肥作为底肥，在插秧前施加150g/Kg(土)的微生物有机肥。

④P11处理水稻：在水稻生长至分蘖末期(分蘖至8叶期)、孕穗期和灌浆期 时，将P11培养液稀释20倍，以喷雾的形式将其喷在水稻叶片和根部，水稻植 株均匀出现小水滴即可(一般每亩40升)，连续喷施3天，每天喷施1次。

⑤施肥：分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥，大约1Kg的土壤施加15g复 合肥(复合肥是含氮、磷、钾等主要元素的化肥，是以尿素、磷铵和硫酸钾为主 要原料制成的，氮、磷、钾有效养分含量≥25％)。

⑥日常管理：根据常规的水稻种植技术进行日常管理。

序列表

<110> 湖北师范大学

<120> 一种降低水稻中总汞的方法

<141> 2021-05-19

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1432

<212> DNA

<213> Pseudomonas taiwanensis

<400> 1

tggcggcagc tacacatgca gtcgagcgga tgacgggagc ttgctccttg attcagcggc 60

ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt tcgaaaggaa 120

cgctaatacc gcatacgtcc tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct tgcgctatca 180

gatgagccta ggtcggatta gctagttggt ggggtaatgg ctcaccaagg cgacgatccg 240

taactggtct gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg 300

ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg 360

tgtgaagaag gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc agtaagttaa 420

taccttgctg ttttgacgtt accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc 480

gcggtaatac agagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt 540

ggtttgttaa gttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactgg 600

caagctagag tacggtagag ggtggtggaa ttttctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata 660

taggaaggaa caccagtggc gaaggcgacc acttggactg atactgacac tgaggtgcga 720

aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcaac 780

tagccgttgg aatccttgag attttagtgg cgcagctaac gcattaagtt gaccgcctgg 840

ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900

gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggccttgaca tgcagagaac 960

tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa ctctgacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1020

agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt 1080

accagcacgt tatggtgggc actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg gcctgggcta cacacgtgct acaatggtcg 1200

gtacagaggg ttgccaagcc gcgaggtgga gctaatctca caaaaccgat cgtagtccgg 1260

atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgcg aatcagaatg 1320

tcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1380

gcaccagaag tagctagtct aaccttcggg aggacggtac cacggtgatc gt 1432

Claims (3)

1.一种降低水稻中总汞的方法，其特征在于包括如下步骤：

①P11培养液制备：

取保存的P11菌种活化，得到P11的活化菌液；所述P11菌种为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2016700；培养所述P11的活化菌液，得到P11培养液；所述的P11培养液制备方法为，将所述的P11的活化菌液按照1:100的体积比接种在改良的M9培养基中，在30℃，180rpm的振荡摇床中培养48h，得到P11培养液；所述改良的M9培养基包括磷酸氢二钾6g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵1g/L、七水硫酸镁0.2g/L和甘油4g/L，pH 6.8±0.2；

②P11处理水稻：在水稻分蘖至8叶期、孕穗期和灌浆期时，将所述P11培养液稀释20倍，以喷雾的形式将其喷在水稻叶片和根部，连续喷施3天，每天喷施1次；

③施肥：分别在分蘖期和抽穗期施加复合肥；

④日常管理：根据常规的水稻种植技术进行日常管理。

2.如权利要求1所述的一种降低水稻中总汞的方法，其特征在于：在步骤②之前，将微生物有机肥作为底肥，在插秧前按照每公斤土150g的量施加微生物有机肥；所述的微生物有机肥是往粉碎的千禧果秸秆中加入含有链霉菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、假单胞菌的堆肥菌剂，然后发酵制成。

3.如权利要求1或2所述的一种降低水稻中总汞的方法，其特征在于：步骤②中，所述以喷雾的形式进行操作时，水稻植株均匀出现小水滴即可，每亩喷施量为40升；

步骤③所述的复合肥是含氮、磷、钾元素的化肥，是以尿素、磷铵和硫酸钾为主要原料制成的，氮、磷、钾有效养分含量≥25％。

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