CN105331672A - 一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基及其应用，属于黄酒技术领域。本发明的黄酒中耐乙醇污染微生物检测培养基是采用无机营养成分、有机营养成分、碳水化合物、生长因子、抑制非有害菌的物质、天然提取物、表面活性剂通过混合调配、分装、灭菌等步骤配置而成。本发明的培养基针对性强，能够准确培养黄酒中高酒精耐受性的酸败微生物，适合于黄酒酿造、生产及贮存过程中污染微生物的监控。

Description

一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基及其应用，属于黄酒技术领域。

背景技术

黄酒是我国名族特色酒精饮料，是以稻米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒。黄酒具有低酒精度、营养丰富的特征深受我国消费者的喜爱，是国家重点扶植的传统产业。

黄酒，又称老酒，其典型特征是越陈越香。因此黄酒产品上市前一般都要经过长时间贮存陈酿以提高黄酒的风味品质。虽然黄酒在贮存前都要经过灭菌处理以杀死其中的所有微生物，但在整个黄酒生产贮存过程中贮存设备、管道、空气等诸多因素都可能导致有害微生物进入黄酒中。因此在黄酒贮存陈酿过程中，由于微生物引起的黄酒酸败变质现象时有发生，直接影响其外观、风味、营养物质含量，造成黄酒浑浊、酒精度下降、酸度下降，产生一种刺鼻的酸臭味，严重影响了黄酒的质量。而且随着黄酒大罐贮存技术的普遍使用，大罐中污染微生物造成的酸败现象对企业带来经济损失更加突出。

黄酒一般酒精含量在15％-20％之间，pH在3.0-5.0之间，贮存过程中处于相对厌氧的环境中，这种较高乙醇含量、低pH、厌氧环境中一般微生物难以生长。但在黄酒生产环境中却存在少数微生物能够在黄酒环境中生长繁殖，使黄酒腐败变质。因此对黄酒贮存过程中耐乙醇污染微生物的检测对于保障陈酿过程中黄酒的品质具有重要意义。

但目前还没有针对黄酒贮存陈酿过程中微生物分析检测的专用培养基和培养方法，对黄酒中这类耐乙醇污染微生物也缺乏深入的分析研究。因此为了更及时的监控黄酒陈酿过程中微生物的状况，黄酒行业急需开发一种针对性强、快速、简单的黄酒耐乙醇污染微生物培养检测培养基。

发明内容

为了解决上述问题，本发明针对黄酒贮存过程中污染微生物分析检测的紧迫性，提供一种培养速度快、便于观察计数、适合于高酒精度黄酒环境的检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基及其制备方法与应用。本发明的培养基是采用无机营养成分、有机营养成分、碳水化合物、生长刺激物质、天然提取物、表面活性剂通过混合调配、分装、灭菌等步骤配制而成。

本发明提供了一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基，每L中含有：

(1)碳源物质20-60g；

(2)氮源物质20-35g；

(3)表面活性剂0.3-1g；

(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物2-10g，番茄汁3-8g或含有等量番茄汁的番茄汁培养基；

(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠3-6g，无水乙醇50-200mL；

(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质，为以下任意一种或者两种以上的混合：甲瓦龙酸内酯2-50mg、甲瓦龙酸2-50g、浓缩黄酒10-200mL；

(7)无机营养物质：七水合硫酸镁0.1-1.0g，四水合硫酸锰0.01-1.0g，磷酸氢二钾1-5g，柠檬酸三铵1-5g；

(8)水：补加至1L；

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为固体培养基时，添加琼脂15-20g。

在本发明的一种实施方式中，所述碳源物质包括葡萄糖、果糖、麦芽糖。

在本发明的一种实施方式中，所述碳源物质为葡萄糖10-30g，果糖5-15g，麦芽糖4-15g。

在本发明的一种实施方式中，所述碳源物质为葡萄糖10.3-10.4g，果糖5.1-7.3g，麦芽糖4.6-5.0g。

在本发明的一种实施方式中，所述氮源物质包括酪蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨。

在本发明的一种实施方式中，所述氮源物质为酪蛋白胨10g，牛肉提取物5-10g，胰蛋白胨5-15g。

在本发明的一种实施方式中，所述氮源物质为酪蛋白胨10g，牛肉提取物7.6-7.8g，胰蛋白胨12.5g。

在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂为吐温80，亦可用吐温60。

在本发明的一种实施方式中，所述B族维生素及其他微量元素类物质为酵母提取物3.7-4.2g，番茄汁6g(或含有等量番茄汁的番茄汁培养基)。

在本发明的一种实施方式中，所述抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质为三水合乙酸钠4.5-5.8g，无水乙醇50-200mL；

在本发明的一种实施方式中，所述浓缩黄酒是由正常普通黄酒经旋蒸浓缩10倍可得。

在本发明的一种实施方式中，所述加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质为以下任意一种：甲瓦龙酸内酯50mg、甲瓦龙酸50g、浓缩黄酒100mL。

本发明还提供一种所述培养基的配置方法，包括如下步骤：

(1)将除乙醇外的其他成分混合，溶解于水中；

(2)条件pH至4.0-5.0；

(3)115-121℃灭菌12-20min；

(4)使用时，在无菌条件下加入无水乙醇。

在本发明的一种实施方式中，培养基为固体培养基时，是在步骤(3)之前加入琼脂；步骤(4)之后倾倒平板。

在本发明的一种实施方式中，培养基为液体试管培养基时，在步骤(2)之后进行试管分装，然后在进行灭菌；液体试管的总装液量要在试管容量的1/2左右。

本发明还提供一种利用所述培养基在黄酒污染微生物检测或筛选方面的应用。

所述应用，是将黄酒样接种于培养基中，于厌氧条件下培养。

所述培养是在30℃进行；液体培养基一般需要3-4天，固体培养基一般需要4-5天。

本发明的有益效果：

(1)采用本发明的培养基，通过合理搭配、协同作用，提高了培养基的选择度，可以有效培养和检测到黄酒耐乙醇污染微生物，而非污染微生物在培养基中不生长，检测准确性高、可靠度高。使用本发明的培养基，3-5天就可以实现污染微生物的检测，可以及时地监控黄酒陈酿过程中微生物的状况，减少企业损失；

(2)本发明的培养基，原料成本低、配制方法简单；培养基采用葡萄糖、果糖、麦芽糖等多种碳源，可以满足污染微生物对各类碳源的需求；酪蛋白胨、牛肉提取物和胰蛋白胨可以提供成分更丰富的氮源；表面活性剂，可以帮助微生物更有效的接触和吸收营养物质；酵母提取物和番茄汁，为污染微生物的生长提供必不可少的B族维生素及其他微量元素；三水合乙酸钠和乙醇，可以抑制非黄酒污染微生物的增殖，提高培养基的选择度；甲瓦龙酸和/或甲瓦龙酸内酯，是酸败黄酒中污染微生物的生长因子，可以促进微生物的生长；无机物为污染微生物的生长提供必要的无机营养物质；水和/或琼脂，不作为营养物质，用来溶解、凝固培养基成分。

(3)本发明的培养基可以用于液体试管培养、平板涂布培养和平板划线培养，既可用于黄酒中耐乙醇污染微生物的检测分析，也可用于黄酒中耐乙醇污染微生物培养研究。

附图说明

图1.采用实施例1的固体培养基检测到的黄酒中耐乙醇污染微生物菌落；

图2.采用实施例2的固体培养基检测到的黄酒中耐乙醇污染微生物菌落；

图3.采用实施例3的固体培养基检测到的黄酒中耐乙醇污染微生物菌落；

图4.采用实施例4的固体培养基检测到的黄酒中耐乙醇污染微生物菌落；

图5.采用实施例5的固体培养基检测到的微生物菌落；

图6.采用实施例6的固体培养基检测到的微生物菌落。

具体实施方式

结合如下实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：培养基配方及配制方法

一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基，其液体配方1L的添加量如下：(1)碳源物质：葡萄糖10.3g，果糖7.3g，麦芽糖4.6g；(2)氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物7.6g，胰蛋白胨12.5g；(3)表面活性剂：吐温800.5g；(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物3.7g，番茄汁6g；(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠5.8g，无水乙醇50mL；(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质：甲瓦龙酸内酯50mg；(7)无机营养物质：七水合硫酸镁0.2g，四水合硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g；(8)补加水至1000mL。

培养基的具体配置需包括下述步骤：

(1)将上述配方里的成分(除乙醇外)混合，溶于0-1000mL去离子水中；

(2)利用浓盐酸将pH值调节到4.5-5.0；

(3)121℃高压灭菌15min，可暂存于2-10℃无菌保藏备用；

(4)使用时在无菌条件下加入无水乙醇。

如果是制备固体培养基，在步骤(2)后加入琼脂，灭菌后加入无水乙醇，倾倒平板。

如果是制备液体试管，在步骤(2)后进行试管分装，高压灭菌，使用前加入无水乙醇，液体试管的总装液量要在试管容量的1/2左右。

实施例2：培养基配方

培养基，其液体配方1L的添加量如下：

(1)碳源物质：葡萄糖30g，果糖5g，麦芽糖12g；(2)氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物5g，胰蛋白胨15g；(3)表面活性剂：吐温800.3g；(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物2g，番茄汁8g；(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠3g，无水乙醇200mL；(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质：甲瓦龙酸内酯5mg，甲瓦龙酸25g，浓缩黄酒10mL；(7)无机营养物质：七水合硫酸镁0.2g，四水合硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g；(8)补加水至1000mL。

实施例3：培养基配方

培养基，其液体配方1L的添加量如下：

(1)碳源物质：葡萄糖15g，果糖15g，麦芽糖15g；(2)氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物10g，胰蛋白胨5g；(3)表面活性剂：吐温801g；(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物10g，含有3g番茄汁的番茄汁培养基；(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠5g，无水乙醇100mL；(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质：甲瓦龙酸50g；(7)无机营养物质：七水合硫酸镁1g，四水合硫酸锰0.01g，磷酸氢二钾5g，柠檬酸三铵1g；(8)补加水至1000mL。

实施例4：培养基配方

培养基，其液体配方1L的添加量如下：

(1)碳源物质：葡萄糖25g，果糖15g，麦芽糖15g；(2)氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物8g，胰蛋白胨10g；(3)表面活性剂：吐温600.8g；(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物6g，番茄汁6g；(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠5g，无水乙醇100mL；(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质：浓缩黄酒100mL；(7)无机营养物质：七水合硫酸镁0.1g，四水合硫酸锰1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸三铵5g；(8)补加水至1000mL。

实施例5：对照培养基配方及配制方法

培养基，其液体配方1L的添加量如下：

(1)碳源物质：葡萄糖5g；(2)氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物10g；(3)表面活性剂：吐温801g；(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物5g，番茄汁6g；(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠5g；(6)无机营养物质：七水合硫酸镁0.2g，四水合硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g；(7)补加水至1000mL。

培养基的具体配置需包括下述步骤：

(1)将上述配方里的成分混合，溶于1000mL去离子水中；

(2)利用浓盐酸将pH值调节到4.5-5.0；

(3)121℃高压灭菌15min，可暂存于2-10℃无菌保藏备用。

如果是制备固体培养基，在步骤(2)后加入琼脂，灭菌后倾倒平板。

如果是制备液体试管，在步骤(2)后进行试管分装，高压灭菌后使用，液体试管的总装液量要在试管容量的1/2左右。

实施例6：对照培养基配方

培养基，其液体配方1L的添加量如下：

葡萄糖20g，酪蛋白胨20g，酵母提取物10g，加水1000mL至溶解。

培养基的具体配置需包括下述步骤：

(1)将上述配方里的成分混合，溶于1000mL去离子水中；

(2)利用浓盐酸将pH值调节到4.5-5.0；

(3)121℃高压灭菌15min，可暂存于2-10℃无菌保藏备用。

如果是制备固体培养基，在步骤(2)后加入琼脂，灭菌后倾倒平板。

如果是制备液体试管，在步骤(2)后进行试管分装，高压灭菌后使用，液体试管的总装液量要在试管容量的1/2左右。

实施例7：培养基用于检测或筛选黄酒中耐乙醇污染微生物

利用实施例1-6配置的培养基，进行黄酒中耐乙醇污染微生物的检测。

酸败黄酒中耐乙醇污染微生物的检测流程如下：将酸败黄酒接入液体试管中，置于厌氧条件下30℃培养；将培养出的菌液稀释涂布，置于厌氧条件下30℃培养；将长出的单菌落挑出接入液体试管中，置于厌氧条件下30℃培养；将培养出的菌液进行平板划线，置于厌氧条件下30℃培养，长出的单菌落即为目标菌种。

液体培养基一般需要3-4天，固体培养基一般需要4-5天。

检测结果：

实施例1、2、3、4、5、6均有微生物生长，但从微生物形态来看，实施例1、2、3、4、5为乳酸菌，菌体形态较小，表面光滑，而实施例6培养出的微生物为酵母菌，菌体形态较大。

检测准确性的验证：

挑取上一步平板培养得到的微生物，每个平板上各挑取20个接种到正常黄酒中，进行黄酒反向酸败实验，对微生物的检测准确性进行验证。结果显示，实施例1、2、3、4的培养基上挑取的微生物均可以使正常黄酒发生酸败，导致正常黄酒的酸度下降、酒体变浑浊；而实施例5、6培养出的微生物在正常黄酒中均不能生长，不能使正常黄酒酸败，即这些微生物并不是污染微生物。

实施例8：培养基成分对检测或筛选污染微生物的有效性、准确性影响

配置培养基，不添加甲瓦龙酸(即不添加加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质)，其他成分与实施例3一致。添加琼脂配制成固体培养基，使用实施例7的方法用于进行检测黄酒污染微生物。培养结果显示：虽然也有微生物被培养出来，但是培养时间延长，大约要7天时间。最重要的是，在培养出的微生物中，并不是所有的微生物都能使正常黄酒发生酸败，也就是说培养得到的微生物不一定是污染微生物，培养基的检测准确性降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种检测黄酒中耐乙醇污染微生物的培养基，其特征在于，所述培养基每L中，含有：

(1)碳源物质20-60g；

(2)氮源物质20-35g；

(3)表面活性剂0.3-1g；

(4)B族维生素及其他微量元素类物质：酵母提取物2-10g，番茄汁3-8g或含有等量番茄汁的番茄汁培养基；

(5)抑制黄酒非有害厌氧菌生长类物质：三水合乙酸钠3-6g，无水乙醇50-200mL；

(6)加快各种黄酒有害厌氧菌生长类物质：甲瓦龙酸内酯2-50mg，甲瓦龙酸2-50g，浓缩黄酒10-200mL；

(7)无机营养物质：七水合硫酸镁0.1-1.0g，四水合硫酸锰0.01-1.0g，磷酸氢二钾1-5g，柠檬酸三铵1-5g；

(8)水：补加至1L；

当培养基为固体培养基时，添加琼脂15-20g。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碳源物质包括葡萄糖、果糖、麦芽糖。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述氮源物质包括酪蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碳源物质为葡萄糖10-30g，果糖5-15g，麦芽糖4-15g。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述氮源物质：酪蛋白胨10g，牛肉提取物5-10g，胰蛋白胨5-15g。

6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述表面活性剂为吐温80或吐温60。

7.权利要求1-6任一所述培养基在黄酒污染微生物检测或筛选方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将黄酒样接种于培养基中，于厌氧条件下培养。

9.权利要求1-6任一所述培养基在培养黄酒中耐乙醇污染微生物方面的应用。