CN109097280A - 一种土壤拮抗菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤拮抗菌的分离方法，涉及微生物技术领域，包括以下步骤：A：准备原料、B：制备土壤悬液、C：稀释、D：制备分离培养基、E：培养、F：挑选分离、G：制备指示菌平板以及H：筛选。本发明通过稀释分离法将拮抗菌从土壤中分离出来，通过向培养基中加入酚液来筛选出其中的放线菌，通过指示菌平板对峙法来筛选出其中抑菌效果最强的拮抗菌，在被开发为生防菌制剂用于对植物病害的生物防治上，具有良好的市场应用前景。本发明简化了拮抗菌分离的步骤，能够快速的将拮抗菌从土壤中分离出来，提高了拮抗菌的分离成功率以及分离效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种土壤拮抗菌的分离方法。
背景技术
目前，对植物病害的防治主要以化学防治为主，然而化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及致病菌产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们公认为是21世纪理想的药剂。
微生物农药是生物农药的重要组成部分，主要包括微生物活体农药和微生物代谢产物农药。微生物农药的发现和运用已有半个多世纪，在此期间，国内外专家相继研究出了微生物农用杀虫剂、杀菌剂和除草剂等，并且部分产品已进入了市场，如苏云金芽孢杆菌作为微生物杀虫剂和枯草芽孢杆菌作为微生物杀菌剂等已在病虫害防治中得以广泛应用，在农业生产过程中发挥着重要的作用。用于制备微生物农药的微生物来源广泛，可从动植物体、土壤、水体等自然环境中分离获得。
目前分离得到的大多数拮抗菌都来源于土壤，一般的拮抗菌分离方法虽然能够分离出拮抗菌，但是却不能筛选出其中抑菌效果最强的拮抗菌，而且筛选的过程中拮抗菌还容易受到其他菌种的污染。因此，发明一种土壤拮抗菌的分离方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种土壤拮抗菌的分离方法，解决了现有的拮抗菌分离方法不能从一群拮抗菌中筛选出抑菌效果最强的拮抗菌问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种土壤拮抗菌的分离方法，包括以下步骤：
A：准备原料：从太子参及茶叶主产区采集一定量的土壤样品，准备一定量的燕麦粉、琼脂和纯净水；
B：制备土壤悬液：将采集的土壤样品放入大小适中的容器内(三角瓶)，然后将纯净水倒入容器内进行土壤湿润，直至淹没土壤，振荡5-7min，使土壤样品充分扩散，得到土壤悬液；
C：稀释：用无菌移液管吸收1ml的土壤悬液，将其注入9ml的无菌水中，如此重复，直至得到浓度为10-3-10-5的土壤稀释液；
D：制备分离培养基：向5-10g的燕麦粉中加入800-1000ml的纯净水，然后在沸水浴上加热1-2h，然后用纱布过滤并加水补足800-1000ml，然后向溶液中加入琼脂，待琼脂熔化后等分灭菌，待溶液自然冷却至30℃时，将其倒入培养皿中，待培养基冷却至固体后备用；
E：培养：将不同浓度的土壤稀释液分别倒入不同的培养皿中，培养3-5天；
F：挑选分离：从培养基中挑选出多个单菌落，对单菌落进行转接纯化，然后根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，然后将剩余的单菌落分别转接至不同的高氏一号培养基中进行培养，培养时间为5-7天，得到放线菌菌落；
G：制备指示菌平板：首先制备牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基平板，然后无菌打孔器打取新鲜培养的茶炭疽病原菌和太子参叶斑病病原菌的菌落，转接于燕麦粉葡萄糖琼脂培养基平板上，制成指示菌平板。
H：筛选：将分离培养的放线菌菌落接种于高氏合成1号培养基平板上，培养一段时间后，在有菌生长处用打孔器打取菌落，接种至指示菌平板中央，同时设立只加植物病原菌而不加放线菌的平板作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养，待对照中植物病原菌长满整个培养皿时测量放线菌菌落的抑菌带宽度，比较各放线菌菌株抑菌带的大小，从中筛选出对植物病原菌抑菌能力最强的菌株，最终得到抑菌能力强的拮抗菌。
可选的，步骤A中的土壤样品为表层一下5-15cm处的土壤。
可选的，步骤C内重复的过程中，每重复一次，需更换一支无菌移液管，且操作时管尖不得触碰液面，以减少稀释的误差。
可选的，步骤E中培养皿中的培养基为燕麦粉葡萄糖琼脂培养基，培养的温度为30-32℃。
可选的，步骤F中高氏一号培养基培养的温度为26-28℃。
可选的，步骤F中转接单菌菌落之前，先向高氏一号培养基中加入2-4ml的10％浓度的酚液。
可选的，步骤G中培养基平板的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
可选的，步骤G中培养基平板的制备条件为：pH为7.0-7.2，温度为120-130℃，高压灭菌10-30min。
可选的，步骤H中抑菌带宽度为：放线菌菌落边缘至植物病原菌菌落边缘的距离。
可选的，步骤H中带放线菌和不带放线菌的平板对峙培养3-7天。
(三)有益效果
本发明提供了一种土壤拮抗菌的分离方法，具备以下有益效果：
(1)、本发明通过稀释分离法将拮抗菌从土壤中分离出来，通过向培养基中加入酚液来筛选出其中的放线菌，通过指示菌平板对峙法来筛选出其中抑菌效果最强的拮抗菌，在被开发为生防菌制剂用于对植物病害的生物防治上，具有良好的市场应用前景。
(2)、本发明简化了拮抗菌分离的步骤，能够快速的将拮抗菌从土壤中分离出来，提高了拮抗菌的分离成功率以及分离效率。
(3)、本发明工艺简单，设备要求低，可操作性强，具有良好的社会推广应用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种土壤拮抗菌的分离方法，包括以下步骤：
A：准备原料：从太子参及茶叶主产区采集一定量的土壤样品，土壤样品为表层一下5cm处的土壤，并准备一定量的燕麦粉、琼脂和纯净水；
B：制备土壤悬液：将采集的土壤样品放入大小适中的容器内(三角瓶)，然后将纯净水倒入容器内进行土壤湿润，直至淹没土壤，振荡5min，使土壤样品充分扩散，得到土壤悬液；
C：稀释：用无菌移液管吸收1ml的土壤悬液，将其注入9ml的无菌水中，如此重复，直至得到浓度为10-3的土壤稀释液，重复的过程中，每重复一次，需更换一支无菌移液管，且操作时管尖不得触碰液面，以减少稀释的误差；
D：制备分离培养基：向5g的燕麦粉中加入800ml的纯净水，然后在沸水浴上加热1h，然后用纱布过滤并加水补足800ml，然后向溶液中加入琼脂，待琼脂熔化后等分灭菌，待溶液自然冷却至30℃时，将其倒入培养皿中，待培养基冷却至固体后备用；
E：培养：将不同浓度的土壤稀释液分别倒入不同的培养皿中，培养皿中的培养基为燕麦粉葡萄糖琼脂培养基，培养的温度为30℃，培养3天；
F：挑选分离：从培养基中挑选出多个单菌落，对单菌落进行转接纯化，然后根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，然后将剩余的单菌落分别转接至不同的高氏一号培养基中进行培养，培养时间为5天，培养的温度为26℃，得到放线菌菌落，转接单菌菌落之前，先向高氏一号培养基中加入2ml的10％浓度的酚液；
G：制备指示菌平板：首先制备牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基平板，培养基平板的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，培养基平板的制备条件为：pH为7.0，温度为120℃，高压灭菌10min，然后无菌打孔器打取新鲜培养的茶炭疽病原菌和太子参叶斑病病原菌的菌落，转接于燕麦粉葡萄糖琼脂培养基平板上，制成指示菌平板。
H：筛选：将分离培养的放线菌菌落接种于高氏合成1号培养基平板上，培养一段时间后，在有菌生长处用打孔器打取菌落，接种至指示菌平板中央，同时设立只加植物病原菌而不加放线菌的平板作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养，带放线菌和不带放线菌的平板对峙培养3天，待对照中植物病原菌长满整个培养皿时测量放线菌菌落的抑菌带宽度，抑菌带宽度为：放线菌菌落边缘至植物病原菌菌落边缘的距离，比较各放线菌菌株抑菌带的大小，从中筛选出对植物病原菌抑菌能力最强的菌株，最终得到抑菌能力强的拮抗菌。
实施例2：
一种土壤拮抗菌的分离方法，包括以下步骤：
A：准备原料：从太子参及茶叶主产区采集一定量的土壤样品，土壤样品为表层一下10cm处的土壤，并准备一定量的燕麦粉、琼脂和纯净水；
B：制备土壤悬液：将采集的土壤样品放入大小适中的容器内(三角瓶)，然后将纯净水倒入容器内进行土壤湿润，直至淹没土壤，振荡6min，使土壤样品充分扩散，得到土壤悬液；
C：稀释：用无菌移液管吸收1ml的土壤悬液，将其注入9ml的无菌水中，如此重复，直至得到浓度为10-4的土壤稀释液，重复的过程中，每重复一次，需更换一支无菌移液管，且操作时管尖不得触碰液面，以减少稀释的误差；
D：制备分离培养基：向7g的燕麦粉中加入900ml的纯净水，然后在沸水浴上加热1.5h，然后用纱布过滤并加水补足900ml，然后向溶液中加入琼脂，待琼脂熔化后等分灭菌，待溶液自然冷却至30℃时，将其倒入培养皿中，待培养基冷却至固体后备用；
E：培养：将不同浓度的土壤稀释液分别倒入不同的培养皿中，培养皿中的培养基为燕麦粉葡萄糖琼脂培养基，培养的温度为31℃，培养4天；
F：挑选分离：从培养基中挑选出多个单菌落，对单菌落进行转接纯化，然后根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，然后将剩余的单菌落分别转接至不同的高氏一号培养基中进行培养，培养时间为6天，培养的温度为27℃，得到放线菌菌落，转接单菌菌落之前，先向高氏一号培养基中加入3ml的10％浓度的酚液；
G：制备指示菌平板：首先制备牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基平板，培养基平板的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，培养基平板的制备条件为：pH为7.1，温度为125℃，高压灭菌20min，然后无菌打孔器打取新鲜培养的茶炭疽病原菌和太子参叶斑病病原菌的菌落，转接于燕麦粉葡萄糖琼脂培养基平板上，制成指示菌平板。
H：筛选：将分离培养的放线菌菌落接种于高氏合成1号培养基平板上，培养一段时间后，在有菌生长处用打孔器打取菌落，接种至指示菌平板中央，同时设立只加植物病原菌而不加放线菌的平板作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养，带放线菌和不带放线菌的平板对峙培养5天，待对照中植物病原菌长满整个培养皿时测量放线菌菌落的抑菌带宽度，抑菌带宽度为：放线菌菌落边缘至植物病原菌菌落边缘的距离，比较各放线菌菌株抑菌带的大小，从中筛选出对植物病原菌抑菌能力最强的菌株，最终得到抑菌能力强的拮抗菌。
实施例3：
一种土壤拮抗菌的分离方法，包括以下步骤：
A：准备原料：从太子参及茶叶主产区采集一定量的土壤样品，土壤样品为表层一下15cm处的土壤，并准备一定量的燕麦粉、琼脂和纯净水；
B：制备土壤悬液：将采集的土壤样品放入大小适中的容器内(三角瓶)，然后将纯净水倒入容器内进行土壤湿润，直至淹没土壤，振荡7min，使土壤样品充分扩散，得到土壤悬液；
C：稀释：用无菌移液管吸收1ml的土壤悬液，将其注入9ml的无菌水中，如此重复，直至得到浓度为10-5的土壤稀释液，重复的过程中，每重复一次，需更换一支无菌移液管，且操作时管尖不得触碰液面，以减少稀释的误差；
D：制备分离培养基：向10g的燕麦粉中加入1000ml的纯净水，然后在沸水浴上加热1-2h，然后用纱布过滤并加水补足1000ml，然后向溶液中加入琼脂，待琼脂熔化后等分灭菌，待溶液自然冷却至30℃时，将其倒入培养皿中，待培养基冷却至固体后备用；
E：培养：将不同浓度的土壤稀释液分别倒入不同的培养皿中，培养皿中的培养基为燕麦粉葡萄糖琼脂培养基，培养的温度为32℃，培养5天；
F：挑选分离：从培养基中挑选出多个单菌落，对单菌落进行转接纯化，然后根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，然后将剩余的单菌落分别转接至不同的高氏一号培养基中进行培养，培养时间为7天，培养的温度为28℃，得到放线菌菌落，转接单菌菌落之前，先向高氏一号培养基中加入4ml的10％浓度的酚液；
G：制备指示菌平板：首先制备牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基平板，培养基平板的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，培养基平板的制备条件为：pH为7.2，温度为130℃，高压灭菌30min，然后无菌打孔器打取新鲜培养的茶炭疽病原菌和太子参叶斑病病原菌的菌落，转接于燕麦粉葡萄糖琼脂培养基平板上，制成指示菌平板。
H：筛选：将分离培养的放线菌菌落接种于高氏合成1号培养基平板上，培养一段时间后，在有菌生长处用打孔器打取菌落，接种至指示菌平板中央，同时设立只加植物病原菌而不加放线菌的平板作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养，带放线菌和不带放线菌的平板对峙培养7天，待对照中植物病原菌长满整个培养皿时测量放线菌菌落的抑菌带宽度，抑菌带宽度为：放线菌菌落边缘至植物病原菌菌落边缘的距离，比较各放线菌菌株抑菌带的大小，从中筛选出对植物病原菌抑菌能力最强的菌株，最终得到抑菌能力强的拮抗菌。
通过以上三组实施例均可将拮抗菌从土壤中分离出来，其中第二组实施例分离的效率最好。本发明通过稀释分离法将拮抗菌从土壤中分离出来，通过向培养基中加入酚液来筛选出其中的放线菌，通过指示菌平板对峙法来筛选出其中抑菌效果最强的拮抗菌，在被开发为生防菌制剂用于对植物病害的生物防治上，具有良好的市场应用前景。
需要说明的是，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
A：准备原料：从太子参及茶叶主产区采集一定量的土壤样品，准备一定量的燕麦粉、琼脂和纯净水；
B：制备土壤悬液：将采集的土壤样品放入大小适中的容器内(三角瓶)，然后将纯净水倒入容器内进行土壤湿润，直至淹没土壤，振荡5-7min，使土壤样品充分扩散，得到土壤悬液；
C：稀释：用无菌移液管吸收1ml的土壤悬液，将其注入9ml的无菌水中，如此重复，直至得到浓度为10-3-10-5的土壤稀释液；
D：制备分离培养基：向5-10g的燕麦粉中加入800-1000ml的纯净水，然后在沸水浴上加热1-2h，然后用纱布过滤并加水补足800-1000ml，然后向溶液中加入琼脂，待琼脂熔化后等分灭菌，待溶液自然冷却至30℃时，将其倒入培养皿中，待培养基冷却至固体后备用；
E：培养：将不同浓度的土壤稀释液分别倒入不同的培养皿中，培养3-5天；
F：挑选分离：从培养基中挑选出多个单菌落，对单菌落进行转接纯化，然后根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，然后将剩余的单菌落分别转接至不同的高氏一号培养基中进行培养，培养时间为5-7天，得到放线菌菌落；
G：制备指示菌平板：首先制备牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基平板，然后无菌打孔器打取新鲜培养的茶炭疽病原菌和太子参叶斑病病原菌的菌落，转接于燕麦粉葡萄糖琼脂培养基平板上，制成指示菌平板。
H：筛选：将分离培养的放线菌菌落接种于高氏合成1号培养基平板上，培养一段时间后，在有菌生长处用打孔器打取菌落，接种至指示菌平板中央，同时设立只加植物病原菌而不加放线菌的平板作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养，待对照中植物病原菌长满整个培养皿时测量放线菌菌落的抑菌带宽度，比较各放线菌菌株抑菌带的大小，从中筛选出对植物病原菌抑菌能力最强的菌株，最终得到抑菌能力强的拮抗菌。
2.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤A中的土壤样品为表层一下5-15cm处的土壤。
3.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤C内重复的过程中，每重复一次，需更换一支无菌移液管，且操作时管尖不得触碰液面，以减少稀释的误差。
4.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤E中培养皿中的培养基为燕麦粉葡萄糖琼脂培养基，培养的温度为30-32℃。
5.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤F中高氏一号培养基培养的温度为26-28℃。
6.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤F中转接单菌菌落之前，先向高氏一号培养基中加入2-4ml的10％浓度的酚液。
7.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤G中培养基平板的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
8.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤G中培养基平板的制备条件为：pH为7.0-7.2，温度为120-130℃，高压灭菌10-30min。
9.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤H中抑菌带宽度为：放线菌菌落边缘至植物病原菌菌落边缘的距离。
10.根据权利要求1所述的一种土壤拮抗菌的分离方法，其特征在于：所述步骤H中带放线菌和不带放线菌的平板对峙培养3-7天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20181228 |