CN110607341A - 检测非抑菌固氮菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种检测非抑菌固氮菌的方法。该方法包括以下步骤：(1)获取土壤样本，将土壤样本接种于Ashby固体培养基中培养；(2)挑取部分或全部单菌落分别进行划线培养，分离获得多个单菌株；(3)挑取多个单菌株中的一个接种于Ashby液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵液；(4)获得去除该菌株的发酵液；(5)获得指示菌；(6)将指示菌接种于有氮源的培养基中，并向部分培养基中加入去除菌株的发酵液，进行培养，分别获得有氮源不加该发酵液的培养液和有氮源加该发酵液的培养液；(7)重复步骤(3)‑(6)；(8)对所有的培养液的生物量进行检测，根据生物量判断土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌。该方法快速准确。

Description

检测非抑菌固氮菌的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一种检测非抑菌固氮菌的方法。
背景技术
资源和环境问题是目前人类最关注的问题。化肥的大量使用和有机肥施用不足导致土壤养分比例失调，使得土壤质量下降。微生物肥料因具有肥效高、无毒、不污染环境等特点而成为化肥的有效替代品。微生物肥料所含有的微生物菌剂是其发挥作用的关键，尤其复合菌剂，对农作物生长增产及土壤综合治理起到重要作用。
固氮菌能够将空气中或土壤中的无机氮转化为有机氮，为植物提供营养，因此是一种很好的微生物菌剂，能够增加土壤的肥力。然而，具有抑制其他微生物生长的固氮菌(简称抑菌固氮菌)在固氮同时还产生广谱抗生素的抑制因子，抑制其他微生物生长，该抑菌固氮菌会造成土壤中的微生物单一化，不适合制成复合菌剂。不具有抑制其他微生物生长的固氮菌(简称非抑菌固氮菌)在固氮同时不会抑制其他微生物生长，适合制成复合菌剂。
目前筛选固氮菌的方法通常采用蒸馏-中和滴定法和分光光度法测定发酵产物中氨氮的含量，步骤繁琐，并且不能检测该固氮菌是否具有抑制其他微生物生长的特性。因此，需要一种能够检测固氮菌是抑菌固氮菌，还是非抑菌固氮菌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测非抑菌固氮菌的方法，能够快速准确地检测出土壤中是否含有非抑菌固氮菌。
为了实现上述目的，本发明提供一种检测非抑菌固氮菌的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取土壤样本，将所述土壤样本接种于Ashby固体培养基中培养；
(2)如果步骤(1)的培养结果是未出现单菌落，则所述土壤样本中不含有固氮菌；如果步骤(1)的培养结果是出现单菌落，则挑取部分或全部所述单菌落分别进行划线培养，分离获得多个单菌株；
(3)挑取所述多个单菌株中的一个单菌株接种于Ashby液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵液；
(4)去除所述发酵液中的菌株，获得去除该菌株的发酵液；
(5)将指示菌接种于种子培养基中进行培养，获得所述指示菌；
(6)将所述指示菌接种于有氮源的葡萄糖铵盐培养基中，并向部分有氮源的葡萄糖铵盐培养基中加入步骤(4)获得的所述去除菌株的发酵液，进行培养，分别获得有氮源不加该发酵液的培养液以及有氮源加该发酵液的培养液；
(7)重复步骤(3)-步骤(6)；
(8)对所有的有氮源不加该发酵液的培养液和所有的有氮源加该发酵液的培养液中的所述指示菌的生物量进行检测，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌。
如果土壤样品结成块状，则需要先对土壤样品进行研磨粉碎，以便于接种。
具体地，在步骤(8)中，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌包括：
如果部分或者所有的有氮源加该发酵液的培养液的OD600值大于所有的有氮源不加该发酵液的培养液的OD600值，则所述土壤样本中含有非抑菌固氮菌。
更具体地，如果部分有氮源加该发酵液的培养液的OD600值大于部分有氮源不加该发酵液的培养液的OD600值，并且小于另一部分有氮源不加该发酵液的培养液的OD600值，则所述土壤样本中即含有非抑菌固氮菌又含有抑菌固氮菌。
更具体地，部分或者所有的有氮源加该发酵液的培养液的OD600值与所有的有氮源不加该发酵液的培养液的OD600值的差值应符合差异性显著(p值＜0.05)。具体地：首先对平行OD600值组成的两组数做T检验，差异性显著的前提下比较大小。比较大小的OD600值为该组三个平行OD600值的平均数。
在本发明的一种优选实施方式中，所述方法还包括：(9)获取该非抑菌固氮菌。
具体地，所述Ashby固体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，16.0-20.0重量份的琼脂，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0。
更具体地，所述Ashby固体培养基由以下重量份的组分制成：10.0重量份的葡萄糖，0.2重量份的磷酸氢二钾，0.2重量份的硫酸镁，0.2重量份的氯化钠，0.1重量份的二水硫酸钙，5.0重量份的碳酸钙，18.0重量份的琼脂，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为7.2。
具体地，所述Ashby液体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0。
更具体地，所述Ashby液体培养基由以下重量份的组分制成：10.0重量份的葡萄糖，0.2重量份的磷酸氢二钾，0.2重量份的硫酸镁，0.2重量份的氯化钠，0.1重量份的二水硫酸钙，5.0重量份的碳酸钙，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为7.2。
具体地，在步骤(4)中，所述去除每一个所述发酵液中的菌株为，以8000r/min对所述发酵液进行离心10min，取上清液，之后利用滤膜对所述上清液进行过滤除菌。
具体地，在步骤(5)中，所述指示菌为非固氮微生物。
优选地，所述非固氮微生物为大肠杆菌或者植物乳杆菌。
更优选地，所述非固氮微生物为大肠杆菌。
优选地，在步骤(5)中，所述种子培养基为有氮源的葡萄糖铵盐培养基。
具体地，所述有氮源的葡萄糖铵盐培养基由以下重量份的组分制成：3.0-6.0重量份的氯化钠，0.15-0.25重量份的七水硫酸镁，0.05-0.20重量份的磷酸二氢铵，0.05-0.20重量份的磷酸氢二钾，1.0-10.0重量份的葡萄糖，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.0-8.0。
更具体地，所述有氮源的葡萄糖铵盐培养基由以下重量份的组分制成：5.0重量份的氯化钠，0.2重量份的七水硫酸镁，1.0重量份的磷酸二氢铵，1.0重量份的磷酸氢二钾，2.0重量份的葡萄糖，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.8。
本发明提供的检测非抑菌固氮菌的方法先利用Ashby固体培养基和Ashby液体培养基检测土壤中是否含有固氮菌，再进一步检测这些固氮菌中是否含有非抑菌固氮菌，因此，能够快速准确地检测土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌，为该土壤是否适合施用微生物复合肥提供参考依据。
本发明提供的检测非抑菌固氮菌的方法能够筛选出非抑菌固氮菌。
本发明提供的检测非抑菌固氮菌的方法灵敏度高。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出实施例1中的大肠杆菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
以下实施例所使用的培养基的配方如下：
Ashby(阿须贝)固体培养基的配方是：葡萄糖10.0g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2。
Ashby(阿须贝)液体培养基的配方是：葡萄糖10.0g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5.0g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2。
无氮源的葡萄糖铵盐培养基(以下简称培养基I)的配方是：氯化钠5.0g，七水硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1.0g，葡萄糖2.0g，蒸馏水1000mL，pH值为6.8。
有氮源的葡萄糖铵盐培养基(以下简称培养基II)的配方是：氯化钠5.0g，七水硫酸镁0.2g，磷酸二氢铵1.0g，磷酸氢二钾1.0g，葡萄糖2.0g，蒸馏水1000mL，pH值为6.8。
将上述培养基在115℃条件下湿热灭菌20min后，备用。
实施例1
(1)采集野山丘土壤样本足量。取土壤样本约1g，适当研碎，采用弹土接种方式接种到阿须贝(Ashby)固体培养基平板上，30℃静置培养3天。
(2)挑取步骤(1)中培养所得的单菌落，三区划线法分离获得5株单菌株，分别编号菌株①、菌株②、菌株③、菌株④和菌株⑤，用20％甘油保藏于-80℃冰箱中。
(3)将步骤(2)获得的菌株①接种于Ashby液体培养基中，以200r/min转速，30℃培养48h，获得该单菌株的发酵液。
(4)取步骤(3)获得的发酵液2mL，8000r/min离心10min，取上清，0.45um膜过滤除菌后，获得去除菌株①的发酵液，将其转移到另一2mL无菌离心管备用。
(5)将活化后的大肠杆菌接种于种子培养基中，该种子培养基为培养基II，以200r/min的转速，37℃培养12h。
(6)分别量取200μL和150μL培养基I分别注入96孔板的A行和B行；分别量取150μL和200μL培养基II分别注入该96孔板的C行和D行，量取50μL去除菌株①的发酵液作为可能的氮源和(或)抑制因子注入B行和C行，取10μL对数期的OD600＝0.8的指示菌种子液，该指示菌的生长曲线如图1所示，分别接种于培养基I和培养基II中，37℃静置培养8h。
(7)将96孔板放入酶标仪，在600nm波长处测定OD值表征指示菌的生物量，结果如表1。选出A行生物量趋于零，B行、C行和D行均有显著生物量且C行OD600值最大的菌株即为固氮非抑菌微生物。根据表1的结果，菌株①即是一株非抑菌固氮菌。
表1菌株①对应大肠杆菌作为指示菌的生物量
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：将本发明实施例1中所述步骤(5)中作为指示菌的大肠杆菌替换为植物乳杆菌，培养条件为30℃培养12h。实施例1中的步骤(6)中培养条件为30℃培养12h，结果如表2。
表2菌株①对应植物乳杆菌作为指示菌的生物量
对比表1和表2可知，相对于植物乳杆菌作为指示菌，大肠杆菌作为指示菌，大肠杆菌的传代时间远小于植物乳杆菌，因而培养相同时间大肠杆菌作为指示菌OD值较大，减小了数值偏小造成的误差，从而提高本发明的检测非抑菌固氮菌的方法的灵敏度。
实施例3-6
实施例3-6是在实施例1的步骤(1)和步骤(2)之后进行的，步骤(4)-步骤(7)与实施例1的步骤(4)-步骤(7)的区别仅在于，将菌株①替换为菌株②、菌株③、菌株④和菌株⑤。对这5株单菌株的固氮能力进行比较，结果如表3。
表3 5株单菌株对应大肠杆菌作为指示菌的生物量
由表3可知，指示菌在培养基I和5株菌发酵液上清组成的培养基中均能够生长，说明5株待筛选微生物均是固氮菌。其中，与培养基II混合的上清中，菌株③和菌株⑤对指示菌生长产生了抑制，并且菌株⑤的抑制性最强，此两株菌是抑菌固氮菌。与培养基I混合的上清中，菌株①、菌株②和菌株④生长均较为旺盛，且其上清在与培养基II混合中，对指示菌起到了一定的促进作用。相对于菌株①和菌株②，菌株④的固氮能力稍弱(请参见表3)，说明菌株④对指示菌生长的促进作用较小，因此，菌株①和菌株②的生长最为旺盛且对指示菌的促进作用最强，是高效固氮非抑菌微生物。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种检测非抑菌固氮菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获取土壤样本，将所述土壤样本接种于Ashby固体培养基中培养；
(2)如果步骤(1)的培养结果是未出现单菌落，则所述土壤样本中不含有固氮菌；如果步骤(1)的培养结果是出现单菌落，则挑取部分或全部所述单菌落分别进行划线培养，分离获得多个单菌株；
(3)挑取所述多个单菌株中的一个单菌株接种于Ashby液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵液；
(4)去除所述发酵液中的菌株，获得去除该菌株的发酵液；
(5)将指示菌接种于种子培养基中进行培养，获得所述指示菌；
(6)将所述指示菌接种于有氮源的葡萄糖铵盐培养基中，并向部分有氮源的葡萄糖铵盐培养基中加入步骤(4)获得的所述去除菌株的发酵液，进行培养，分别获得有氮源不加该发酵液的培养液以及有氮源加该发酵液的培养液；
(7)重复步骤(3)-步骤(6)；
(8)对所有的有氮源不加该发酵液的培养液和所有的有氮源加该发酵液的培养液中的所述指示菌的生物量进行检测，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，根据所述生物量的大小判断所述土壤样品中是否含有非抑菌固氮菌包括：
如果部分或者所有的有氮源加该发酵液的培养液的OD600值大于所有的有氮源不加该发酵液的培养液的OD600值，则所述土壤样本中含有非抑菌固氮菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(9)获取该非抑菌固氮菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ashby固体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，16.0-20.0重量份的琼脂，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0；
所述Ashby液体培养基由以下重量份的组分制成：8.0-15.0重量份的葡萄糖，0.15-0.25重量份的磷酸氢二钾，0.15-0.25重量份的硫酸镁，0.15-0.25重量份的氯化钠，0.05-0.15重量份的二水硫酸钙，3.0-6.0重量份的碳酸钙，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.5-8.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述去除每一个所述发酵液中的菌株为，以8000r/min对所述发酵液进行离心10min，取上清液，之后利用滤膜对所述上清液进行过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述指示菌为非固氮微生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物为大肠杆菌或者植物乳杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述非固氮微生物为大肠杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述种子培养基为有氮源的葡萄糖铵盐培养基。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述有氮源的葡萄糖铵盐培养基由以下重量份的组分制成：3.0-6.0重量份的氯化钠，0.15-0.25重量份的七水硫酸镁，0.05-0.20重量份的磷酸二氢铵，0.05-0.20重量份的磷酸氢二钾，1.0-10.0重量份的葡萄糖，以及1000重量份的蒸馏水；pH值为6.0-8.0。
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