CN101215529A - 一种α-酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸 - Google Patents
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Abstract
一种α－酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α－酮戊二酸，属于生物工程技术领域。本发明菌株为一株解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH－Z06，保藏编号CCTCC NO：M207143。该菌株是从炼油厂附近的土壤中经在完全培养基、基本培养基和补充培养基平板上菌落生长情况的对照筛选出硫胺素营养缺陷型的菌株，然后对筛选出的硫胺素缺陷型菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养初筛，发酵液利用硅胶层析方法分析，将保留有α－酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，发酵液经高效液相方法测定，比较α－酮戊二酸产量高低而得到的高产α－酮戊二酸的一株菌，通过对发酵培养基中重要组成成分进行优化，发酵6天时α－酮戊二酸产量可达到39.3g/L。
Description
技术领域
一种α-酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸，属于生物工程技术领域，特别是一株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母。
背景技术
α-酮戊二酸，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为：
α-酮戊二酸结构式
α-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景，目前主要应用领域为：作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测肝功能的配套试剂；体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体；同时研究还表明，α-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用。α-酮戊二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病进行治疗。
随着α-酮戊二酸应用范围不断扩大，α-酮戊二酸的市场需求也在不断增长。但是目前α-酮戊二酸的生产主要还是采用有机合成方法，包括一系列复杂的化学合成过程，这在原料来源和安全生产上存在一定的问题，主要是存在爆炸的危险。所以开发一种利用微生物发酵生产α-酮戊二酸的高效安全的方法很重要。发酵法生产α-酮戊二酸的研究最早始于1946年，当时Lockwood和Stodola对利用细菌生物合成α-酮戊二酸进行了初步的研究。之后Asai等人发现假单胞菌属、产气杆菌和粘质沙雷氏菌可以过量合成α-酮戊二酸，并且提出过量合成α-酮戊二酸的必要条件是培养基中碳源、氮源的浓度。上世纪60年代中期，T.VFinogenova等人在利用解脂亚洛酵母发酵生产单细胞(SCP)蛋白的过程中发现了该酵母也具有过量合成有机酸(α-酮戊二酸、2-羟基酮戊二酸、柠檬酸等)的能力。在硫胺素(一种该酵母菌不能合成，但对于α-酮戊二酸脱氢酶活性是必需的维生素)缺乏的情况下，解脂亚洛酵母可以利用烷烃分泌大量的α-酮戊二酸。
目前对发酵法生产α-酮戊二酸研究较多的是俄国的一个微生物生化和生理研究所。该研究所发现不同种属的硫胺素缺陷型酵母可能都有生产α-酮戊二酸的能力，合成α-酮戊二酸的主要条件就是硫胺素缺乏引起的生长限制。
1999年，T.V.Finogenova等人利用Yarrowia lipolytica VKM Y-2373的突变菌株N1在以乙醇为碳源的培养基上通过调节硫胺素的添加量、氮源、溶氧以及pH值等条件使得α-酮戊二酸的产量达到49g/L，对乙醇的产率是42％。并且确定了生产α-酮戊二酸的最重要条件是由硫胺素缺乏引起的生长限制和过量的氮源(碳源不足时，碳源流向柠檬酸合成)。并且在基于对乙醇代谢和α-酮戊二酸合成途径中关键酶活性的分析中，初步肯定了α-酮戊二酸的合成与氮源代谢之间具有密切的关系。后来又以Yarrowia lipolytica自然菌株为生产菌，在以石蜡为碳源的培养基上得到了109g/L的α-酮戊二酸，产率为120％。
目前国内对发酵法生产α-酮戊二酸的研究很少，仍处于研究的初步阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸。
本发明的技术方案：一种α-酮戊二酸高产菌，分类命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M207143。
解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143的筛选方法，从炼油厂附近的土壤中经对照在完全培养基、基本培养基和补充培养基平板上菌落生长情况筛选出硫胺素营养缺陷型的菌株，然后对初筛出的硫胺素缺陷型菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养，发酵液利用硅胶层析方法分析，将保留有α-酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，发酵液经高效液相方法测定，比较α-酮戊二酸产量高低而得到高产α-酮戊二酸的菌株。
一种α-酮戊二酸的生产方法，采用解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产α-酮戊二酸；
(1)种子培养：
种子培养基以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，pH 5.5；
培养条件：温度28℃、摇床转速200rpm条件下，培养20-24h；
(2)液体发酵培养：
发酵培养基以g/L计：甘油50-150，硫酸铵1.5-7，磷酸二氢钾1-5，七水硫酸镁0.1-1.5，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，碳酸钙10-30，初始pH 4-6；
发酵条件：接种量10％，温度25-30℃、摇床转速170-200rpm条件下，发酵90-144h。
所生产的α-酮戊二酸产量达到39.3g/L。
微生物菌株的筛选与鉴定：
在本发明中建立一个快速有效的筛选高产α-酮戊二酸菌株的模型。根据高产α-酮戊二酸的菌株的活性较低，而α-酮戊二酸脱氢酶的活性由该酶重要的辅因子硫胺素调控这一特点，可初步设计一种以筛选硫胺素营养缺陷型菌株为目标的实验方案。即首先将在CM上培养好的菌株分别点种到MM和含有微量硫胺素的SM上，筛选出在MM上不能生长而在SM上生长良好的菌株，及硫胺素缺陷型菌株。
由于硫胺素不仅是α-酮戊二酸脱氢酶的重要辅因子，也是丙酮酸脱氢酶的辅因子，因此硫胺素营养缺陷型菌株在亚适量的硫胺素水平发酵可以积累α-酮戊二酸和丙酮酸两种有机酸。所以需对筛选到的硫胺素营养缺陷型菌株进行发酵初筛，用硅胶层析方法确定出产α-酮戊二酸的菌株，然后对这些菌株进一步进行发酵，用HPLC方法分析以获得高产α-酮戊二酸的菌株。
本发明从无锡炼油厂附近的土壤中取样，采土样于含硫胺素的富集培养基中富集培养2-4次，菌液经适当稀释后涂布于CM上，30℃培养2-3天，然后分别点种于MM和SM上，筛选出硫胺素营养缺陷型菌株。然后通过进行发酵初筛选取在TCL中保留有α-酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，4天后，用HPLC法测定发酵液中α-酮戊二酸的含量。经过对多个土壤样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的数十株硫胺素营养缺陷型土壤微生物中筛选得到杂酸较少，遗传稳定性好的产α-酮戊二酸菌株WSH-Z06菌株。
本发明筛选得到的能有效积累α-酮戊二酸的微生物WSH-Z06，经18S rRNA基因测定和按《微生物分类学》生理生化鉴定，认为属子囊菌纲假丝酵母属的解脂亚洛酵母。该菌有两种形态。在液体培养基中可见典型的酵母菌特征，即散开的卵形、椭圆形，大小为2-5.5×3.5-15μm，有菌环和醭膜，可见出芽生殖现象；在YPD琼脂培养基上的菌落呈奶酪状、乳白色至灰白色，表面有皱褶、不透明，边缘不平整，在30℃条件下培养3天，直径可达3-5mm，菌体较黏，电镜观察可见大量成链状的假丝，并可见子囊和孢子。
种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后经0.2μm膜滤除菌，接种前加入。
将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28℃，200rpm条件下培养20-24h。
按10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，25-30℃，170-200rpm条件下培养90-144h。
本发明的有益效果：本发明的特点是从土壤中分离出有效产生α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143，其在适宜条件下，能显著地积累α-酮戊二酸，产α-酮戊二酸达到13.2-39.3g/L。
生物材料样品保藏
解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06，保藏日期2007年9月10日，包藏单位名称及简称：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M207143。
具体实施方式
以下是解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143筛选、鉴定及发酵生产α-酮戊二酸的实施例。
实施例1
从无锡市某炼油厂附近的土壤中采样，称取5g土样(湿重)，加到装有50mL含硫胺素的富集培养基的三角瓶中，30℃，200rpm条件下培养2-3天，按10％的接种量再进行两次富集。取富集培养物用PBS(0.145mol/L氯化钠，0.01mol/L磷酸钠水溶液)稀释并涂布于CM上，30℃培养2-3天，对应点种MM和SM上，选择不能在MM而能在SM上生长的菌株，即硫胺素营养缺陷型菌株，进一步进行发酵初筛。28℃，200rpm条件下培养3天后取发酵液离心，上清液点样到硅胶层析薄板上，于苯∶乙酸乙酯∶乙酸体积比为2∶1∶0.03系统中展层，用溴酚兰显色。将保留有α-酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，4天后，用HPLC法(StableBond C18反相柱250×4.6mm，流动相0.1％(v/v)H3PO3，pH 2.7，温度28℃，紫外检测波长210nm)测定α-酮戊二酸的含量。
其中：富集培养基(g/L)：葡萄糖20，琼脂20，土壤浸出液200，蒸馏水800，调pH 5.5；121℃高压蒸汽灭菌15min。
土壤浸出液制备：用蒸馏水与等量的上层土或沙壤土混合，去掉重的颗粒，然后过四层纱布得清液。
完全培养基(CM)(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，pH 5.5，加入2％琼脂即为固体CM。
基本培养基(MM)(g/L)：葡萄糖20，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO43，青霉素0.05，制霉菌素0.08，pH 5.5，加入2％琼脂即为固体MM。
补充基本培养基(SM)(g/L)：在MM中添加10μg/L的硫胺素，加入2％琼脂即为固体SM。
斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，琼脂20，28℃培养3天。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，pH 5.5，28℃，摇床转速200rpm，培养时间20-24h。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，硫酸铵3，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.7，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，碳酸钙20，初始pH 4.5；发酵条件：28℃，200rpm，发酵时间6天。
实施例2
对筛选的WSH-Z06菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见表1、2、3)，并按精编分子生物学指南的方法提取染色体DNA，以p1和p2为正向和反向引物，p1：5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’，
p2：5’-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’，
用PCR扩增18S rDNA基因，委托上海生工生物工程公司进行18S rDNA测序，得到本菌株部分18S rDNA基因片断后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的18S rDNA的基因序列，并进行同源性比对，基于18SrDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是解脂亚洛酵母的变种，命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06，
此菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：207143。
表1菌株的碳源发酵
| 葡萄糖麦芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖 | +----- | 蜜二糖甘露醇甘油柠檬酸盐醋酸盐乙醇 | -++--+ |
表2碳源和氮源的同化及其它生理和生化特征
| 葡萄糖麦芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖蜜二糖 | +-±---- | 甘油柠檬酸盐醋酸盐乙醇(＜3g/L)肌醇KNO4(NH4)2SO4 | ++++-+++ | 可溶性淀粉海藻糖纤维二糖D-阿拉伯糖木糖L-阿拉伯糖甘露醇 | ---±±-+ | ≤30℃＞35℃50％葡萄糖60％葡萄糖无硫胺素无生物素甲醇 | +±±--+- |
表3假菌丝和类淀粉化合物形成
| 假菌丝类淀粉化合物 | +- |
实施例3
将培养好的CCTCC NO：M207143种子以10％的接种量接种到含相同碳浓度(32g/L)的葡萄糖、乙酸钠、甘露醇、乙醇、甘油等不同碳源的发酵培养基中，发酵培养基其余组成为：硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.7g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，硫胺素4μg/L，培养基初始pH 4.5，接种后补加碳酸钙20g/L用来调节pH，在28℃，200rpm条件下发酵90h，用HPLC测定发酵液中的α-酮戊二酸的含量。结果表明以甘油为碳源发酵时明显优于其它种类的碳源(32g/L的碳源折算成甘油的浓度为82g/L)，发酵结束时，α-酮戊二酸产量为13.2g/L；而以葡萄糖为碳源时产量仅为9.5g/L；当采用其它种类的碳源时则产生更少量或不产生α-酮戊二酸。
实施例4
以甘油为碳源，向发酵培养基中添加不同浓度(0-16μg/L)的微量硫胺素，发酵培养基其余组成同实施例3，接入培养好的CCTCC NO：M207143种子液，在上述的条件下进行发酵6天，用HPLC测定发酵液中的α-酮戊二酸的含量。结果显示硫胺素浓度为1μg/L时相对最有利于α-酮戊二酸的积累，产量达到29.2g/L。
实施例5
以甘油为碳源，向接种后的发酵培养基中添加不同浓度(10-60g/L)的碳酸钙，发酵培养基其余组成同实施例3，以上述的条件进行发酵6天，用HPLC测定发酵液中的α-酮戊二酸的含量。结果发现向发酵培养基中添加20g/L的碳酸钙最有利于α-酮戊二酸的发酵生产，发酵结束时α-酮戊二酸的产量可达到39.3g/L。
Claims (3)
1.一种α-酮戊二酸高产菌，分类命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M207143。
2.一种解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143的筛选方法，其特征是从炼油厂附近的土壤中经对照在完全培养基、基本培养基和补充培养基平板上菌落生长情况筛选出硫胺素营养缺陷型的菌株，然后对初筛出的硫胺素缺陷型菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养，发酵液利用硅胶层析方法分析，将保留有α-酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，发酵液经高效液相方法测定，比较α-酮戊二酸产量高低而得到高产α-酮戊二酸的菌株。
3.一种α-酮戊二酸的生产方法，其特征是采用解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产α-酮戊二酸；
(1)种子培养：
种子培养基以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，pH 5.5；
培养条件：温度28℃、摇床转速200rpm条件下，培养20-24h；
(2)液体发酵培养：
发酵培养基以g/L计：甘油50-150，硫酸铵1.5-7，磷酸二氢钾1-5，七水硫酸镁0.1-1.5，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，碳酸钙10-30，初始pH 4-6；
发酵条件：接种量10％，温度25-30℃、摇床转速170-200rpm条件下，发酵90-144h。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080709 |