CN111690552A - 一株有拮抗作用的辣椒溶杆菌ck09及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株拥有拮抗作用的辣椒溶杆菌CK09（Lysobacter capsici CK09）及其应用，属于微生物技术领域，该菌株分离自山西省榆次市农田的柠条根际土壤中，由改良的牛津杯法从柠条根际土壤细菌中筛选所得。该辣椒溶杆菌CK09对植物的病原真菌和致病细菌具有拮抗作用，所述的植物病原真菌为葡萄座腔菌、镰刀菌，植物病原细菌为芽孢杆菌属细菌。该拮抗细菌具有广谱抑菌效果的。利用微生物制剂代替化学农药，作为一种环境友好型的手段，可以实现对植物病害的防治，并且减少对环境的污染。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及的是一株能够对植物病原真菌和细菌产生拮抗作用的辣椒溶杆菌CK09及其应用。
背景技术
农业生产中由病原微生物导致的农作物病害十分常见，常见的农作物病原微生物包括各种致病真菌以及细菌。这些病原微生物会导致农作物患病减产而危害农业安全。由于植物病原菌种类多、发病因素复杂，因此一直是农业生产上最难治理的病害之一。比如致病疫霉导致的马铃薯晚疫病，尖孢镰刀菌侵染引起的香蕉枯萎病，葡萄座腔菌引发的植物流胶病等等。目前农业上对病原微生物的防治一般是采用物理、化学、生物防治的方法，传统的化学方法仍然是现阶段农业上的主要防治手段，比如有机磷酸酯类农药、有机砷类、苯类农药的使用。这些化学农药可以在一定程度上控制植物病害，但是，由于长期大量使用单一的化学农药，造成病原菌对化学农药的抗药性增强，并且化学农药的积累也带来了严重的环境污染问题，威胁着人体健康，久而久之形成恶性循环。而生物防治方法，特别是利用拮抗菌对病原菌的抑制作用，具有无污染，防治效率高，长期效益好的独特优势，因而逐渐受到关注。多种生防菌株能够以竞争营养物质和生存空间、产生抑菌物质、寄生等方式特异性地抑制病原微生物的生长乃至杀灭病原微生物，这种作用称为拮抗作用。而寻找能够对植物病原微生物产生拮抗效果的生防菌株就显得极为重要。
辣椒溶杆菌是一种溶杆菌属的革兰氏阴性细菌，广泛分布于河流、土壤、污水等环境中，可以通过降解环境中的有机物来获取营养并生存。该菌为兼性厌氧的杆状细菌，不产芽抱，没有运动性。单细胞呈棒杆状，单个细胞或多个细胞聚集在一起会形成不规则的长丝状结构，于2008年被命名为Lysobacter capsici（Park et al.,2008）。溶杆菌属的细菌大多有着抑制其他细菌生长甚至杀死其他细菌的能力，有研究表明辣椒溶杆菌能够产生多种水解酶类，比如葡聚糖酶，几丁质酶，蛋白酶等，能够对多种真菌产生拮抗效果，故可以用作农业生产中的生防菌株使用。而分离筛选得到拥有广谱抑菌性的辣椒溶杆菌，并研究其对不同病原微生物的拮抗效果具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有广谱抑菌效果的拮抗细菌，利用微生物制剂代替化学农药，作为一种环境友好型的手段，实现对植物病害的防治，并且减少对环境的污染。
一株有拮抗作用的辣椒溶杆菌CK09，该生物材料的分类命名为：Lysobacter capsici CK09，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2019年12月11日，其保藏编号为CCTCC No: M 20191036。
辣椒溶杆菌CK09的应用，其特征在于：辣椒溶杆菌CK09用于植物的病原真菌和致病细菌的拮抗作用，所述植物的病原真菌为葡萄座腔菌、镰刀菌，植物的致病细菌为芽孢杆菌属细菌。
辣椒溶杆菌CK09在植物致病细菌拮抗作用中的应用，包括以下步骤：
（1）选取辣椒溶杆菌CK09单菌落接种于无菌的R2A液体培养基中，制得辣椒溶杆菌CK09菌液留待后步使用；
（2）活化的植物致病细菌菌液与半固体培养基混合后倾倒至平板上；
（3）在半固体培养基上垂直放置牛津杯，向牛津杯中加入步骤（1）中制得的辣椒溶杆菌CK09菌液和无菌的R2A液体培养基；
（4）将平板移入培养箱中，水平静置培养3~5天，观察抑菌圈并测量抑菌圈的直径，辣椒溶杆菌CK09对植物致病细菌产生拮抗作用。
辣椒溶杆菌CK09在植物病原真菌拮抗作用中的应用，包括以下步骤：
（1）选取辣椒溶杆菌CK09单菌落接种于无菌的R2A液体培养基中，制得辣椒溶杆菌CK09菌液留待后步使用；
（2）将PDA培养基倾倒在平板上，将活化的植物病原真菌转接至新鲜的PDA培养基上；
（3）在PDA培养基上垂直放置牛津杯，向牛津杯中加入步骤（1）中制得的辣椒溶杆菌CK09菌液；
（4）将平板移入培养箱中，水平静置培养5~7天，观察抑菌圈并测量抑菌圈的直径，辣椒溶杆菌CK09对植物病原真菌产生拮抗作用。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
本发明所提供的辣椒溶杆菌CK09，对多种植物致病性真菌和细菌表现出极为明显的抑菌效果，若作为农业生防细菌使用，不会造成环境污染的问题，对人畜安全无害，且效果甚佳，有巨大的应用前景。
附图说明
图1是辣椒溶杆菌CK09对植物病原真菌的抑菌圈直径柱状图；
图中，JK表示Fasurium sp. JK，ZQ表示Fasurium sp.ZQ；SXYTLJ01表示Botryosphaeria dothidea SXYTLJ01；M1、M2、M3表示三株未鉴定的樱桃致病真菌。
图2是辣椒溶杆菌CK09对植物致病细菌的抑菌圈直径柱状图；
图中，ZQX表示Bacillus sp.ZQX，Z713表示Bacillus sp.Z713，Z7表示Bacillus sp.Z7，SB表示Bacillus sp.SB。
图3是辣椒溶杆菌CK09的系统发育树。
具体实施方式
以下是列举的具体实施方式，来对本发明做进一步的说明，但需要理解的是，并不因此而限制本发明的范围和细节。
下述实施方式中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从正常商业途径得到。
下述实施方式使用的培养基：
（1）、R2A液体培养基：胰蛋白胨0.25 g，酸水解酪蛋白0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸镁0.1 g，丙酮酸钠0.3 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH=7.4。
（2）、R2A固体培养基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，无水硫酸镁0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 ml，pH=7.4。
（3）、PDB培养基：土豆200 g，煮沸30min后去过滤液，加入葡萄糖20 g，硫酸镁2 g，无水磷酸二氢钾2 g，蛋白胨3 g，补足蒸馏水到1000 ml，pH=6.4。
（4）、PDA培养基：土豆200 g，煮沸30min后去过滤液，加入葡萄糖20 g，硫酸镁2 g，无水磷酸二氢钾2 g，蛋白胨3 g，琼脂15 g，补足蒸馏水到1000 ml，pH值为自然pH。
（5）、R2A半固体培养基：在R2A液体培养基中加入琼脂，琼脂浓度范围为6 g/L—10g/L。
实施例1 辣椒溶杆菌CK09对植物病原真菌的拮抗效果
前期工作筛选所得的有良好拮抗效果的辣椒溶杆菌CK09，将其作为待测菌株验证其对病原真菌的抑菌效果，这里选用的病原真菌为本实验室保存，均为植物致病性真菌，所述具体步骤如下：
（1）、选取辣椒溶杆菌CK09的单菌落接种于R2A液体培养基，在28℃环境中，摇床以180rmp转速培养直至对数生长后期，稳定前期时，收集菌液备用；
（2）、倾倒PDA固体培养基至平板上，待培养基凝固后，将活化的待试病原真菌转接至新鲜的PDA培养基；
（3）、用镊子将已灭菌的牛津杯（规格为内径0.78cm、外径0.8cm、高1cm）垂直放置到培养基表面中央处，一个平板放置两个牛津杯；
（4）、一个牛津杯中加入50 μL的辣椒溶杆菌CK09的菌液及50 μL无菌的R2A液体培养基，另一个牛津杯中加入100 μL的无菌R2A液体培养基作为阴性对照；
（5）、一个待试真菌做三个重复，静置3 h后，用封口膜封口，移入28 ℃恒温培养箱，培养7 d观察是否存在抑菌圈，并测量抑菌圈直径，详情见下表1以及图1。
表1 辣椒溶杆菌CK09对植物病原真菌的拮抗效果
a：通过柯赫氏法则回接验证结果证明，该菌株是导致甜樱桃叶枯病的主要致病菌，但是尚未进行菌种鉴定。
b：阴性对照均未产生抑菌圈，故其直径为牛津杯外径。
实施例2 辣椒溶杆菌CK09对植物致病细菌的拮抗效果
将该株辣椒溶杆菌CK09作为拮抗菌，验证其对植物致病细菌的抑菌效果，这里选用的细菌同为本实验室保存的植物致病细菌，且均为革兰氏阳性的芽孢杆菌属细菌，步骤如下：
1）菌液制备：将待测植物致病细菌和辣椒溶杆菌CK09分别接种到 R2A液体培养基中，在28℃环境中，摇床以180 rmp转速培养直至对数生长后期，稳定前期时，收集菌液备用；
2）配制琼脂浓度为10 g/L的R2A半固体培养基，灭菌后放入55 ℃烘箱备用；
3）指示菌的处理：将20 μL待测植物致病细菌的菌液加入到R2A半固体培养基中，迅速振荡混匀后倒平板，一个平板对应一个菌株；
4）放置牛津杯：待培养基凝固后用镊子将已灭菌的牛津杯（规格为内径0.78cm、外径0.8cm、高1cm）垂直放置到培养基表面，设4个平行；
5）加拮抗菌菌液：在牛津杯中加入50 μL的辣椒溶杆菌CK09的菌液及50 μL无菌的R2A液体培养基；同时设置阴性对照，在牛津杯中只加入100 μL无菌的R2A液体培养基；
6）静置3 h后，移入28 ℃恒温培养箱，培养5 d观察是否存在抑菌圈，测量直径大小，详情见下表2以及图2。
表2 辣椒溶杆菌CK09对植物致病细菌的拮抗效果
a：阴性对照均未产生抑菌圈，故其直径为牛津杯外径。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一株有拮抗作用的辣椒溶杆菌CK09及其应用
<150> 2019110557620
<151> 2019-10-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1329
<212> DNA
<213> 辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)
<400> 1
gctccttggg tggcgagtgg cggacgggtg aggaatacgt cggaatctgc ctatttgtgg 60
gggataacgt agggaaactt acgctaatac cgcatacgac ctacgggtga aagcggagga 120
ccttcgggct tcgcgcagat agatgagccg acgtcggatt agctagttgg cggggtaaag 180
gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc tagaggatga tcagccacac tggaactgag 240
acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgcaagcc 300
tgatccagcc atgccgcgtg tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac ttttgtccgg 360
aaagaaaagc cttgggttaa taccctgagg tcatgacggt accggaagaa taagcaccgg 420
ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggtgca agcgttactc ggaattactg 480
ggcgtaaagc gtgcgtaggt ggtttgttaa gtctgatgtg aaagccctgg gctcaacctg 540
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cgcgttaagt tcgccgcctg ggaagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 840
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tggccttgac atccacggaa ctttctagag atagattggt gccttcggga accgtgagac 960
aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020
gcgcaaccct tgtccttagt tgccagcacg taatggtggg aactctaagg agaccgccgg 1080
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggccagggct 1140
acacacgtac tacaatggta gggacagagg gctgcaaacc cgcgagggca agccaatccc 1200
agaaacccta tctcagtccg gatcggagtc tgcaactcga ctccgtgaag tcggaatcgc 1260
tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
cgtcacacc 1329
Claims (4)
1.一株有拮抗作用的辣椒溶杆菌CK09，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No: M 20191036。
2.如权利要求1所述的辣椒溶杆菌CK09的应用，其特征在于：辣椒溶杆菌CK09用于植物的病原真菌和致病细菌的拮抗作用，所述植物的病原真菌为葡萄座腔菌、镰刀菌，植物的致病细菌为芽孢杆菌属细菌。
3.根据权利要求2所述的辣椒溶杆菌CK09在植物致病细菌拮抗作用中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）选取辣椒溶杆菌CK09单菌落接种于无菌的R2A液体培养基中，制得辣椒溶杆菌CK09菌液留待后步使用；
（2）活化的植物致病细菌菌液与半固体培养基混合后倾倒至平板上；
（3）在半固体培养基上垂直放置牛津杯，向牛津杯中加入步骤（1）中制得的辣椒溶杆菌CK09菌液和无菌的R2A液体培养基；
（4）将平板移入培养箱中，水平静置培养3~5天，观察抑菌圈并测量抑菌圈的直径，辣椒溶杆菌CK09对植物致病细菌产生拮抗作用。
4.根据权利要求2所述的辣椒溶杆菌CK09在植物病原真菌拮抗作用中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）选取辣椒溶杆菌CK09单菌落接种于无菌的R2A液体培养基中，制得辣椒溶杆菌CK09菌液留待后步使用；
（2）将PDA培养基倾倒在平板上，将活化的植物病原真菌转接至新鲜的PDA培养基上；
（3）在PDA培养基上垂直放置牛津杯，向牛津杯中加入步骤（1）中制得的辣椒溶杆菌CK09菌液；
（4）将平板移入培养箱中，水平静置培养5~7天，观察抑菌圈并测量抑菌圈的直径，辣椒溶杆菌CK09对植物病原真菌产生拮抗作用。
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