CN107529761A - 使用台湾假单孢菌控制昆虫及微生物的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用台湾假单孢菌(Pseudomonas taiwanensis)控制昆虫及微生物的组合物及方法。本文中描述使用台湾假单孢菌(Pseudomonas taiwanensis)及其培养液控制昆虫及微生物生长的方法及组合物。

Description

使用台湾假单孢菌控制昆虫及微生物的组合物及方法

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2014年6月11日申请的美国临时申请案第62/010,776号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

使用生理、生物化学、细胞脂肪酸及16S rRNA基因序列法将台湾假单孢菌(Pseudomonas taiwanensis)(假单孢菌种TKU015)分类为新颖细菌。其自土壤分离且可在虾壳粉末作为唯一碳及氮源的培养基上生长。台湾假单孢菌在虾壳培养基下显示高水平细胞外壳质酶、脱乙酰几丁质酶及纳豆激酶(nattokinase)活性。已展示，单独自台湾假单孢菌重组TccC可导致果蝇(Drosophila)幼虫的死亡，表明台湾假单孢菌的TccC具有其自身有毒特性。

发明内容

本文中描述使用台湾假单孢菌控制昆虫及微生物生长的方法及组合物。

在一个态样中，本文中描述一种产生用于抑制微生物生长的组合物的方法。该方法包括在养分有限培养基中培养台湾假单孢菌菌株以获得培养液及收集该培养液，因此产生组合物。在一个实施例中，培养基为铁有限培养基。培养基可为补充有酪蛋白氨基酸、MgSO₄及甘油的M9基本培养基。该方法可进一步包括自培养液移除细胞以获得无细胞上清液及收集该无细胞上清液。在一个实施例中，台湾假单孢菌菌株具有寄存编号DSM 21245。在另一实施例中，台湾假单孢菌菌株具有功能丧失rpoS突变。在一个实施例中，微生物为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。微生物可为水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、稻热病菌(Pyriculariaoryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、兰花萎凋病菌(Fusarium oxysporum f spcattleyae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或白色念珠菌(Candida albican)。

在另一态样中，本文中描述一种用于抑制微生物生长的组合物。该组合物通过包括在养分有限培养基中培养台湾假单孢菌菌株以获得培养液及收集该培养液的上文所描述的方法而产生。组合物可进一步含有一或多种其他抗细菌剂、抗真菌剂或杀虫剂。

在又一态样中，本文中描述一种抑制微生物生长的方法，其包括使微生物与上文所描述的通过在养分有限培养基中培养台湾假单孢菌菌株产生的组合物接触。微生物可为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。在一个实施例中，微生物选自由以下组成的群：水稻黄单孢菌水稻致病变种、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌、辣椒疫霉菌、稻热病菌、立枯丝核菌、兰花萎凋病菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。

本文中亦描述一种治疗或降低水稻细菌性枯叶病(rice bacterial blight)风险的方法。该方法包括将上文所描述的组合物施用至有需要的水稻植物上。

在一个态样中，下文描述一种抑制微生物生长的方法，其包括使微生物与具有结构Q-DSer-Lys-OHHis-aDThr-Ser-cOHOrn的经分离萤绿素(pyoverdine)接触。Q为发色团，且微生物为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。在一个实施例中，微生物选自由以下组成的群：水稻黄单孢菌水稻致病变种、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌、辣椒疫霉菌、稻热病菌、立枯丝核菌、兰花萎凋病菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。

在另一态样中，本文中描述一种抑制昆虫生长的方法，其包括使昆虫与含有台湾假单孢菌菌株、台湾假单孢菌细胞溶解物或台湾假单孢菌TccC多肽的组合物接触。昆虫为鳞翅目(Lepidopteran)物种。在一个实施例中，昆虫为小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在一个实施例中，细胞溶解物为全细胞溶解物或可溶性溶解物。台湾假单孢菌菌株可在富含养分的培养基中经培养，且细胞溶解物可自富含养分的培养基中培养的台湾假单孢菌菌株获得。

一或多个实施例的细节阐述于以下随附图式及实施方式中。实施例的其他特征、目标及优点将自实施方式及图式及申请专利范围显而易见。

附图说明

图1为展示萤绿素结构及ESI轨道阱质谱中的特征离子的一组示意图及图表。

图2为(a)台湾假单孢菌与(b)绿脓假单孢菌(P.aeroginsa)POA1的萤绿素基因座的示意性比较。

图3为一组(a)展示成熟萤绿素的亚细胞定位的图表及(b)台湾假单孢菌中的萤绿素分泌路径的示意性图式。

图4为一组(A)展示与内部对照16S rRNA基因(白色三角形)的TccC表达量相比，在台湾假单孢菌的不同生长阶段(灰色条形图)期间的TccC表达量的图表。在OD600(黑色圆)处量测台湾假单孢菌的生长曲线，及(B)展示经台湾假单孢菌处理的小菜蛾幼虫的相片。

图5为一组展示台湾假单孢菌及各种细胞部分对草地黏虫(Spodopterafrugiperda)Sf9昆虫细胞的毒性的图表。(A)台湾假单孢菌野生型及ΔtccC(MOI＝1000)及来源于台湾假单孢菌的(B)细胞溶解物、(C)可溶性溶解物及(D)不溶性溶解物的蛋白部分(10μg/ml)感染后的Sf9细胞的存活率。96孔盘中的每孔含有5000个Sf9细胞。结果在台湾假单孢菌感染或蛋白处理72h后，通过XTT增殖分析获得。

图6为自台湾假单孢菌培养液分离不同蛋白部分的程序示意图。

具体实施方式

本文中描述一种产生抑制微生物生长的组合物的方法。该方法包括在养分有限培养基中培养台湾假单孢菌菌株以获得培养液。收集培养液以获得该组合物。

养分有限培养基可为不具有铁源的培养基，例如铁有限培养基。举例而言，培养基可为M9培养基，其可补充有其他养分(例如，酪蛋白氨基酸、MgSO₄及甘油)。菌株可在铁有限培养基中在25℃至37℃下培养1至6天。培养基可含有一定低量铁，只要该量足够低以允许产生有效针对靶向微生物的培养液。

所得培养液可用作抑制微生物生长的组合物。视情况，细胞可自培养液移除以获得无细胞上清液，其可随后用作该组合物。

本文中亦描述一种使用具有结构Q-DSer-Lys-OHHis-aDThr-Ser-cOHOrn的经分离萤绿素抑制微生物生长的方法，其中Q为发色团。此类萤绿素可通过在铁有限培养基中培养台湾假单孢菌菌株及分离由此产生的萤绿素来获得。

此外，本发明包括一种抑制昆虫生长的方法。该方法包括使昆虫与含有台湾假单孢菌菌株、台湾假单孢菌细胞溶解物或台湾假单孢菌TccC多肽的组合物接触。

细胞溶解物可为全细胞溶解物或可溶性溶解物。细胞溶解物可通过在富含养分的培养基(例如，LB培养基或1/2TSB培养基)中培养台湾假单孢菌菌株，使细胞分裂及随后收集细胞溶解物来获得。细胞溶解物可经过滤、离心或以其他方式处理以分离可溶性溶解物及不溶性溶解物。举例而言，可使用图6中展示的程序。

台湾假单孢菌TccC多肽可使用此项技术中已知的技术获得。下方展示台湾假单孢菌TccC的核酸序列(SEQ ID NO:1)及氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

TACTCATCTGAGTACGACAGGGATGCCGCCATGCCTGGCGGCTTTTCCGATACGTCAAACAGCGCTTTCCGACTAGCAGTCAGCCATACAGCCAAATCAAGCTGATTCTTCACTCCCCTCTGGGGGTGGCGAAAAATCAACATGATCAAGGTAACTGCAAGTTGGGACACATAGACTTTTCACTTCATAACGGAACGCCTACGGTCACCGTCCGAGACAACCGAGGATTAGGCATCCGCGATATCGCTTATCATCGCCATCCCGATACACCCGAACAACTCGACGAACGCATCACCCGCCACCGGTTCAACGCCCTTGCGCAGCTTGAGCAAAGCATCGATCCTCGCCTCCATGAACGCCAAGCCGTGGACGCGACGACCCAACCCAATTACAAATTTCATAATTCGCTGACGGGCGATGTCCTGCGTAGCGACAGTGCCGACGCGGGCGTCACGCTCTCGCTCAACGATGTTCACGGCCGCCCGTGCCTGAGCATTGGCGCCACAGGCGCGCTCCATCGCTGGCACTATGAAACCCCACCGCTTGCAGGGCGATTGCTACACGTGAGTGAGCATATCGCCGAAGCAAATCCGCGCATCACAGAACGCTTGGTCTGGGGCGACAACACCCAGACTGCGAAGGATCAGAATCTTGCAGGCCGATGCGTGCGCCACTATGACACGGCAGGTTGTTGGCAGATGGACAGCGCCGGCTTGTCCGCAAGCGTACTTTCCGCCACCCAAAAGTTGCTGGCGGAAGGCACCGAAGCCGATTGGCAGGGAGAGGACGCGGCAGTCTGGGACAAGCTACTAGCACCGGATGCGTTCACGACCTCACATCGTATCGACGCGACGGGAGCTTCCATCGAGCAACGCGATGCGCTCGGCCATACCCAATGCCAGGCCTATGACATAGCGGGCATGCTGCGTAGCACTCGGCTGATCATGAAAGGTGGAACGACGCGGGTTATCTTGAAGGCTGTGGAATACTCCGCGTTCGGACAAAAGCTGCGGGAAGAACAGGGCAACGGCGTCATTACCACCTACACCTACGAACAGCGGACTCAGCGCCTCCTAGGCAGCAAGATCGAACGACGTGCCGGGCGCAGCGAGGCGAAAGTCCTGCAAGACATACGGTACGAATATGACCCAGTCGGTAATATCCTGAGTGTGCACAATGATGCGGAGGCGACGCGGTTCTGGCGTAATCAGAAGATCGTACCGGTCAATCCCTATGCATATGACAGCCTCTATCAACTGATCTCAGCCAGCGGCCGTGAAATGGCCGATATGCCCCGCCAAGGCCCTAAGCCTCCCTCCCCCACCATTCCACTCCCGACCAACGACGGGGCCTACACCAACTACACACGTCGTTACCAATACGATCGCGCTGGCAACCTGACGCGTATCTCACACAGCGCACCCGCCTCCAACAACAGCTATACCCTGGACATGACAGTGTCCAACCGCAGCAATCGGGCGGTATTGCATACTCTCGCCGACGATCCTGCCAAGGTCGATGCCCTCTTCGATGCAGCGGGCAATCAGTTACAACTGCAACCTGGCCAATCCCTTCATTGGACACCGCGCGGGCAGCTCGGCAAGTTCGTGTCACAGGCAGGTGATGACAGCGCTGTTGACCAGGAAAGCTATCGCTACGGTGCAGACGGCCAACGGATCGCCAAATACAACTCCCAACAGGCAGGCGCCCAAACGGGATACGTACTTTATTTGCCAGGGTTGGAGGTGCGCGCCCGTTTCAGGGACGATGCGATAAAAGAACTGCTTCACGTGATCACCATCGGCGAAGCCGGTAATGCTCAAGTGCGATTACTGCACTGGGAAACCGGCACACCGCCAAGTGTCAGCAATGACTCGCTGCGCTACGGCTATTCCAATCTCATAGACAGCGTCGGGCTCGAACTCGATAGCGACGGTCAAATCATCAGCTATGAAGAGTACTACCCCTACGGCGGCTCTGCGGTATGGGCCGCTCGCAGCCAGACAGAAGCCGATTACAAGACCGTGCGTTATTCAGGGAAAGAACGCGATGGCACGGGGCTCTATTATTACGGTCACCGGTATTACCAACCCTGGGTCGGGCGCTGGCTCAGTGCAGACCCTGCCGGTACGGTCGATGGACTCAATCTCTACCGAATGGTACGAAACAACCCCATTGCCTTAAAAGACAACAACGGATTGAATGCCGAAGGGTATTACCATGAGTTCCAAGCGCTGAAGAGCGCACCCAGTATGATCCGTAATACCAGGCTTCAAATTCAAGATTATATGCGAAGCCAAACCGAAAGCCGGATTATTTACGTGTTGATGTCGGTCGTTTTGGAAGCGCTCGCTACGACCATTGGCATGGCCGGCGGCCTCCTGGGCGGTGCGGCGGGAGGGGCTATAGGAGGCGCTGTAGGAGGGGTTATCGCCAACGTTCCAGGAGCCGCTGTAGGCGCAACCTGGGGGGCTAGCGTAGGAGGGCTCGTCGGGAAAACCGTTGTAAAGAAAGCGGCAGAGAAAATACTCCCGCAGGCTGAGTTGACGCCAGACCTCGACATGACAAAAAAAATAAACGAAACGGCCGAAGGCGGCCTTAGGCATAAAATCAAACATTTCCTAGAAAAAGAAATAACCATGGAAAAGCTCCGTGGAAAAATAACCGATGATCAAATGACCAACGATGCAAACAAAGTGGCGACAGGCGTGGGTTTACCACAATACCCTCTTACCCTTCCCGTATCAAAAGCGATAAAAGTCGCCACAGAAGTGGAAAAATCAATAACCGTTACCACAAAACATGCAGTAGCCGGGGCAATACCTGCTCAAGTAGAGATTGCAAAAGGTGCCCTTCATGCCATTTACTCAAAGATAGACGCGCAATTCGGTAAGCTCAGCAGCATGCGCAGCCGTAAAAGCCTGTTGAGGCCTTTCATACCCGATGGCCCACGAGAGCTTTCCATTACATTGAATAATGACCCGTTCAACCCTGATGCATGGGTGGGAAGATCGGAGGTCGAGAAGCCTTACCAGGCAGCCTTGGCCGAACTGGATAAACTTAACGAACTGTACGTTAAGTACGAAAAAAAATTTCGTACTTAAGCGATCTCAACAACCGGCCCCGCCGGTTTGCTGCATGCAAGACCGGCGGTACCCCAATGCCTGAACTCACCCCGCCTCAGCCCGAATCCGTATCGCATCATGACGCCAATATTCCAGGTCACAGTCGATCAGATGCCCATACTGGTCGCTGTTGACCCGGGTGACATGCAACCCCGGACTACCCGCCGAGACCTTGAGGGCTGCGGCAGCCGGAGCCGGCAACGCGGTCGGCAGGATCTCGAAGCATACCCGGCCGTAAGCGATCCCATAGGCTTTGGCATAGATCTCGGTCAGCGACTGACCAAGATCCAACTCCAGGATCCCAGGAAAATACCTAGGGTTCAGGTAATGCTCGGCATACAGCACCGCGCGCCCGTCGATACGCCGCAAGCGGCAGATCTGCACCACGCTGGACAAC(SEQ ID NO：1)

MGHIDFSLHNGTPTVTVRDNRGLGIRDIAYHRHPDTPEQLDERITRHRFNALAQLEQSIDPRLHERQAVDATTQPNYKFHNSLTGDVLRSDSADAGVTLSLNDVHGRPCLSIGATGALHRWHYETPPLAGRLLHVSEHIAEANPRITERLVWGDNTQTAKDQNLAGRCVRHYDTAGCWQMDSAGLSASVLSATQKLLAEGTEADWQGEDAAVWDKLLAPDAFTTSHRIDATGASIEQRDALGHTQCQAYDIAGMLRSTRLIMKGGTTRVILKAVEYSAFGQKLREEQGNGVITTYTYEQRTQRLLGSKIERRAGRSEAKVLQDIRYEYDPVGNILSVHNDAEATRFWRNQKIVPVNRYAYDSLYQLISASGREMADMPRQGPKPPSPTIPLPTNDGAYTNYTRRYQYDRAGNLTRISHSAPASNNSYTLDMTVSNRSNRAVLHTLADDPAKVDALFDAAGNQLQLQPGQSLHWTPRGQLGKFVSQAGDDSAVDQESYRYGADGQRIAKYNSQQAGAQTGYVLYLPGLEVRARFRDDAIKELLHVITIGEAGNAQVRLLHWETGTPPSVSNDSLRYGYSNLIDSVGLELDSDGQIISYEEYYPYGGSAVWAARSQTEADYKTVRYSGKERDGTGLYYYGHRYYQPWVGRWLSADPAGTVDGLNLYRMVRNNPIALKDNNGLNAEGYYHEFQALKSAPSMIRNTRLQIQDYMRSQTESRIIYVLMSVVLEALATTIGMAGGLLGGAAGGAIGGAVGGVIANVPGAAVGATWGASVGGLVGKTVVKKAAEKILPQAELTPDLDMTKKINETAEGGLRHKIKHFLEKEITMEKLRGKITDDQMTNDANKVATGVGLPQYPLTLPVSKAIKVATEVEKSITVTTKHAVAGAIPAQVEIAKGALHAIYSKIDAQFGKLSSMRSRKSLLRPFIPDGPRELSITLNNDPFNPDAWVGRSEVEKPYQAALAELDKLNELYVKYEKKFRT(SEQ ID NO：2)

一或多种额外杀虫剂、抗真菌剂或抗细菌剂可添加至通过本文中描述的方法产生或本文中描述的方法中使用的组合物中。该等试剂包括(但不限于)链霉环素(链霉素硫酸盐及四环素，例如10％)、克枯烂(Tecloftalam)(例如10％)、扑杀热(Probenazole)(例如6％或10％)、培丹盐酸盐(Cartap hydrochloride)、芳族烃、胍、二甲酰亚胺、2-胺基嘧啶、有机磷、苯并咪唑、甲酰胺、固醇生物合成抑制剂、抗卵菌纲、嗜球果伞素(strobilurin)、苯胺基嘧啶、苯基吡咯苯甲酰胺、喹诺酮及Bt杀虫毒素。

其他试剂，诸如失活成分(例如，防腐剂、载剂、溶剂及染料)亦可包括于组合物中。

用于本文中描述的方法中的台湾假单孢菌菌株可为具有寄存编号DSM 21245的菌株。菌株亦可为具有功能丧失rpoS突变的突变菌株。此类菌株可使用此项技术中已知的重组及/或基因技术产生。台湾假单孢菌rpoS的核酸序列(SEQ ID NO：3)及氨基酸序列(SEQID NO：4)展示如下：

ATGGCTCTCAGCAAAGAAGTGCCGGAGTTTGACATCGACGATGACCTCCTGTTGATGGAGACGGGCATCGTTTTGGAAACGGATGTGGTGTCAGACGAACCTGCTGTACCTTCGGTTCGGACCAAGGCCAAACAAGGCTCATCGCTCAAACAGCACAAGTACATCGATTACAGCCGGGCGCTCGACGCCACCCAGCTGTATCTCAACGAAATCGGCTTTTCTCCGCTGCTCTCCCCCGAAGAGGAAGTGCATTACGCACGCCTGTCGCAAAAAGGCGATCCGGCTGGCCGTAAGCGCATGATCGAGAGCAACCTGCGCCTGGTGGTCAAGATTGCGCGCCGCTACGTCAATCGTGGCCTGTCGCTACTCGACCTGATCGAAGAGGGCAACCTCGGTCTGATCCGCGCGGTAGAAAAGTTCGATCCGGAGCGCGGTTTCCGTTTCTCGACCTATGCGACCTGGTGGATTCGCCAGACCATCGAACGGGCGATCATGAACCAGACCCGCACCATCCGCCTGCCGATCCACGTGGTCAAGGAGCTCAACGTCTACCTGCGTGCCGCGCGGGAGCTGACCCAGAAGCTCGACCACGAGCCTTCCCCGGAAGAAATCGCCGCGCTTTTGGAAAAACCCGTGGCCGAGGTCAAGCGCATGCTTGGGCTCAACGAGCGTGTCTCTTCGGTGGACGTTTCTCTCGGCCCGGACTCCGACAAGACCCTGCTCGACACGCTGACGGACGATCGCCCGACCGACCCGTGCGAGCTGCTGCAGGACGACGACCTCTCCCAGAGCATCGACCAATGGCTGGGTGAGTTGACCGACAAGCAGCGTGAGGTGGTGGTGCGTCGGTTCGGCTTGCGGGGCCACGAAAGCAGCACCCTTGAGGATGTAGGCCTGGAAATCGGCCTGACCCGAGAGCGCGTGCGGCAGATCCAGGTCGAGGGGCTCAAGCGTCTACGTGAAATCCTTGAAAAGAACGGCCTCTCGAGTGAGTCGCTGTTCCAGTAA(SEQ ID NO：3)

MALSKEVPEFDIDDDLLLMETGIVLETDVVSDEPAVPSVRTKAKQGSSLKQHKYIDYSRALDATQLYLNEIGFSPLLSPEEEVHYARLSQKGDPAGRKRMIESNLRLVVKIARRYVNRGLSLLDLIEEGNLGLIRAVEKFDPERGFRFSTYATWWIRQTIERAIMNQTRTIRLPIHVVKELNVYLRAARELTQKLDHEPSPEEIAGLLEKPVAEVKRMLGLNERVSSVDVSLGPDSDKTLLDTLTDDRPTDPCELLQDDDLSQSIDQWLGELTDKQREVVVRRFGLRGHESSTLEDVGLEIGLTRERVRQIQVEGLKRLREILEKNGLSSESLFQ(SEQ ID NO：4)

上文所描述的组合物及方法中的任一者可用于抑制各种昆虫及微生物(例如，植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌)的生长。其亦可用于治疗由昆虫及微生物引起的疾病或减少其风险，例如由水稻黄单孢菌水稻致病变种引起的水稻细菌性枯叶病。举例而言，组合物可投与(例如，喷洒至)经感染或未感染标靶(例如，水稻植物)。

微生物包括(但不限于)水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xoo)、水稻黄单孢菌条斑致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)、多犯性植物炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)、龙舌兰炭疽病菌(Colletotrichum agaves)、埃尔氏炭疽病菌(Colletotrichumalcornii)、花生炭疽病菌(Colletotrichum arachidis)、巴氏炭疽病菌(Colletotrichumbaltimorense)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、尾状核炭疽病菌(Colletotrichum caudatum)、谷类炭疽病菌(Colletotrichum cereal)、马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes)、水葫芦炭疽病菌(Colletotrichum crassipes)、葱兰(Colletotrichum dematium)、代氏炭疽病菌(Colletotrichum derridis)、烟草炭疽病菌(Colletotrichum destructivum)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、棉黑斑炭疽病菌(Colletotrichum gossypii)、禾生炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)、菜心炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum)、咖啡炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)、亚麻炭疽病菌(Colletotrichum lini)、曼氏炭疽病菌(Colletotrichum mangenotii)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、黑刺盘孢菌(Colletotrichum nigrum)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、豌豆炭疽病菌(Colletotrichum pisi)、赛氏炭疽病菌(Colletotrichum somersetense)、柿树炭疽病菌(Colletotrichum sublineolum)、常春藤炭疽菌(Colletotrichum trichellum)、三叶草炭疽病菌(Colletotrichum trifolii)、大豆炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum viniferum)、结缕草炭疽病菌(Colletotrichum zoysiae)、贝壳杉类疫霉菌(Phytophthora taxon Agathis)、拟赤杨属疫霉菌(Phytophthora alni)、棉铃疫病霉菌(Phytophthora boehmeriae)、簇囊疫霉菌(Phytophthora botryose)、甘蓝蚜疫霉菌(Phytophthora brassicae)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、木豆疫霉菌(Phytophthora cajani)、受栗疫霉菌(Phytophthora cambivora)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)、柑橘疫病菌(Phytophthora citricola)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、克莱氏疫霉菌(Phytophthora clandestine)、芋疫霉菌(Phytophthora colocasiae)、隐地疫霉菌(Phytophthora cryptogea)、甜瓜疫霉菌(Phytophthora drechsleri)、迪瓦阿克曼疫霉菌(Phytophthora diwan ackerman)、马铃薯疫霉绯腐病菌(Phytophthoraerythroseptica)、草莓疫霉菌(Phytophthora fragariae)、草莓红心疫霉菌(Phytophthora fragariae var.rubi)、双子疫霉菌(Phytophthora Gemini)、格氏疫霉菌(Phytophthora glovera)、节水霉状疫霉菌(Phytophthora gonapodyides)、橡胶树疫霉菌(Phytophthora heveae)、冬生疫霉菌(Phytophthora hibernalis)、腐植疫霉菌(Phytophthora humicola)、海氏疫霉菌(Phytophthora hydropathical)、灌溉疫霉菌(Phytophthora irrigate)、越橘疫霉菌(Phytophthora idaei)、节杆疫霉菌(Phytophthora ilicis)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、膨胀疫霉菌(Phytophthora inflate)、红薯疫霉菌(Phytophthora ipomoeae)、依氏疫霉菌(Phytophthora iranica)、桂氏疫霉菌(Phytophthora katsurae)、雪松疫霉菌(Phytophthora lateralis)、苜蓿疫霉菌(Phytophthora medicaginis)、梅根氏疫霉菌(Phytophthora megakarya)、大豆疫病菌(Phytophthora megasperma)、瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)、紫茉莉疫霉菌(Phytophthora mirabilis)、兰花疫霉菌(Phytophthora multivesiculata)、山菅兰疫霉菌(Phytophthora nemorosa)、烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、潘尼氏疫霉菌(Phytophthora PaniaKara)、棕榈疫霉菌(Phytophthora palmivora)、菜豆疫霉菌(Phytophthora phaseoli)、松花疫霉菌(Phytophthora pini)、韭葱疫霉菌(Phytophthora porri)、夏栎疫霉菌(Phytophthoraplurivora)、樱草疫霉菌(Phytophthora primulae)、伪丁香疫霉疫霉菌(Phytophthorapseudosyringae)、花旗松疫霉菌(Phytophthora pseudotsugae)、栎疫霉菌(Phytophthoraquercina)、栎树猝死疫霉菌(Phytophthora ramorum)、甜橙疫霉菌(Phytophthorasinensis)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、丁香疫霉(Phytophthora syringae)、触角豆螺疫霉菌(Phytophthora tentaculata)、三叶草疫霉菌(Phytophthora trifolii)、豇豆疫霉菌(Phytophthora vignae)、钝角梨孢(Pyricularia angulate)、红树梨孢(Pyricularia apiculata)、沙茴香梨孢(Pyricularia borealis)、布氏梨孢(Pyriculariabuloloensis)、醋栗梨孢(Pyricularia caffra)、美人蕉生孢梨孢(Pyricularia cannae)、堪尼氏梨孢(Pyricularia cannicola)、阴地莎草梨孢(Pyricularia caricis)、鸭跖草梨孢(Pyricularia commelinicola)、闭鞘姜梨孢(Pyricularia costi)、科斯蒂纳梨孢(Pyricularia costina)、姜黄素梨孢(Pyricularia curcumae)、七岛兰梨孢(Pyriculariacyperi)、马薄荷梨孢(Pyricularia didyma)、大指草梨孢(Pyricularia digitariae)、代氏梨孢(Pyricularia distorta)、天山梨孢(Pyricularia dubiosa)、艾比氏梨孢(Pyricularia ebbelsii)、禾长蠕梨孢(Pyricularia echinochloae)、千金子梨孢(Pyricularia euphorbiae)、羽瑚梨孢(Pyricularia fusispora)、格鲁氏梨孢(Pyricularia globbae)、灰梨孢(Pyricularia grisea)、古氏梨孢(Pyriculariaguarumaicola)、棕扇尾莺梨孢(Pyricularia juncicola)、库氏梨孢(Pyriculariakookicola)、月桂梨孢(Pyricularia lauri)、李氏禾梨孢(Pyricularia leersiae)、马蹄包梨孢(Pyricularia longispora)、罗氏梨孢(Pyricularia lourinae)、地杨梅梨孢(Pyricularia luzulae)、西花梨孢(Pyricularia occidentalis)、椰子树梨孢(Pyricularia oncosperma)、稻热病菌、水生黍梨孢(Pyricularia panici-paludosi)、寄生霜梨孢(Pyricularia parasitica)、狼尾草梨孢(Pyricularia penniseti)、佩氏梨孢(Pyricularia peruamazonica)、似梨形梨孢(Pyricularia pyricularioides)、拉包尔志贺氏梨孢(Pyricularia rabaulensis)、虎尾兰梨孢(Pyricularia sansevieriae)、文字梨孢(Pyricularia scripta)、粟梨孢(Pyricularia setariae)、星砂梨孢(Pyriculariasphaerulata)、淹没梨孢(Pyricularia submerse)、亚斯格玛梨孢(Pyriculariasubsigmoidea)、梵氏梨孢(Pyricularia vandalurensis)、鱼腥藻梨孢(Pyriculariavariabilis)、生杨树梨孢(Pyricularia whetzelii)、姜拟梨孢(Pyriculariazingiberis)、角斑梨孢(Pyricularia zizaniicola)、合欢木丝核菌(Rhizoctoniabataticola)、胡萝菔丝核菌(Rhizoctonia carotae)、禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)、紫纹羽丝核菌(Rhizoctonia crocorum)、草莓丝核菌(Rhizoctoniafragariae)、斑叶兰丝核菌(Rhizoctonia goodyerae-repentis)、豆状丝核(Rhizoctonialeguminicola)、水稻丝核菌(Rhizoctoni oryzae)、小麦角菌根菌(Ceratorhizaramicola)、玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)、椰枣尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.albedinis)、芦笋茎尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.asparagi)、甘薯尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)、甜菜尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.betae)、大麻尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cannabis)、洋葱尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cepae)、鹰嘴豆尖镰孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.ciceris)、柑橘尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.citri)、咖啡尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.coffea)、香蕉尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)、荔枝尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.cyclaminis)、草尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.herbemontis)、瞿麦尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.dianthi)、莴苣尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.lactucae)、乳香黄连木尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.lentis)、亚麻尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.lini)、西红柿尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、苜蓿尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.medicaginis)、瓜类尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.melonis)、烟草尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.nicotianae)、西瓜尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、棕榈尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.palmarum)、西番莲尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.passiflorae)、菜豆尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.phaseoli)、豌豆尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.pisi)、西红柿根尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)、蓖麻蚕尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.ricini)、独脚金草尖镰孢菌(Fusariumoxysporum f.sp.strigae)、晚香玉尖镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.tuberosi)、郁金香尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.tulipae)、棉花尖镰孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)、阿尔莱葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)、阿根提葡萄球菌(Staphylococcus agnetis)、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌(Staphylococcusauricularis)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcuscaprae)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、腊肠葡萄球菌(Staphylococcuscaseolyticus)、色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、康氏葡萄球菌(Staphylococcus condiment)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)、德氏葡萄球菌(Staphylococcus devriesei)、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、猫葡萄球菌(Staphylococcus felis)、福氏葡萄球菌(Staphylococcus fleurettii)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人类葡萄球菌(Staphylococcushominis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(Staphylococcusintermedius)、克氏葡萄球菌(Staphylococcus kloosii)、李氏葡萄球菌(Staphylococcusleei)、缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)、里昂葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)、水獭葡萄球菌(Staphylococcus lutrae)、马赛葡萄球菌(Staphylococcus massiliensis)、田鼠葡萄球菌(Staphylococcus microti)、蝇葡萄球菌(Staphylococcus muscae)、尼泊尔葡萄球菌(Staphylococcus nepalensis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、佩氏葡萄球菌(Staphylococcus pettenkoferi)、鱼葡萄球菌(Staphylococcus piscifermentans)、假中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)、假里昂葡萄球菌(Staphylococcus pseudolugdunensis)、普氏葡萄球菌(Staphylococcus pulvereri)、猪鼻葡萄球菌(Staphylococcus rostri)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、斯盖氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、金猿葡萄球菌(Staphylococcus simiae)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、斯氏葡萄球菌(Staphylococcus stepanovicii)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、白色念珠菌、阿氏念珠菌(Candida ascalaphidarum)、安氏念珠菌(Candida amphixiae)、南极念珠菌(Candida Antarctica)、青葙念珠菌(Candida argentea)、大西洋念珠菌(Candidaatlantica)、大气念珠菌(Candida atmosphaerica)、布拉特念珠菌(Candida blattae)、菠萝念珠菌(Candida bromeliacearum)、卡氏念珠菌(Candida carpophila)、卡发氏念珠菌(Candida carvajalis)、天牛念珠菌(Candida cerambycidarum)、堪氏念珠菌(Candidachauliodes)、紫堇念珠菌(Candida corydalis)、多西氏念珠菌(Candida dosseyi)、都氏念珠菌(Candida dubliniensis)、埃氏念珠菌(Candida ergatensis)、果实念珠菌(Candida fructus)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、酦酵念珠菌(Candidafermentati)、高里氏念珠菌(Candida guilliermondii)、哈氏念珠菌属(Candidahaemulonii)、昆虫念珠菌(Candida insectamens)、因氏念珠菌(Candida insectorum)、媒介念珠菌(Candida intermedia)、杰夫氏念珠菌(Candida jeffresii)、克菲尔氏念珠菌(Candida kefyr)、科氏念珠菌(Candida keroseneae)、克鲁斯氏念珠菌(Candidakrusei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、里氏念珠菌属(Candida lyxosophila)、麦芽糖念珠菌(Candida maltose)、海生念珠菌(Candida marina)、酵母菌念珠菌(Candidamembranifaciens)、米氏念珠菌(Candida milleri)、橄榄念珠菌(Candida oleophila)、欧氏念珠菌(Candida oregonensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、橡树念珠菌(Candida quercitrusa)、皱褶念珠菌(Candida rugosa)、米酒念珠菌(Candida sake)、谢氏念珠菌(Candida shehatea)、忒氏念珠菌(Candida temnochilae)、留兰香念珠菌(Candida tenuis)、司氏念珠菌(Candida theae)、托氏念珠菌(Candida tolerans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、土屋念珠菌(Candida tsuchiyae)、赛诺氏念珠菌(Candidasinolaborantium)、霉菌念珠菌(Candida sojae)、亚哈氏念珠菌(Candida subhashii)、维斯氏念珠菌(Candida viswanathii)、高蛋白念珠菌(Candida utilis)及俄氏念珠菌(Candida ubatubensis)。

昆虫包括鳞翅目种的彼等昆虫，例如小菜蛾、甜菜夜蛾及粉纹夜蛾。

以下特定实例仅解释为例示性的，且不以任何方式限制本发明的其余部分。无需进一步详细描述，咸信熟习此项技术者可基于本文中的描述最大程度地利用本发明。本文中所引用的所有公开案均以全文引用的方式并入本文中。

实例1：来自台湾假单孢菌的萤绿素的VI型分泌系统介导的分泌物抑制水稻病原体水稻黄单孢菌水稻致病变种生长

由水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xoo)引起的水稻细菌性枯叶病为世界上最具破坏性的水稻疾病之一。吾人展示台湾假单孢菌显示针对Xoo的较强拮抗活性。使用MALDI-TOF成像质谱分析(MALDI-IMS)，吾人识别由可抑制Xoo生长的台湾假单孢菌分泌的萤绿素。经由台湾假单孢菌的Tn5突变诱发，吾人展示编码VI型分泌系统(T6SS)及萤绿素生物合成及成熟的组分的基因中的突变导致针对Xoo的毒性减小。吾人的资料证实萤绿素可经由T6SS分泌入培养基中，从而抑制Xoo生长。因此，吾人的数据不同于报导通过T6SS的效应子递送需要供体与受体的间的实体接触的研究。

通过全基因组突变诱发的相关基因的抗Xoo活性及识别

吾人测试若干假单孢菌物种以探索针对Xoo的潜在生物控制剂。当与富含养分的培养基(LB及1/2TSB)相比在铁有限培养基上生长时，台湾假单孢菌显示最高抗Xoo活性。在此等培养基中，台湾假单孢菌具有类似生长速率。与台湾假单孢菌对比，丁香假单孢菌(P.syringae)DC3000不展现针对Xoo的毒性。

为了识别影响针对Xoo的台湾假单孢菌拮抗活性的因子，吾人产生台湾假单孢菌的Tn5诱变库且筛选具有减弱的针对Xoo的拮抗活性的突变体。使用TAIL-PCR确定突变体的插入位点。在此等突变体中，吾人发现4个突变体的生长不受影响且其显示减弱的针对Xoo的拮抗活性。此等突变体在编码T6SS(clpV)、萤绿素合成酶(pvdL)、萤绿素移位及成熟(pvdE)及调节子(rpoS)的基因中具有插入位点。

ATP酶ClpV为T6SS装置的重要组分且有助于VipA/VipB小管重塑。参见Bonemann等人,EMBO J 28,315-325(2009)。PvdL为与萤绿素发色团的生物合成有关的肽合成酶。参见Mossialos等人,Mol Microbiol 45,1673-1685(2002)。PvdE为与萤绿素前驱物移位至周质有关的细胞膜蛋白。参见Ravel及Cornelis,Trends Microbiol 11,195-200(2003)。在铁有限LP培养液中，自4h(停滞期)至72h(死亡期)未侦测到野生型(WT)与突变菌株(ΔclpV及ΔpvdL)的间的显著生长差异。

在拮抗分析中，野生型台湾假单孢菌的整个培养物或无细胞培养物上清液展示针对Xoo的实质性毒性。相比而言，ΔclpV的整个培养物或无细胞上清液展示与WT相比的低毒性。ΔpvdL与ΔpvdE突变体均不展现对Xoo的毒性。

通过T6SS表征台湾假单孢菌萤绿素针对Xoo的毒性及其分泌物

吾人使用MALDI-IMS在琼脂盘表面上研究来自台湾假单孢菌的野生型及突变体的分泌代谢物，从而在琼脂盘表面上研究来自台湾假单孢菌的分泌代谢物及化合物。在盘中侦测到野生型台湾假单孢菌的m/z 1044信号，而ΔclpV中m/z 1044的含量远低于野生型中的含量。然而，在ΔpvdL及ΔpvdE周围未侦测到m/z 1044化合物，表明m/z 1044一种萤绿素类似物。

使用Cu-琼脂糖凝胶管柱纯化萤绿素，且通过MADLI-IMS检查。在HPLC分析中，通过UV侦测器监测在400nm处具有最强吸光率的荧光萤绿素。来自ΔclpV突变体培养物的上清液具有比野生型低的萤绿素浓度。使用LC-MS的定量展示野生型中的萤绿素含量比Δclp V突变体中约高2倍。吾人未在ΔpvdL及ΔpvdE突变体的培养物上清液中侦测到萤绿素。

若干研究已在绿脓假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholera)及泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)中表征T6SS介导的抗细菌活性。此等研究展示经由细胞-细胞接触抗细菌效应子蛋白经由T6SS直接注入标靶细胞中。在吾人的研究中，野生型台湾假单孢菌的培养物上清液显示比T6SS突变体ΔclpV较高的针对Xoo的毒性，表明抗Xoo化合物的T6SS介导的分泌不需要细胞-细胞接触。

为了验证clp V突变在台湾假单孢菌中影响T6SS活性，执行两个实验。首先，西方墨点分析(western blot analysis)用于定量无细胞培养物上清液中的VgrG蛋白含量，该蛋白质为针对T6SS活性的生物标记。结果展示VgrG可在野生型及补充clpV的菌株Δclp V/clpV的无细胞培养物上清液中侦测到。相比而言，未能在clpV突变体的培养物上清液中侦测到VgrG的显著含量。结果亦展示细胞溶解物中VgrG的含量在野生型、ΔclpV及ΔclpV/clp V之间类似。RNA聚合酶α次单元RpoA用作内参考物。此等结果证实clp V突变体在T6SS功能方面有缺陷，且将野生型clp V基因引入此突变体中可恢复T6SS功能。此等结果表明，在台湾假单孢菌中，T6SS通过将萤绿素分泌入培养基中与抗Xoo活性有关。其次，吾人通过将clp V基因的野生型复本引入Δclp V突变体中执行补充测试。在MALDI-IMS分析中，引入野生型clpV恢复萤绿素在培养物上清液中的分泌含量。数据表明ΔclpV突变体中萤绿素分泌减少由clpV基因座中的突变引起。

为了证实来自台湾假单孢菌的萤绿素的抗Xoo活性，通过CAS琼脂盘分析测试不同浓度的经纯化萤绿素。在CAS琼脂盘上，在1.2mg及1.5mg萤绿素反应时快速侦测CAS反应速率，其量测通过萤绿素自CAS染料的铁移除。证实萤绿素活性之后，测试针对Xoo的细胞生长抑制(IC₅₀)及致死剂量(LD₅₀)。针对Xoo的萤绿素的IC₅₀为约2.035mg/ml(R²＝0.9946)。LD₅₀为约1.98mg/ml(R²＝0.9775)。IC₅₀及LD₅₀资料展示萤绿素具有抗Xoo活性。

为了进一步阐明萤绿素在台湾假单孢菌针对Xoo的拮抗活性中的作用，富含铁的培养基用于检查萤绿素活性。当额外铁施用于含Xoo盘时，台湾假单孢菌的培养液展示毒性中剂量依赖性减小。在较高铁浓度(300μM、600μM及1000μM FeCl₃)下，台湾假单孢菌几乎对Xoo无拮抗活性。与对照(仅1/2TSB)相比，台湾假单孢菌生长不受添加铁影响。总之，结果表明萤绿素针对Xoo的拮抗活性经由铁竞争机制。吾人提出，当环境中铁量有限时，台湾假单孢菌通过将萤绿素分泌至螯合铁中有效竞争铁，且经由PvdRT-OpmQ溶解萤绿素-铁错合物，导致Xoo的迟延生长。然而，在较高铁浓度下，由台湾假单孢菌分泌的萤绿素不足以吸收所有可获得的铁，损害其抗Xoo活性。

识别台湾假单孢菌中萤绿素的结构、基因座及功能

使经纯化萤绿素(m/z 1044)经受串联质谱分析以识别氨基酸的一级结构及顺序。参见图1。氨基酸序列的顺序对应于NRPS腺苷酰化域特异性(Ser-Lys及Thr-Ser-OH-Orn)的预测子。此来自台湾假单孢菌的萤绿素与来自荧光假单孢菌(P.fluorescens)9AW及恶臭假单孢菌(P.putida)9BW的萤绿素一致。参见Budzikiewicz等人,Z.Naturforsch.Sect.C 52,721(1997)。

萤绿素含有具有不同氨基酸组成的可变肽侧链及保守荧光发色团。萤绿素侧链的肽在荧光假单孢菌物种中高度可变。萤绿素的生物合成及输送已在绿脓假单孢菌PAOl中经广泛研究。大部分萤绿素生物合成及输送基因在台湾假单孢菌与绿脓假单孢菌(P.aeruginosa)PAOl中形成丛群，而pvdL基因定位于两个物种的独立丛群中。参见图2。pvdL基因与所有假单孢菌中萤绿素前驱物的保守荧光发色团的合成有关。pvdL、pvdJ及pvdD的同源物与萤绿素的肽主链的生物合成有关。萤绿素前驱物通过PvdE转移入细胞质的周质空间中，PvdE为内部膜输送体，且随后通过PvdA、Q、N、M、O及P加工为成熟萤绿素。PvdA为催化Om羟基化的膜结合L-鸟胺酸(Om)N^δ-加氧酶。成熟之后，荧光萤绿素分泌入细胞外环境中。PvdM、pvdN、pvdO、pvdA及pvdE基因在台湾假单孢菌中丛群在一起。

syrP基因(其编码萤绿素生物合成调节性蛋白)存在于台湾假单孢菌中pvdl的下游。相比而言，syrP基因定位于丁香假单孢菌DC3000、恶臭假单孢菌KT2440及荧光假单孢菌Pf0-1中pvd基因丛群的中间。SyrP蛋白在Asp的羟基化中起作用，且与丁香霉素(syringomycin E)产生有关，其通过NRPS合成。然而，syrP的同源未在绿脓假单孢菌PAO1中识别。

表征T6SS在萤绿素分泌中的作用

为了表征T6SS在萤绿素分泌中的作用，吾人使用IMS定量在clp V突变体及野生型的培养物中分泌的萤绿素。在铁有限条件下，在时程实验中培育12h之后发现萤绿素(m/z1044.44)在台湾假单孢菌群落周围。在16h时，琼脂盘表面上clpV突变体中萤绿素的量远低于野生型的量。然而，亦在clpV突变体的琼脂盘上侦测到萤绿素。此由于萤绿素在长时间培育后积聚于培养基中，甚至在野生型及clpV突变体中。琼脂盘的横截面IMS展示，36h培育之后由clp V突变体分泌的萤绿素的量低于野生型的量。另一方面，IMS资料展示萤绿素不受Xoo刺激。

为了进一步评估T6SS与萤绿素分泌有关，吾人定量野生型及具有缺陷性抗Xoo活性的三种突变体的细胞外上清液、周质及细胞质中的成熟萤绿素(荧光萤绿素)。参见图3a。在野生型与Δclp V中，萤绿素的量在细胞外上清液中最高，在周质中低得多且未在细胞质中能侦测到。参见图3a。当详细比较时，ΔclpV突变体的细胞外上清液中发现的萤绿素比野生型的萤绿素少(左图，图3a)。相比而言，与野生型相比，Δclp V突变体在周质中积聚略微更多成熟萤绿素(中间图，图3a)。未在ΔpvdL及ΔpvdE的亚细胞部分中的任一者中侦测到显著数量的萤绿素。资料亦证实，PvdL及PvdE与萤绿素的生物合成及成熟有关。综合而言，此等结果表明ΔclpV突变不影响细胞内萤绿素产生，但的确影响萤绿素自周质移位至培养基。

图3b中展示在台湾假单孢菌中的萤绿素输送的示意图。

通过RpoS的萤绿素表达的阴性对照

生长停滞期δ因子(RpoS)为全局应激反应调节子。吾人识别在铁有限培养基中展现增加的萤绿素产生的rpoS台湾假单孢菌突变体。3天烧瓶培育之后，与野生型中的淡绿色相比，rpoS突变菌株的培育在铁有限培养基下展现深绿色，且rpoS突变体不影响细胞生长。此可能因为荧光颜料萤绿素的量在培养基中积聚而展现深绿色。在拮抗分析中，与野生型相比，rpoS突变体展示对Xoo的较大抑制区。IMS资料展示，rpoS突变体比野生型分泌更多萤绿素。萤绿素的定量展示，rpoS突变体在铁有限上清液中产生比野生型高2-3倍的萤绿素浓度。此等结果表明台湾假单孢菌中萤绿素产生受RpoS的负调节。

材料及方法

(1)微生物及拮抗分析

自土壤分离台湾假单孢菌新种CMS^T(＝BCRC17751^T＝DSM 21245^T)，且使用表现型及分子分类学方法表征。参见Wang,L.T.等人,International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology 60,2094-2098(2009)。在台湾台中，自水稻细菌性枯叶病分离水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xoo)XF89b菌株。由台湾大学植物生物学研究所(Institute of Plant Biology,National Taiwan University)的Laurent Zimmerli提供丁香假单孢菌变种西红柿(Pst DC3000)。

在28℃下，在1/2胰蛋白酶大豆琼脂(TSB)琼脂盘(BD Biosciences)上测试台湾假单孢菌针对水稻细菌性枯叶病水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xoo)的拮抗活性。使台湾假单孢菌预先培养物在铁有限培养基(补充有1％酪蛋白氨基酸、1mM MgSO₄及0.5％甘油的M9基本培养基)中生长，且在28℃及200rpm下将其培育入含100ml培养基的500ml烧瓶中持续24h。Xoo预先培养物在28℃下在1/2TSB培养基中生长3天。混合Xoo与熔融1/2琼脂培养基，随后倾倒入空盘中。对于生物分析，将台湾假单孢菌(10⁹CFU/ml)或过滤(0.22μm)上清液注入Xoo混合LB琼脂盘的孔中直至抑制区经表征。

(2)通过LC/MS比较萤绿素(m/z 1044)含量

培育1天之后，通过在4500g下离心10min收集培养物上清液。经由0.22μm过滤器使培养物上清液灭菌。通过冷冻干燥来干燥10mL等分的各过滤上清液，且使其再悬浮于50％甲醇中。通过高解析液相层析-质谱分析(LC/MS)(ESI-Orbitrap，由Metabolomics CoreFacility,Academia Sinica,Taiwan执行)侦测代谢物的总数。测定峰值高度及面积以用于计算LC/MS分析中的萤绿素含量。

(3)建构转座子库

EZ-Tn5转座子突变诱发套组(KAN-2；Epicentre)用于制造无规突变体库。根据制造商的说明书执行EZ-Tn5转座子突变诱发。根据Choi等人(JMicrobiol Methods 64:391-397,2006)中概述的方法制备台湾假单孢菌胜任细胞。为了筛选Tn5突变体库，吾人采用台湾假单孢菌突变诱发库与Xoo一起培育，提供了发现毒性相关基因的机会。通过TAIL-PCR扩增插入位点的侧接序列。由Sun等人(FEMS Microbiol Lett,226:145-150,2003)设计两组无规引子及转座子引子的两端特异性区域。通过PCR及定序进一步测定此研究的Tn5突变菌株。通过UV光测定突变菌株(clpV、pvdL、pvdE)。将台湾假单孢菌clpV、pvdL及pvdE的核苷酸序列提交至Genbank数据库，寄存编号分别为KM061430、KM036007及KM036029。最后，吾人使用南方墨点分析(Southern blot analysis)检查Tn5插入突变体插入数目。通过具有DIG标记PCR探针的南方墨点杂交来分析Tn5插入突变体的NcoI消化基因组DNA及EagI消化基因组DNA。具有康微素抗性基因的探针的南方分析用于证实插入数目。杂交之后，使用侦测套组(Roche)使得南方墨点显色。

为了监视clpV的下游基因表达，吾人通过RT-PCR侦测WT及clpV突变体中的PT3445及yhfE基因表达。结果展示，clpV突变不影响下游基因表达。clp V突变体由广泛宿主范围载体pCPP30表达补充。通过添加最终1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至铁有限培养基中隔夜诱发含有clpV片段的pCPP30。

(4)分泌T6SS组分

使用抗根癌农杆菌(anti-Agrobacterium tumefaciens)VgrG抗体，在培养物上清液中通过西方墨点法侦测VgrG以确保T6SS活性。使用抗根癌农杆菌RpoA抗体侦测RNA聚合酶a-次单元RpoA，其用作西方墨点中的内参考物。两种抗VgrG及抗RpoA抗体由Instituteof Plant and Microbial Biology,Academia Sinica,Taiwan的Dr.Erh-Min Lai提供。在铁有限培养基中培养台湾假单孢菌野生型及clpV突变体二十四小时，在600nm下(00600)生长至约0.8的光学密度。在4500g下离心10min之后，经由0.22μm Durapore聚偏二氟乙烯(PVDF)(最低蛋白结合)针筒过滤器使培养物上清液灭菌。在4℃下通过添加三氯乙酸(TCA)至最终10％TCA浓度隔夜使无细胞培养物上清液蛋白(20ml)沈淀，且用冰冷丙酮洗涤集结粒两次以移除残余TCA。使TCA沈淀分泌蛋白溶解于9.8M尿素溶液中。

(5)MALDI-IMS

通过MALDI-IMS比较代谢物在竞争琼脂盘表面上的分布显示台湾假单孢菌的野生型及突变体分泌的离子中的令人感兴趣的差异。切除细菌群落的关注区且将其置放于玻璃载玻片上。使用50μm筛网，用具有沈积于样本上的通用MALDI基质(Sigma-Aldrich)的薄层覆盖具有令人感兴趣的靶向样本的载玻片。在IMS之前，在37℃下在培育箱中使基质覆盖琼脂样本脱水隔夜。通过Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF/TOF MS分析样本且收集数据。以正极反射型离子模式分析样本，在200μm雷射间隔下筛选，其中获取质量范围设定为100Da至2000Da。使用标准肽校准混合物(肽校正标准206195，Bruker，1000Da至3200Da)及基质校准设备。使用Fleximaging 3.0软件(Bruker)分析IMS数据。分子强度呈现为梯度颜色。

(6)萤绿素的纯化及测定

自Yin等人(Biosensors&bioelectronics 51,90-96(2014))修改萤绿素纯化方法。在28℃及200rpm下，在铁有限培养基中培育于250ml烧瓶的50ml台湾假单孢菌24h。通过在4℃下在4,600g下离心15min收集培养物上清液，且经由0.22μm无菌低蛋白结合聚偏二氟乙烯(PVDF)膜滤器(Millex-GV；Millipore)过滤。螯合Cu-琼脂糖凝胶管柱用于纯化萤绿素。铜离子(Cu²⁺)用于自Ni-琼脂糖高效能(GE)再装填琼脂糖。将5ml Ni-琼脂糖装载于0.8×4cm Poly-Prep层析管柱(Bio-Rad)中，且通过重力法允许缓冲液流经。为了移除残余Ni^{2 +}，用5管柱体积缓冲液(0.02M Na₂HPO₄、0.5M NaCl及0.05M EDTA；pH 7.2)洗涤Ni-琼脂糖凝胶管柱。随后，通过至少5管柱体积蒸馏水洗涤管柱以移除残余EDTA，且用0.5ml 1M CuSO₄再装填琼脂糖。因此，用5管柱体积结合缓冲液(0.02M Na₂HPO₄、1M NaCl；pH 7.2)洗涤Cu-琼脂糖。

以1:1的比率混合过滤培养物上清液与结合缓冲液。在Cu-琼脂糖凝胶管柱中将20ml混合物装载至经纯化萤绿素或其他噬铁素中。用5管柱体积结合缓冲液再次洗涤管柱。最后，通过溶离缓冲液(0.02M Na₂HPO₄及1M NH₄Cl；pH 7.2)溶离噬铁素且通过冷冻干燥器干燥。通过具有RP-酰胺C16管柱(4.6×250mm，5μm；Sigma-Aldrich)的HPLC分析及MALDI-TOF MS检查经纯化化合物。荧光萤绿素的吸收最大值波长在407nm至412nm内显而易见。此处，通过UV吸收侦测器在200nm至500nm范围内监测HPLC的层析。HPLC流动相的乙腈-水梯度为以1ml/min流速在10min内自50％至0％乙腈。每分钟收集溶离份且通过MALDI-TOF侦测。为了识别结构特征，通过ESI-Orbitrap(Academia Sinica的代谢组研究核心)测定m/z1044峰值。

(7)抑制浓度(IC₅₀)及致死剂量(LD₅₀)分析

使经纯化萤绿素溶解于1/2TSB中且通过0.22过滤器灭菌。将5.5mg/ml至0mg/ml的含纯萤绿素的1/2TSB培养基置放于含2ml 1/2TSB的管中。为了研究萤绿素对Xoo生长的影响，在28℃及200rpm下培育两晚之后，分析600nm处下的吸光率及活细胞数目(cfu/ml)。三次执行分析且获得一致结果。

(8)CAS盘分析

铬奥醇S(CAS)为侦测铁移动的通用方法，其分析噬铁素产生。为了制备100ml CAS染料，使60.5mg CAS粉末(Sigma)溶解于50ml蒸馏水中，且与10ml 1mM铁溶液(无水FeCl₃，Alfa Aesar)混合。随后，将40ml 72.9mg HDTMA(Sigma)缓慢添加至含FeCl₃的60ml CAS溶液中，且高压处理以灭菌。CAS冷却可手持之后，混合十分之一CAS溶液与LP琼脂培养基且立即倾入盘中。

CAS盘用于证实经纯化萤绿素活性。将不同浓度经纯化萤绿素注入CAS盘的孔(5mm)中。在28℃下培育盘6h或直至出现黄晕。

(9)定量亚细胞萤绿素

在铁有限培养基中生长14h之后，自台湾假单孢菌的无细胞培养物上清液定量细胞外成熟萤绿素。通过离心(6,000×g，3min)收集培养物上清液且通过0.22μm孔径过滤器过滤。为了分离周质与胞溶质部分，根据Imperi等人(Proteomics 9:1901-1915,2009)中概述的方法获得球形质粒。在PBS缓冲液(pH 7.4)中洗涤细胞集结粒(3×10⁹细胞)三次。使细胞集结粒悬浮于1mL球形质粒缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，200mM MgCh，0.5mg/mL溶菌酶)中且在室温下伴随温和振荡培育30min。培育之后，通过离心(11,000×g，15min，4℃)收集周质部分。在PBS缓冲液(pH 7.4)中洗涤球形质粒三次。使集结粒悬浮于1mL音波处理缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl)中且通过音波处理溶解。离心(16,000×g，5min)之后，移除细胞残渣以获得细胞质部分。使用适当稀释的稀释缓冲液(100mM Tris-HCl)，使用具有405nm/460nm的激发/发射波长的荧光盘读取器(Victor 2，Perkin-Elmer)，测定成熟荧光萤绿素。针对细胞光学密度(OD600)标准化萤绿素值。

实例2：通过台湾假单孢菌处理Xoo感染水稻叶

山茶水稻栽培品种Tainung 67(稻L.)用于盆栽实验。吾人通过剪刀夹方法，用Xoo感染6周龄植物的叶子。感染之后，立即将台湾假单孢菌培养物上清液或台湾假单孢菌培养物喷洒至植物。第一次喷洒之后，在两周时间段期间再喷洒植物三次。感染三周之后，经处理叶子比未经处理的对照叶子显著更健康，该等未经处理的对照叶子为干燥及黄色的。

实例3：台湾假单孢菌的杀虫活性

吾人发现台湾假单孢菌为广泛宿主范围的昆虫病原细菌，其展现对农业害虫小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、粉纹夜蛾及黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的杀虫活性。不同浓度(OD＝0.5至2)野生型台湾假单孢菌的经口感染产生无显著差异的昆虫死亡率(92.7％、96.4％及94.5％)。TccC蛋白(毒素复合物(Tc)的组分)在台湾假单孢菌的杀虫活性中发挥基本作用。台湾假单孢菌的ΔtccC突变菌株(其在TccC基因中具有基因剔除突变)甚至在高细菌剂量(OD＝2.0)下仅诱发42.2％的小菜蛾死亡率。TccC蛋白断裂成两个片段，含有Rhs样域的N端片段及含有Glt同向转运体域及TraT域的C端片段，其可能分别有助于针对巨噬细胞的抗氧化应激活性及防御。令人感兴趣地，台湾假单孢菌中TccC的C端区的一级结构在病原体中独特。通过流动式细胞量测术证明TccC的C端片段的膜定位。台湾假单孢菌ΔtccC菌株的音波处理集结粒针对Sf9昆虫细胞株及小菜蛾幼虫的毒性比野生型低。吾人亦发现受台湾假单孢菌感染的Sf9及LD652Y-5d细胞株诱发凋亡细胞死亡。此外，通过台湾假单孢菌的天然经口感染触发宿主程序性细胞死亡相关基因JNK-2及卡斯蛋白酶-3的表达。

台湾假单孢菌的TccC对小菜蛾的杀虫活性

在先前研究中，来自台湾假单孢菌的TccC基因在大肠杆菌(E.coli)中过度表达，且重组TccC能够增加果蝇幼虫的死亡率。参见Liu等人,Journal ofAgricultural andFood Chemistry 58:12343-12349(2010)。除黑腹果蝇之外，吾人发现台湾假单孢菌针对多种鳞翅目物种具有杀虫活性，包括若干植物害虫小菜蛾、甜菜夜蛾及粉纹夜蛾。

吾人研究台湾假单孢菌TccC针对鳞翅目物种小菜蛾的活体内杀虫活性。当细菌细胞达至生长停滞期(24h)时，TccC在台湾假单孢菌中的表达量最高(图4A)。因此，吾人收集此阶段的台湾假单孢菌细胞且测定其毒性。向小菜蛾幼虫经口投与台湾假单孢菌细胞。处理组中的幼虫展现较慢生长，且与对照组中的幼虫相比为黑化、脱水且硬质的(图4B)。

吾人比较来自不同病原体的若干TccC样蛋白的氨基酸序列，且发现其全部均具有N端保守RhsA样域及C端高变片段。令人感兴趣地，台湾假单孢菌的TccC在C端区中具有独特钠/麸胺酸同向转运体样域及TraT样域。为了评估TccC蛋白的功能，吾人产生台湾假单孢菌的同基因tccC基因的基因剔除突变体，命名为ΔtccC。表1展示通过野生型或ΔtccC台湾假单孢菌的全细胞或不同细胞部分经口投与的小菜蛾幼虫的死亡率。经台湾假单孢菌ΔtccC菌株(OD＝2.0)感染的小菜蛾幼虫死亡率仅为42.4％，而经野生型台湾假单孢菌感染的小菜蛾幼虫死亡率为94.5％(表1)。

表1

^a给三龄期的健康幼虫喂台湾假单孢菌野生型、ΔtccC突变菌株及其各种蛋白部分。

^b死亡率为幼虫死亡百分比。n为处理组的样本大小。资料在第5天收集。

^c双尾斯登氏t-测试用于阐明统计显著性。各处理重复三次。

^d类似于b，n为阴性对照PBS处理组的样本大小。

^e摄入剂量：50μl OD＝0.5、1、2个细胞/0.5*1cm²植物块。

^f摄入剂量：粗提取物含有300ng蛋白。

吾人进一步制备台湾假单孢菌的不同细胞部分，且测试其对小菜蛾幼虫的影响。大于50％的经野生型台湾假单孢菌的细胞溶解物、不溶性溶解物(细胞膜及细胞壁集结粒)及细胞外上清液感染的小菜蛾幼虫在5天喂饲期结束时死亡(表1)。另外，经台湾假单孢菌ΔtccC的细胞溶解物及不溶性集结粒感染的小菜蛾幼虫的死亡率低于经野生型溶解物感染的小菜蛾幼虫的死亡率(表1)。此等结果表明台湾假单孢菌的杀虫活性可能至少部分归因于TccC。

用毒素、细菌或病毒感染鳞翅目幼虫导致受损肠上皮细胞中出现顶部突起及突起破裂。因此，吾人执行组织学分析来评定台湾假单孢菌感染对小菜蛾的肠道的影响。小菜蛾幼虫的中肠超威结构展示经口感染台湾假单孢菌对肠细胞具有强烈影响。感染台湾假单孢菌48h之后，诱发小菜蛾肠中的肠上皮细胞的顶部突起、异常微绒毛及细胞溶解，表明台湾假单孢菌感染对中肠上皮细胞导致严重损伤，其在体内恒定过程中无法修复且最终导致宿主死亡。类似地，摄入100ng毒素复合物(Tc)/cm²食物的小菜蛾幼虫的超威结构切片在含诸多囊泡样结构的肠中展示柱状细胞。相比而言，摄入ΔtccC突变体仅展示异常微绒毛而无任何顶部突起或细胞溶解。

对肠的损伤可诱发干细胞增殖且分化而替代受损细胞，产生大量形状比对照组大的杯状细胞。吾人观察到，与非感染或野生型台湾假单孢菌感染小菜蛾相比，经台湾假单孢菌ΔtccC经口感染的小菜蛾在中肠系统中产生大量杯状细胞，表明仅ΔtccC的感染而非野生型可诱发中肠系统中受损细胞的分化及诸多杯状物的形成。此表明台湾假单孢菌ΔtccC的毒性低于野生型菌株的毒性，且中肠上皮细胞可在过程中修复。

细菌定量及组织学检查进一步证实台湾假单孢菌对小菜蛾的中肠上皮细胞的定殖及侵入。经口感染48h的后，台湾假单孢菌ΔtccC的细菌计数低于小菜蛾中肠中野生型菌株的细菌计数。另外，经口感染48h之后，中肠上皮细胞受野生型台湾假单孢菌严重破坏。

通过用不同台湾假单孢菌细胞部分处理Sf9昆虫细胞进一步证实TccC的杀虫活性。参见图5。暴露于野生型台湾假单孢菌的完整细胞(活台湾假单孢菌)、细胞溶解物(总蛋白)、可溶性溶解物(胞溶质蛋白)及不溶性溶解物(细胞壁及细胞膜)的Sf9昆虫细胞的存活率显著低于暴露于PBS缓冲液的Sf9昆虫细胞存活率。另一方面，暴露于台湾假单孢菌ΔtccC的完整细胞或细胞壁集结粒的Sf9昆虫细胞的存活率与暴露于PBS缓冲液的Sf9昆虫细胞存活率无显著差异，仅暴露于台湾假单孢菌ΔtccC的细胞溶解物或可溶性溶解物的Sf9昆虫细胞存活率显著降低。由于台湾假单孢菌ΔtccC确实不表达TccC，因此一些其他毒性因子很可能存在于台湾假单孢菌ΔtccC的细胞溶解物中。此外，活性吞噬作用可见于Sf9活细胞中，活体内凋亡期间的特有现象，但在活体外培养物中不常见。Sf9细胞为吞噬细胞的且含有异常高数目的吞噬体，尤其在葡萄糖耗竭后。在早期感染阶段中(培育1h之后)，RFP标记台湾假单孢菌经Sf9细胞吞噬。培育3h之后，与非感染细胞不溶解相比，观察到经台湾假单孢菌感染的Sf9细胞的溶解。

通过台湾假单孢菌的TccC诱发凋亡细胞死亡

为了确定台湾假单孢菌感染在鳞翅目Sf-9及LD-5d细胞中是否诱发凋亡，吾人使用磷脂结合蛋白V-FITC染色使凋亡细胞及DAPI染色来测定总细胞数目。用台湾假单孢菌感染10h之后，在鳞翅目Sf-9及LD-5d细胞中侦测凋亡，且观察到比非感染对照中显著较高死亡率。此外，通过台湾假单孢菌感染触发小菜蛾幼虫的肠上皮细胞的JNK路径。除JNK路径之外，吾人亦检查卡斯蛋白酶基因的表达，其亦可诱发凋亡细胞死亡。经口感染台湾假单孢菌48h之后，中肠细胞中断裂卡斯蛋白酶-3的表达量增加。经台湾假单孢菌ΔtccC感染的小菜蛾幼虫中JNK-2及断裂卡斯蛋白酶-3的表达量低于台湾假单孢菌的野生型菌株中的表达量，表明TccC可能诱发凋亡且在小菜蛾幼虫肠上皮细胞的细胞死亡中发挥重要作用。

TccC对台湾假单孢菌的抗氧化活性的影响

通过完整肠上皮屏障及宿主免疫防御系统，保护健康昆虫的消化道以免细菌破坏。吾人分析台湾假单孢菌菌株的蛋白酶及抗氧化活性以评估其针对昆虫肠免疫系统的抗性。在细菌生长的生长停滞期，台湾假单孢菌分泌大量蛋白酶且展示高抗氧化活性。台湾假单孢菌ΔtccC的抗氧化活性显著低于野生型台湾假单孢菌的抗氧化活性，表明台湾假单孢菌的抗氧化活性可能受TccC直接或间接调节。

为了证实TccC与抗氧化活性有关，使野生型及ΔtccC台湾假单孢菌暴露于不同浓度的过氧化氢且测定细菌计数。结果展示野生型台湾假单孢菌的存活率比ΔtccC高，证实TccC在针对ROS的细菌细胞的保护中亦发挥作用。ROS在高浓度H₂O₂处理下诱发tccC突变体的较大损伤。台湾假单孢菌TccC蛋白在其C端中含有钠/麸胺酸同向转运体Glts样域，其可能用于麸胺酸输送。由于L-麸胺酸可转化成麸胱甘肽，因此TccC可能在针对ROS侵袭的防御中发挥作用，且维持台湾假单孢菌中的细胞内氧化还原电位。吾人随后测定台湾假单孢菌是否具有降解过氧化氢(H₂O₂)的能力。吾人发现1mMH₂O₂在用野生型台湾假单孢菌培育2min的后快速降解。相比而言，当用tccC突变体培育时，花费15min完全分解。总之，吾人的结果表明，野生型台湾假单孢菌具有较高H₂O₂解毒活性，且因此可比tccC突变体更有效地保护自身免受由宿主免疫反应产生的ROS侵袭。

TccC的抗噬菌活性

为了评估TccC的抗噬菌活性，吾人执行吞噬作用分析，其中野生型及ΔtccC台湾假单孢菌细胞荧光标记有CFSE，且随后与小鼠巨噬细胞一起培育。与荧光标记台湾假单孢菌ΔtccC一起培育30min的巨噬细胞展示峰值位置朝向较高荧光强度的位移，表明经吞噬ΔtccC的量大于经吞噬野生型台湾假单孢菌的量。为了证明散布图分析的研究成果，计算经吞噬台湾假单孢菌的百分比。与ΔtccC细胞相比，小鼠巨噬细胞吞噬更少野生型细胞，表明野生型台湾假单孢菌具有抗吞噬活性，其可部分归因于TccC。吾人亦分析台湾假单孢菌野生型及ΔtccC对小鼠巨噬细胞的细胞毒性，且发现小鼠巨噬细胞的存活率在野生型存在下与在ΔtccC存在下不同，表明台湾假单孢菌对小鼠巨噬细胞不具有细胞毒素作用。

TccC活体内处理及位置

基于Pfam域预测，预测TccC具有RhsA域(11-673)、Rhs重复相关核心(600-680)、钠/麸胺酸同向转运体样(726-825)及TraT补充抗性样域(736-781)。另外，预测C端区三个跨膜区(718-742、744-758、760-778)。执行西方墨点法分析以测定TccC蛋白在台湾假单孢菌中的亚细胞定位。根据图6中概述方法制备三个细胞部分。出人意料地，在总细胞蛋白部分中侦测到两个蛋白带(约70KD及约40KD带)，表示TccC蛋白的处理形式。在可溶性蛋白部分中，仅侦测到约70kD带，而在含有细胞壁及膜蛋白的不溶性集结粒部分中，仅侦测到经处理约40kD带。此表明当插入台湾假单孢菌细胞膜中时，TccC蛋白经处理。

吾人已观察到，重组TccC蛋白亦在大肠杆菌表达系统中经类似处理。为了进一步表征断裂过程，将具有6×His-标记物的TccC选殖入广泛宿主范围载体pCPP30中且其在台湾假单孢菌及大肠杆菌(BL21)中过度表达。使用镍离子管柱纯化标记His的TccC蛋白。西方墨点分析展示具有类似分子量的TccC蛋白的处理形式自大肠杆菌与台湾假单孢菌经纯化。此结果表明，TccC在大肠杆菌与台湾假单孢菌中具有类似断裂位点。

为了测试TccC是否真正整合入细胞膜中，用FITC标记TccC以通过TccC-FITC抗体染色来追踪外膜部分。流动式细胞量测术分析展示，台湾假单孢菌的细胞表面上的TccC荧光信号比非染色对照具有显著较高密度。相比而言，在tccC突变体中未侦测到显著荧光密度。

材料及方法

(1)细菌菌株、培养条件及抗生素

台湾假单孢菌BCRC 17751用作昆虫病原物种。大肠杆菌DH5α用于所有建构实验。大肠杆菌S17-1用于与台湾假单孢菌的两亲配对，且大肠杆菌BL21用于表达重组蛋白。台湾假单孢菌及大肠杆菌在鲁利亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani；LB)培养液中或琼脂盘上生长。台湾假单孢菌培养物在30℃下生长且大肠杆菌培养物在37℃下生长。抗生素在以下浓度下施用：立复霉素(rifampicin)(34μg/ml)、安比西林(ampicillin)(100μg/ml)及大观霉素(spectinomycin)(100μg/ml)用于台湾假单孢菌野生型经培养的培养基；及康微素(kanamycin)(30μg/ml)、四环素(20μg/ml)分别用于台湾假单孢菌突变菌株及过度表达菌株；康微素(50μg/ml)、安比西林(100μg/ml)及四环素(20μg/ml)用于大肠杆菌菌株。

(2)细胞培养

鳞翅目昆虫草地黏虫Sf9细胞株与舞毒蛾(Lymantria dispar)IPLB LD-652Y-5d细胞株由Dr.C.H.Wang(台湾大学昆虫学系(Department of Entomology,National TaiwanUniversity))提供。自IPLB LD-652Y[47]次选殖舞毒蛾(gypsy moth/Lymantria dispar)细胞株IPLB LD-652Y-5d。其在27℃下在补充有10％胎牛血清(FBS)及1％青霉素/链霉素/麸酰胺酸(PSG)(Invitrogen)的Sf-900 II SFM(Gibco)培养基中生长。

(3)台湾假单孢菌ΔtccC基因剔除突变体的建构

通过含有插入的康微素抗性盒的tccC片段的自杀载体pEX100T的双重再组合来建构命名为ΔtccC的台湾假单孢菌的tccC(GenBank数据库寄存编号HQ260745)基因剔除突变体。通过将1345-bp康微素抗性盒插入含有tccC编码序列的852-bp片段中来产生tccC-kan-tccC片段。将tccC-kan-tccC片段选殖入pEX100T自杀载体中，且随后转型至大肠杆菌S17-1中，从而与野生型台湾假单孢菌结合。在含有5％蔗糖、30μg/ml康微素、34μg/ml立复霉素及100μg/ml大观霉素的LB盘上选择双重再组合tccC突变菌株。通过PCR及定序来证实所得ΔtccC突变体。

(3)感染实验及有效蛋白部分的生物分析

通过天然经口感染执行幼虫的细菌感染的生物分析。使台湾假单孢菌生长24小时至生长停滞期且收集。随后，在5ml PBS(pH 7.4)中洗涤细胞集结粒三次且使其再悬浮于PBS中，调节至不同浓度(OD)。将不同浓度细菌(50μl)施加至0.5×1cm²植物块表面，该等植物块用于喂植物娥小菜蛾的幼虫且在25℃下培育。经口感染之后，在第5天观察各经感染幼虫且计算死亡率。健康第三龄期小菜蛾幼虫由台湾农业化学物质及有毒物质研究研究所(Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute)提供。为了测定导致小菜蛾死亡的蛋白部分，培养台湾假单孢菌24小时。通过离心(在4,600g，4℃下15min)收获细胞培养物，且单独收集上清液及细胞集结粒。对于培养物上清液，经由0.22μm PVDF过滤器(Millipore)过滤分泌蛋白且使用Vivaspin 20浓缩器(10kDa MWCO，GEHealthcare)浓缩。用PBS洗涤收获细胞集结粒两次，且使其再悬浮于含蛋白酶抑制剂的PBS中且通过音波处理溶解(细胞溶解物)。通过离心(在26,000g，4℃下30min)将细胞溶解物分离成不溶性溶解物及可溶性溶解物，且通过0.22μm PVDF过滤器过滤可溶性溶解物。用PBS洗涤不溶性溶解物两次且使其再悬浮于PBS中。对于来自台湾假单孢菌的蛋白部分的毒性分析，溶解于10μl PBS中的300ng蛋白用于昆虫幼虫处理。通过Pierce 660nm蛋白分析法(Pierce)定量蛋白质提取物。

(4)细胞存活分析

为了研究台湾假单孢菌对昆虫细胞的影响，通过比色XTT分析测定草地黏虫Sf9细胞的增殖。对于细胞毒性分析，以5,000个/孔将Sf9细胞接种于补充有10μg/ml台湾假单孢菌的各种部分蛋白的96孔培养盘中，或在无抗生素培养基中每细胞添加1000Pt感染倍率(MOI)。处理72h之后，通过细胞增殖分析套组(XTT)(Biological Industries)定量细胞增殖。

(5)凋亡分析

通过磷脂结合蛋白V-FITC分析侦测细胞早期凋亡。通过计数在荧光显微镜下可见的磷脂结合蛋白V阳性细胞测定人类或昆虫细胞的凋亡百分比。在24孔盘的孔上，以10μg/ml用台湾假单孢菌的蛋白部分或台湾假单孢菌(MOI＝1000)培育细胞(5,000个细胞/孔)72h。处理72h之后，在PBS中洗涤细胞两次，且根据制造商的说明书使用ApoAlert磷脂结合蛋白V-FITC套组(BD)侦测。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐(DAPI)染色细胞核中的DNA 5min。最终，在PBS中洗涤染色细胞两次，用4％多聚甲醛固定10分钟且随后在荧光显微镜(Zeiss Axiovert 100M,Carl Zeiss,Germany)下观察。计数磷脂结合蛋白V阳性细胞且识别为台湾假单孢菌诱发早期凋亡细胞。

(6)切片及HE、革兰氏、免疫组织化学染色

细菌经口感染48h之后，在10％缓冲福尔马林(pH 7.0)中固定第三龄期幼虫至少48h。固定之后，将幼虫递送至台湾大学病理部实验室以用于切片。通过苏木精-伊红、革兰氏(Gram's)或免疫组织化学染色分析组织切片。使用抗JNK-2[N1C3](GTX105523，Genetex；与家蚕(Bombyx mori，NP_001103396)的c-Jun NH2封端激酶80％[276/398]序列一致性)及抗卡斯蛋白酶-3p17(GTX123678，Genetex；与家蚕(AAW79564)的卡斯蛋白酶36％[46/129]序列一致性)抗体执行免疫组织化学(IHC)染色，之后用二胺基联苯胺(DAB)显色且用来自台湾大学医院实验动物中心(Laboratory AnimalCenter of National TaiwanUniversity Hospital)的苏木精对比染色。

(7)纯化TccC

将全长TccC-His₆融合片段选殖入广泛宿主范围Pcpp30载体中且转型至大肠杆菌(BL21)及台湾假单孢菌中。台湾假单孢菌及大肠杆菌生长至生长停滞期(24h)之后，通过His SpinTrap管柱(GE Healthcare)纯化过度表达的TccC-His₆融合蛋白，且通过使用抗TccC抗体的西方墨点法显示结果。

(8)分析TccC位置

对于SDS PAGE，使来自台湾假单孢菌的20μg不同细胞部分蛋白质溶解于含SDS的加样缓冲液中，且随后施用于凝胶电泳。电泳之后，以40mA将蛋白质转移至硝化纤维膜历时12h。使用针对自大肠杆菌BL21表达纯化的台湾假单孢菌TccC全长重组蛋白产生的兔多株抗体，用特异性抗TccC抗体侦测TccC。一级抗体结合之后，用辣根过氧化酶偶合的抗兔二级抗体结合及化学发光侦测试剂(Pierce)使颜色显色。

流动式细胞量测术用于测定TccC的膜定位。使台湾假单孢菌的野生型及ΔTccC突变菌株生长隔夜且在生长停滞期(24h)收集。调节培养物10⁹CFU/ml，且随后离心100l经调节细菌，从而收集集结粒。在4℃下用PBS洗涤细菌集结粒三次且其再悬浮于含1％BSA的200μl PBS中。在冰上将多株抗TccC抗体(1/100稀释)添加至细菌悬浮液中1h。用PBS再洗涤细菌三次，且在冰上用山羊FITC结合抗兔IgG二级抗体(1/100稀释)(JacksonImmunoresearch)染色1h。染色之后，洗涤细菌三次且使其再悬浮于1ml PBS中且通过流动式细胞量测术分析。使用Summit 5.2软件(Beckman Coulter)，通过MoFlo XDP CellSorter(Beckman Coulter)执行流动式细胞量测术。

(9)吞噬作用分析

在生长停滞期早期收集台湾假单孢菌细胞，且用PBS洗涤两次且使其再悬浮于PBS中至OD＝1(4×10⁹个细胞)。将一毫升再悬浮细胞添加至CFSE中(最终浓度5μM)，且在30℃下在暗处培育30min。用PBS洗涤细胞三次且在荧光显微镜下观察。对于吞噬作用分析，在37℃下在暗处将CSFE标记台湾假单孢菌细胞添加至巨噬细胞(MOI＝1000)持续30min，且随后用PBS洗涤三次。分别通过流动式细胞量测术及荧光显微镜量测吞噬作用的定量及观察结果。通过Cytomics FC500(Beckman Coulter)，使用CXP软件(Beckman Coulter)执行流动式细胞量测术。收集一万个细胞用于分析。非感染巨噬细胞用作阴性对照。

(10)台湾假单孢菌的定量H₂O₂分析及增殖分析

收集生长至生长停滞期(24h)的台湾假单孢菌细胞，在PBS中洗涤三次且以10⁹个细胞/ml使其再悬浮于PBS中，且随后用1M H₂O₂培育。在使用PeroX-Oquant定量过氧化物分析套组(Pierce)处理之后的不同时间点侦测剩余H₂O₂的浓度。如先前所描述观测羟基在台湾假单孢菌中的增殖作用。使台湾假单孢菌在LB培养液中生长24h，且随后用不同浓度H₂O₂培育3h。通过计数群落形成单位测定增殖。

其他实施例

本说明书中揭示的所有特征可以任何组合形式组合。本说明书中揭示的各特征可经用于相同、等效或类似目的的替代性特征置换。因此，除非另外明确说明，否则所揭示的各特征仅为一系列通用等效或类似特征的一个实例。

自上述实施方式，熟习此项技术者可易于确定所描述实施例的基本特征，且在不背离其精神及范畴的情况下可对实施例作出各种变化及修改以使其适应各种用途及条件。因此，其他实施例亦在申请专利范围内。

Claims (21)

1.一种产生抑制微生物生长的组合物的方法，所述方法包含在养分有限培养基中培养台湾假单孢菌(Pseudomonas taiwanensis)菌株以获得培养液及收集所述培养液，从而产生所述组合物。

2.如权利要求1的方法，其中所述培养基为铁有限培养基。

3.如权利要求2的方法，其中所述培养基为补充有酪蛋白胺基酸、MgSO₄及甘油的M9基本培养基。

4.如权利要求3的方法，其进一步包含自所述培养液移除细胞以获得无细胞上清液及收集所述无细胞上清液。

5.如权利要求1的方法，其中所述台湾假单孢菌菌株具有寄存编号DSM21245。

6.如权利要求1的方法，其中所述台湾假单孢菌菌株具有功能丧失rpoS突变。

7.如权利要求1至6中任一项的方法，其中所述微生物为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。

8.如权利要求7的方法，其中所述微生物选自由以下组成的群：水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、稻热病菌(Pyriculariaoryzae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、兰花萎凋病菌(Fusarium oxysporum f spcattleyae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或白色念珠菌(Candida albican)。

9.一种抑制微生物生长的组合物，其中所述组合物通过如权利要求1至6中任一项的方法产生。

10.如权利要求9的组合物，其进一步包含一或多种其他抗细菌剂、抗真菌剂或杀虫剂。

11.一种抑制微生物生长的方法，所述方法包含使所述微生物与如权利要求9的组合物接触。

12.如权利要求11的方法，其中所述微生物为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。

13.如权利要求12的方法，其中所述微生物选自由以下组成的群：水稻黄单孢菌水稻致病变种、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌、辣椒疫霉菌、稻热病菌、立枯丝核菌、兰花萎凋病菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。

14.一种治疗或降低水稻细菌性枯叶病风险的方法，所述方法包含向有需要的水稻植物施用如权利要求9的组合物。

15.一种抑制微生物生长的方法，所述方法包含：使所述微生物与具有结构Q-DSer-Lys-OHHis-aDThr-Ser-cOHOrn的经分离萤绿素接触，其中Q为发色团且所述微生物为植物病原细菌、植物病原真菌或多重抗药性细菌。

16.如权利要求15的方法，其中所述微生物选自由以下组成的群：水稻黄单孢菌水稻致病变种、似胶黏孢炭疽刺盘孢菌、辣椒疫霉菌、稻热病菌、立枯丝核菌、兰花萎凋病菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌。

17.如权利要求16的方法，其中所述微生物为水稻黄单孢菌水稻致病变种。

18.一种抑制昆虫生长的方法，所述方法包含使所述昆虫与含有台湾假单孢菌菌株、台湾假单孢菌细胞溶解物或台湾假单孢菌TccC多肽的组合物接触，其中所述昆虫为鳞翅目(Lepidopteran)物种。

19.如权利要求18的方法，其中所述昆虫为小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

20.如权利要求18或19的方法，其中所述细胞溶解物为全细胞溶解物或可溶性溶解物。

21.如权利要求20的方法，其中所述台湾假单孢菌菌株在富含养分的培养基中经培养，且所述细胞溶解物自富含养分的培养基中培养的台湾假单孢菌菌株获得。