CN109722393B - 一种烟草黄色土源菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用，该细菌的微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibacter sp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 16451。本发明从土壤中分离得到的烟草黄色土源菌X7X，可用于发酵制备生物香料。所述生物香料，加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气，进行卷烟抽吸，能丰富烟香，减少烟气青杂气，增加细腻性，降低刺激性，适合卷烟加香。

Description

一种烟草黄色土源菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用。

背景技术

加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前，烟用香料按来源分为三类，即来自非烟草的天然植物香精油、浸膏等；来自非烟草的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油浸膏、酊剂等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等单体香料。按香料生产方法的不同主要分为两种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前，这两种方法都有其优点，但均存在一定的局限性。如直接从植物中提取天然香料，虽然生产操作简单，但存在改善卷烟抽吸效果不明显等缺点；采用化学合成的香料，虽然生产过程易于控制，但也存在香气单调、不自然等缺点。

近年来，随着微生物技术日新月异的发展，微生物法生产香料的工作已取得了很多进展。微生物种类丰富，长期以来人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调研和开发利用，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性也日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，微生物资源的不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。

利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香原料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。产香微生物，即能够产生具有芳香气味物质的微生物。目前，已经得到应用的产香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假丝酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是应用到卷烟中的微生物还很少，而且增香效果也不太理想。

发明内容

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面涉及一种具有产香功能的微生物烟草黄色土源菌X7X，分离于采自昆明市一个烟草生产基地的烟草根际土样，对其进行了形态学、生理生化性质和16SrRNA测序分析，鉴定结果表明其属于黄色土源菌属，微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibactersp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 16451，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

本发明分离得到的烟草黄色土源菌X7X菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：该菌株的细胞为革兰氏阴性、需氧型，非运动的杆状结构。细胞大小为宽0.6-0.7um，长1.2-2.0um。在R2A琼脂平板培养基上，30℃培养7天后，菌落呈现黄色、表面光滑、中央凸起边缘整齐，直径为1.0-3.0mm的形状。菌株能够在20-40℃，pH为6.0-8.0的范围内生长，最适生长温度为30℃，最适pH值为7.0。菌株的明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶，吐温40水解反应结果呈阳性，酪蛋白、纤维素、淀粉和吐温20、80水解结果呈阴性。菌株的碱性磷酸酶、脂酶C4、脂酶C8、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、半胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-糖醛酸酶、酸性磷酸酶检测结果呈阳性，精氨酸双水解酶、柠檬酸的利用、吲哚反应、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶检测结果呈阴性。

本发明所分离得到的烟草黄色土源菌X7X菌株能够利用乙醛酸、D-阿拉伯醇、蚁酸、果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸、D-乳酸甲酯、苹果酸和山梨醇作为碳源，但不能利用天冬氨酸、α-羟基丁酸、纤维二糖、果糖、半乳糖、蔗糖、鼠李糖和丝氨酸。所述X7X菌株细胞的极性主要包括磷脂酰乙醇胺、一个未鉴定的氨基磷脂、两个未鉴定的糖脂；主要的呼吸醌为MK-7；主要的脂肪酸为iso-C_15:0，iso-C_17:03OH和summed feature 3(C_16:1ω7c和/或C_16:1ω6c)。

本发明所分离得到的烟草黄色土源菌X7X，其基因组的G+C含量为49.7％的，其16SrRNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MG209702。

本发明第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，包括以下步骤：

a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水稀释后并于R2A琼脂平板培养基上，采用平板划线法分离纯化菌株，编号后加入到甘油或涂布于R2A斜面培养基中，置于冰箱保藏备用；

b、将步骤a分离得到的微生物菌株分别接种到R2A液体培养基后，震荡培养，制得各微生物菌株的种子液，观察种子液外观和香气特征变化，筛选出其中能产生特殊香气的微生物菌株；

c、将步骤b筛选出的能产生特殊香气的微生物菌株，继续接种于R2A琼脂平板培养基上，进行化学和分子分析，构建系统发育树进行菌种鉴别。

上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a中的土壤样品取自云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际。

上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a具体为，称取10g土壤样品，加入100mL无菌水，30℃、200rpm震荡培养30min。用无菌水稀释至10^-3、10^-4w/v倍浓度，各取0.1mL均匀涂布于R2A琼脂平板上，放入30℃恒温培养箱中培养2周。在培养平板上挑取不同形态单菌落，继续采用平板划线法分离纯化菌株，编号后接种于R2A斜面培养基，或配制成甘油悬液(20％，w/v)，置于-80℃条件下保藏。

上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤a和c中R2A琼脂平板培养基的组成如下：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。

上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤b中R2A液体培养基的组成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2。

上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X的方法，步骤b中振荡培养温度为30℃，振荡速度160rpm，培养至菌液浓度为光密度OD＝1.5；步骤c中培养温度为30℃，培养7天。

本发明第三方面涉及一种利用本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X发酵制备生物香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将烟草黄色土源菌X7X液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中进行扩大培养，30℃下摇瓶培养7天，用石油醚萃取3次，合并萃取液，萃取液进行浓缩，经无水硫酸钠干燥后，所得淡褐色液体，即为生物香料。

上述利用本发明第一方面所述的烟草黄色土源菌X7X制备生物香料的方法，发酵培养基的组成如下：黄豆饼浸出汁10mL，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，PH7.2。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次从云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际土样中分离得到新的具有产香功能的试验菌种X7X，经形态学、生理生化性质和16S rRNA测序分析表明该菌株是一种新的细菌，微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibactersp.X7X；

(2)本发明从土壤中分离得到的烟草黄色土源菌X7X，其发酵提取物可以制备成生物香料，加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气，进行卷烟抽吸时，能使烟香丰富性增加，烟气青杂气明显减少，细腻性增加，刺激性降低，适合卷烟加香。

附图说明

图1为本发明烟草黄色土源菌X7X在R2A培养基上的电镜照片；

图2为本发明烟草黄色土源菌X7X及部分相关菌株依据16S rRNA基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

1.烟草黄色土源菌X7X的分离、培养与鉴定

1.1烟草黄色土源菌X7X的分离

从云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际取土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入100mL无菌水，30℃、200rpm震荡培养30min；用无菌水将浓度稀释至10^-3、10^-4w/v倍，将2个浓度的菌液各取0.1mL均匀涂布于R2A琼脂平板上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃恒温培养箱中培养2周，在培养平板上挑取不同形态单菌落，继续采用平板划线法分离纯化菌株，编号后接种于R2A斜面培养基，或配制成甘油悬液(20％，w/v)，置于-80℃条件下保藏。

将分离得到的微生物分别接种于R2A液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝1.5，制得各微生物菌株的种子液，观察种子液外观和香气特征变化，筛选出其中能产生特殊香气的微生物菌株，编号为X7X。

1.2烟草黄色土源菌X7X的鉴定

将上述筛选出的能产生特殊香气的微生物菌株X7X，继续接种于R2A琼脂平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养7天。进行形态学、生理生化性质和16SrRNA测序分析，鉴定结果表明属于黄色土源菌属，其微生物学分类命名为烟草黄色土源菌(拉丁文学名：Flavisolibactersp.X7X)。

烟草黄色土源菌X7X在R2A琼脂平板培养基上的电镜照片如附图1所示。

烟草黄色土源菌X7X菌株的细胞为革兰氏阴性、需氧型，非运动的杆状结构。细胞大小为宽0.6-0.7um，长1.2-2.0um。在R2A琼脂平板30℃培养7天后，菌落呈现黄色、表面光滑、中央凸起边缘整齐直径为1.0-3.0mm的形状。菌株能够在20-40℃，pH为6.0-8.0的范围内生长，最适生长温度为30℃，最适pH值为7.0。菌株的明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶，吐温40水解反应结果呈阳性，酪蛋白、纤维素、淀粉和吐温20、80水解结果呈阴性。菌株的碱性磷酸酶、脂酶C4、脂酶C8、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、半胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-糖醛酸酶、酸性磷酸酶检测结果呈阳性，精氨酸双水解酶、柠檬酸的利用、吲哚反应、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶检测结果呈阴性。

所述菌株X7X能够利用乙醛酸、D-阿拉伯醇、蚁酸、果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸、D-乳酸甲酯、苹果酸和山梨醇作为碳源，但不能利用天冬氨酸、α-羟基丁酸、纤维二糖、果糖、半乳糖、蔗糖、鼠李糖和丝氨酸。所述X7X菌株细胞的极性主要包括磷脂酰乙醇胺、一个未鉴定的氨基磷脂、两个未鉴定的糖脂；主要的呼吸醌为MK-7；主要的脂肪酸为iso-C_15:0，iso-C_17:03OH和summed feature 3(C_16:1ω7c和/或C_16:1ω6c)。

烟草黄色土源菌X7X的生理生化特征如表1所示：

表1烟草黄色土源菌X7X的生理生化反应鉴定结果

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性

烟草黄色土源菌X7X的碳源利用情况如表2所示：

表2烟草黄色土源菌X7X的碳氮源利用情况

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性

烟草黄色土源菌X7X的16S rRNA基因核苷酸部分序列如附图说明所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rRNA基因核苷酸序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的烟草黄色土源菌X7X与菌株(Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的烟草黄色土源菌X7X是一个新物种，命名为Flavisolibactersoli.X7X。

烟草黄色土源菌X7X在GenBank数据库的16S rRNA基因核苷酸序列登录号为MG209702，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC 16451。烟草黄色土源菌X7X及相关种属的16S rRNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。

实施例2

烟草黄色土源菌X7X发酵液生物香料的制备

1.烟草黄色土源菌X7X的培养

(1)试管斜面培养

采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种烟草黄色土源菌X7X，30℃下培养2周，获得试管菌种；

(2)种子培养

采用种子培养基，种子培养基为R2A液体培养基，配方为：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，30℃震荡培养48h，获得液体菌种；

(3)发酵培养

取5L发酵培养基，培养基的配方为：黄豆饼浸出汁10mL，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，PH7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，震荡培养7天，培养温度为30℃，得到发酵液。

2.发酵液生物香料的制备和评价

(1)发酵提取液生物香料的制备

将发酵液用3L乙酸乙酯进行萃取，连续萃取3次，合并萃取液，并于45℃、80kPa条件下进行减压浓缩，添加一定量无水硫酸钠，4℃静置过夜，最后得到一种带香味的澄清淡褐色液体，即为所需生物香料，其理化指标如表3所示。

(2)发酵液生物香料的评价

将发酵液生物香料用微量喷雾器按0.3‰的量均匀地喷加在烟丝上。对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。如表4所示，与对照卷烟相比，加香烟丝具有较为特殊的香气，说明该发酵液生物香料具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，效果稳定而持久。

表3烟草黄色土源菌X7X发酵生物香料的理化指标

序号	检测项目	烟草黄色土源菌X7X发酵生物香料
			1	相对密度	1.1336±0.008
2	折光指数	1.3582±0.008
			3	澄清度	澄清
4	挥发性成分总量(％)	35.7
			5	乙醇中的溶混度(25℃)	不溶于水，可溶于70％-95％乙醇溶液
6	Pb	<5mg/kg
			7	As	<1mg/kg
8	香豆素	未检出
			9	黄樟素	未检出

表4烟草黄色土源菌X7X发酵生物香料的感官评吸表

实施例3

为考察烟草黄色土源菌X7X用于制备发酵液生物香料的独特性，实施例3做出如下调整：

实施例3和实施例2的区别在于，以烟草黄色土源菌X7X的亲缘菌种Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2(购自日本微生物保藏中心(JCM))代替烟草黄色土源菌X7X制备发酵液生物香料，其余操作步骤同实施例2中步骤1及步骤2(1)，得到一种淡黄色液体，即为所需制备的发酵液。通过嗅香发现，该发酵液并不带香味。将该发酵液用微量喷雾器按0.3‰的量均匀地喷加在烟丝上，卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。与实施例2中由烟草黄色土源菌X7X所制备的发酵液生物香料卷制的卷烟相比，用Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2制备得的发酵液，无丰富烟香、降低烟气刺激性，改善烟气质的作用，且还会引入杂气，使口腔辛辣感增加。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附序列表：

烟草黄色土源菌X7X的16S rDNA部分序列如下：

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

高莉 段焰青 李源栋 者为 王坚 李文均 陈兴

<120> 一种烟草黄色土源菌及其分离方法和应用

<130> RIB180484

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> 烟草黄色土源菌(Flavisolibacter soli.X7X)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaatacatg caagtcgagg 60

ggcagcgcag tgtagcaata catgggcggc gaccggcaaa cgggtgcgga acacgtacgc 120

aacctaccca aaactggggg atagcccacc gaaaggtgga ttaatacctc gtaacctcgt 180

gaagcggcat cgctttatga gtatagctcc ggcggttttg gatgggcgtg cgcctgatta 240

ggtagttggc ggggtaacgg cccaccaagc ctgcgatcag taactggtgt gagagcacga 300

ccagtcacac gggcactgag acacaggccc gactcctacg ggaggcagca gtaaggaata 360

ttggtcaatg gacgcaagtc tgaaccagcc atgccgcgtg agggatgaag gtcctctgga 420

ttgtaaactt cttttatctg ggacgaaacc ctcgttttct aacgggattg acggtaccag 480

aggaataagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt 540

tatccggatt cactgggttt aaagggtgcg taggagggca gggaagtcag tggtgaaatc 600

tccgggctta actcggaaac tgccgttgat actctctgtc ttgaatcccg tggaggtgag 660

cggaatatgt catgtagcgg tgaaatgctt agatatgaca tagaacacca attgcgaagg 720

cagctcgcta cacgaagatt gactctgagg cacgaaagcg tggggatcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg gatactcgac atacgcgata cactgtgtgt 840

gtctgagcga aagcattaag tatcccacct gggaagtacg accgcarggt tgaaactcaa 900

aggaattggc gggggtccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgatacgcga 960

ggaaccttac ctgggctaga atgctggttg accgtgggtg aaagctcact ttgtagcaat 1020

acacaaccag taaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cccatcagta gttgccatca ggtaacgctg ggaactctac 1140

tgaaactgcc gtcgtaagac gcgaggaagg aggggatgat gtcaagtcat catggccttt 1200

atgcccaggg ctacacacgt gctacaatgg ggcgtacaaa gggctgccac ttagcgataa 1260

ggagccaatc ccaaaaaacg cctctcagtt cagatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agctggaatc gctagtaatc gtatatcagc aatgatacgg tgaatacgtt cccggacctt 1380

gcacacaccg cccgtcaagc catggaagct gggtgtacct aaagtcggta accgcaagga 1440

gccgcctagg gtaaaactag taactggggc taagtcgtaa caaggtaacc 1490

Claims (1)

1.一种烟草黄色土源菌，其特征在于，其微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibacter sp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 16451。

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