CN104178553A - 一种检测调味品防腐能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测调味品防腐能力的方法，包括以下步骤：1)用准备好的测试菌种制备菌悬液；2)在供试品中接种制备好的菌悬液；3)在刚接种时及每隔预定时间段，从接种后的供试品中取等量的样品，检测样品中所含的菌数；4)将每隔预定时间段检测得到的菌数与刚接种的初始菌数进行比较，如差值≤0，则判定所述供试品的防腐能力合格，且差值越小，判断所述供试品的防腐能力越强。本发明根据调味品的特性给出了防腐能力的判断标准，对新产品开发、防腐剂选择、产品防腐能力快速评价、保障产品微生物安全性方面有着重要意义。

Description

一种检测调味品防腐能力的方法

技术领域

本发明涉及调味品检测技术领域，尤其涉及一种检测调味品防腐能力的方法。

背景技术

酱油、蚝油、豆酱等调味品深受消费者的喜爱，但一次食用的量较少，在开封后一般需要一段时间才能用完，而产品在开封后，由于受环境中微生物的污染，再加上本身营养成分比较丰富，就会比较容易发生腐败变质现象，使产品风味、质量及外观受损，不仅可导致巨额经济损失，还可产生对人类健康有影响的有毒次级代谢物。因此，许多调味品不仅要求货架期内的微生物安全性，开封后也需要有一定的抑菌能力，才能抑制微生物的生长，延长使用期，满足消费者的需要。

货架期的微生物安全性是所有食品都需要保证的，添加防腐剂是抑制微生物生长繁殖，延长食品货架期的主要方法之一。但食品的货架期与其防腐能力并没有必然关系，货架期取决于食品的配方、加工工艺、包装和贮藏条件，目前关于食品货架期的研究，针对的是产品未开封前保持食品质量的期限。然而，产品开封后失去了包装的保护，使用期的长短则取决于产品对使用过程中可能引入的微生物的抑制能力，而目前业界对开封后调味品产品的防腐能力的研究较少，也缺少较好的防腐能力检测方法。

在调味品的研发和生产中，对其防腐能力进行评价是保证产品品质的一个重要环节。不同的调味品配方及加工方法不同，其防腐能力也不同，如果防腐能力过低，就可能在使用过程中发生腐败变质现象，影响其价值。可以根据需要添加防腐剂来提高其防腐能力，但应该添加何种防腐剂，以及添加多少为合适目前并没有合适的方法来测定。不少企业对生产出的调味品本身的防腐能力并不清楚，在产品中添加防腐剂往往是从经验上避免其可能出现的变质，对这种防腐剂在具体产品中的所能发挥的作用也没有合适的方法来检测，防腐剂的添加就比较盲目。

目前，关于防腐剂抑菌能力的测定有抑菌圈法、稀释平板法等方法，可用于比较防腐剂本身对各种菌抑菌能力的大小。然而，当防腐剂添加到产品中时，由于添加量及食品成分、pH等因素的影响，防腐剂的实际抑菌能力与培养基所检测的结果可能不同，因此防腐剂的抑菌能力不能代表产品的防腐能力。

为了评价产品开封后的使用期或防腐能力，有研究将产品模拟开盖后的使用情况每天暴露于普通室内一定时间，然后进行保存试验，但由于环境温度不同、湿度条件不同，可能存在的微生物数量或种类也不同，此法所测定的防腐能力并不具有代表性；而且，不同时间、地点进行试验所得的结果也不具备可比性。

微生物挑战性试验是一种测试和评价药品抑菌剂效力的方法，该试验能够模拟产品的生产和使用过程中受到高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适条件，使得测试结果更接近“残酷的现实”，能经受“严峻的考验”，从而保证产品避免由微生物污染而造成的损失和保障消费者的健康。在化妆品领域，许多企业也参照此法对化妆品的防腐效能进行评价；但针对食品，并无此类标准的防腐能力评价方法。由于不同的产品性质不同，测试的菌种选择、检测时间、结果判断标准并不能通用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测调味品防腐能力的方法，该方法可解决现有的调味品防腐能力无科学、快速评价方法的难题，提高产品研发效率、节约研发成本，保证产品微生物安全性。

本发明所采用的技术方案是：

一种检测调味品防腐能力的方法，包括以下步骤：

1)用准备好的测试菌种制备菌悬液；

2)在供试品中接种制备好的菌悬液；

3)在刚接种时及每隔预定时间段，从接种后的供试品中取等量的样品，检测样品中所含的菌数；

4)将每隔预定时间段检测得到的菌数与刚接种的初始菌数进行比较，如差值≤0，则判定所述供试品的防腐能力合格，且差值越小，判断所述供试品的防腐能力越强。

优选地，所述测试菌种选用标准菌种或从产品中分离到的菌种；或者，所述测试菌种既选用标准菌种又选用从产品中分离到的菌种。

优选地，所述标准菌种包括细菌、霉菌、酵母菌中的至少一种。其中，霉菌和酵母菌为真菌。

优选地，所述测试菌种选用标准菌种，根据供试品的水分活度aw在标准菌种中选用适当的菌种：1)如aw≥0.90，选用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；2)如0.85<aw<0.90，选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；3)如aw≤0.85，选用白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)。

优选地，步骤2)具体为：选择接种细菌时，将细菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，在34℃～36℃的温度下培养18～24小时；选择接种霉菌时，将霉菌的新鲜培养物接种至PDA培养基中，在25～28℃的温度下培养5～7天；选择接种酵母菌时，将酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基中，在25～28℃的温度下培养48～52小时；上述各培养物用无菌生理盐水稀释即制成所述菌悬液。

优选地，步骤2)中，选用细菌制备的菌悬液浓度为10⁷～10⁸CFU/mL，选用真菌制备的菌悬液浓度为10⁶～10⁷CFU/mL。

优选地，步骤3)中，接种菌悬液的体积小于供试品体积的0.5％～1％；如接种细菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的接种后供试品中细菌量为10⁵～10⁶CFU，如接种真菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的供试品中真菌量为10⁴～10⁵CFU。

优选地，接种后的供试品在检测期间均置于20～25℃的温度下贮存，贮存时间为27～29天。

优选地，步骤4)中，将供试品样品采用无菌生理盐水稀释成多个稀释级，采用平皿菌落计数法测定每份供试品样品中所含的菌数。

优选地，所述预定时间段为6～15天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过向待测调味品产品中接入一定量的挑战性微生物，定期检测微生物生长情况，以此判断产品或防腐剂的防腐能力，方法科学、操作简单，结果准确，重复性好，解决了现有的调味品防腐能力无科学、快速评价方法的难题，提高产品研发效率、节约研发成本，提升产品品质。

进一步地，本发明根据产品的水分活度和代表性挑战微生物的特性对接入菌种进行了简化，与常规的挑战性试验相比，本发明的技术方案减少了工作量、节约了成本。

本发明根据调味品的特性给出了防腐能力的判断标准，对新产品开发、防腐剂选择、产品防腐能力快速评价、保障产品微生物安全性方面有着重要意义。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明进一步说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明实施例的一种检测调味品防腐能力的方法，通过向被测样品中接入一定量的挑战性微生物，在规定温度下培养接种试样；在培养期内，于规定时间点取样，测定接种样品中剩余的存活菌浓度，通过对比菌浓度的下降值，判定样品防腐能力是否符合规定。具体步骤如下：

1)用准备好的测试菌种制备菌悬液；

2)在供试品中接种制备好的菌悬液；

3)在刚接种时及每隔预定时间段，从接种后的供试品中取等量的样品，检测样品中所含的菌数；

4)将每隔预定时间段检测得到的菌数与刚接种的初始菌数进行比较，如差值≤0，则判定所述供试品的防腐能力合格，且差值越小，判断所述供试品的防腐能力越强。

其中，步骤2)具体为：取包装完整的供试品，直接接种试验菌，或取适量供试品转移适宜的无菌容器中，再接种试验菌；接种后充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布；然后将接种的供试品在一定温度下贮存。

其中，所述测试菌种选用标准菌种或从产品中分离到的菌种；或者，所述测试菌种既选用标准菌种又选用从产品中分离到的菌种。

其中，所述标准菌种包括细菌、霉菌、酵母菌中的至少一种。细菌又包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。

其中，所述标准菌种包括：

大肠埃希菌(Escherichia coli)，如保藏号为CMCC(B)44102的菌种；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，如保藏号为CMCC(B)26003的菌种；

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，如保藏号为CMCC(B)10104的菌种；

白色念珠菌(Candida albicans)，如保藏号为CMCC(F)98001的菌种；

黑曲霉(Aspergillus niger)，如保藏号为CMCC(F)98003的菌种。

微生物的生长繁殖需要一定的水分活度条件，各种微生物保持生长所需的最低水分活度值不同，大多数败坏食品的细菌需要的最低水分活度为0.9，酵母菌为0.88左右，霉菌为0.80，耐盐性细菌为0.75。因此，可根据水分活度判断对于引起食品腐败变质的常见微生物，据报道，大肠肝菌生长的最低水分活度是0.94，金花色葡萄球菌是0.86。因此，本发明所选用的标准菌种可根据产品水分活度进行简化，具体如下：1)如aw≥0.90，选用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；2)如0.85<aw<0.90，选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；3)如aw≤0.85，选用白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)。

本发明所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

其中，步骤2)具体为：选择接种细菌时，将细菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，在34℃～36℃的温度下培养18～24小时；选择接种霉菌时，将霉菌的新鲜培养物接种至PDA培养基中，在25～28℃的温度下培养5～7天；选择接种酵母菌时，将酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基中，在25～28℃的温度下培养48～52小时；上述各培养物用无菌生理盐水稀释即制成所述菌悬液。

其中，步骤2)中，选用细菌制备的菌悬液浓度为10⁷～10⁸CFU/mL，选用真菌制备的菌悬液浓度为10⁶～10⁷CFU/mL。

其中，步骤3)中，接种菌悬液的体积小于供试品体积的0.5％～1％；如接种细菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的接种后供试品中细菌量为10⁵～10⁶CFU，如接种真菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的供试品中真菌量为10⁴～10⁵CFU。

其中，接种后的供试品在检测期间均置于20～25℃的温度下贮存，贮存时间(也即试验时间)为27～29天。

其中，步骤4)中，将供试品样品采用无菌生理盐水稀释成多个稀释级，采用平皿菌落计数法测定每份供试品样品中所含的菌数。如稀释级可为1:10、1:10²、1:10³等。

其中，所述预定时间段为6～15天。如预定时间段可为7天、14天等，在同一次检验过程中，可以选择相同天数的预定时间段，也可选择不同天数的预定时间段，如，某一次检验过程中，在供试品刚接种(0时)及第7、14、28天时，采用平皿菌落计数法测定每份供试品中所含的菌数。

本发明的检测方法可用于新产品开发、防腐剂选择、产品防腐能力检测。

存活菌测定。

实施例1

本实施例是要检测新开发的蚝油样品的防腐能力，确定新配方的防腐体系是否安全。本实施例包括如下步骤：

1)准备菌种

本实施例选用标准菌种；经测定供试品——新开发的蚝油样品的水分活度为0.88，据此选择测试所用的菌种为金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉。

2)制备接种菌悬液

接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在36℃的温度下培养18小时后，加入适量的无菌生理盐水将琼脂表面的培养物洗脱，然后吸出菌悬液至无菌试管内，采用比浊法制成1mL含菌数约为10⁸CFU的菌悬液；在其他实施例中，培养温度可为34～36℃中的任意一值，如34℃、35℃；

接种白色念珠菌的新鲜培养物至麦芽汁培养基中，在25℃的温度下培养48小时。用无菌生理盐水洗涤菌体，采用比浊法或血球计数法制成每1mL含10⁶～10⁷CFU的菌悬液；在其他实施例中，培养温度也可选择25～28℃中的任意一值；如26℃、27℃、28℃；

接种黑曲霉的新鲜培养物至PDA培养基中，在26℃的温度下培养7天，加入3～5mL无菌生理盐水，将孢子洗脱，然后用无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适量的无菌生理盐水，采用血球计数法制成每1mL含孢子数10⁶～10⁷CFU的孢子悬液；在其他实施例中，培养温度也可选择25～28℃中的任意一值；如26℃、27℃、28℃；

3)供试品接种

将供试品——蚝油样品分装至三个无菌的250ml玻璃瓶中，每瓶200g，在无菌条件下，分别吸取金黄色葡萄球菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各2ml加入到三个装有样品的玻璃瓶中，接种后充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在检验期间置于25℃下贮存。在其他实施例中，贮存温度也可为20～25℃中的任意一值。

4)存活菌测定

在供试品刚接种(0时)及第7、14、28天时，分别从上述每个容器中取供试品10g，接种金黄色葡萄球菌的供试品用无菌生理盐水、接种白色念珠菌、黑曲霉的供试品用无菌水稀释成1:10、1:10²、1:10³等稀释级。采用平皿菌落计数法测定每份供试品中所含的菌数。其中，测定细菌用营养琼脂养基或平板计数琼脂培养基，测定真菌用孟加拉红琼脂养基。

5)评价与报告

检测结果如下表所示：

由以上结果可知，与初始值相比，在第7、14、28天，金黄色葡萄球菌数量为下降趋势，白色念珠菌与黑曲霉数量未增加，由此判定该蚝油新配方的防腐体系安全。

实施例2

本实施例中，因市场需要，黄豆酱的防腐剂需要由A更换为B，判断产品防腐剂由A换成B时，产品防腐体系是否还能达到原有标准，以及添加防腐剂B的量为多少时可保证防腐体系安全。

1)准备菌种

本实施例中选用标准菌种；经测定供试品的水分活度为0.85，据此选择测试所用的菌种为白色念珠菌和黑曲霉。

2)制备接种菌悬液

接种白色念珠菌的新鲜培养物至麦芽汁培养基中，在25℃的温度下培养48小时。用无菌生理盐水洗涤菌体，采用比浊法或血球计数法制成每1mL含10⁶～10⁷CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至PDA培养基中，在27℃的温度下培养7天，加入3～5mL无菌生理盐水，将孢子洗脱，然后，用无均吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适量的无菌生理盐水，采用血球计数法制成每1mL含孢子数10⁶～10⁷CFU的孢子悬液。

3)供试品接种

为了确定不同防腐剂B添加量对产品防腐效果的影响，制备了三种不同梯度的样品进行防腐测试，以原有的添加防腐剂A的样品为对照。供试品共有四种，将其编号为样品1、样品2、样品3和样品4。样品1为添加防腐剂A的原有蚝油，样品2、样品3和样品4分别为添加不同含量防腐剂B的蚝油样品(防腐剂B含量：样品2＞样品3＞样品4)。取四种样品各两瓶(250g/瓶)，在无菌条件下，分别吸取白色念珠菌和黑曲霉菌悬液2ml加入到三个样品瓶中，接种后充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置于24℃的温度下贮存。

4)存活菌测定

在供试品刚接种(0时)及第8、14、29天时分别从上述每个容器中取供试品10g，用无菌水稀释成1:10、1:10²、1:10³等稀释级。采用平皿菌落计数法测定每份供试品中所含的菌数，所用培养基为孟加拉红琼脂养基。

5)评价与报告

检测结果如下表所示：

由以上结果可知，样品2与样品1的菌数与初始值相比，均呈下降趋势，从下降程度上判断样品2能达到样品1的防腐能力；样品3的防腐能力低于样品1和样品2，但与初始值相比，在第8、14和29天的菌数均未增加，防腐体系也是安全的；而样品4在防腐测试期间，白色念珠菌数可达到防腐要求，但黑曲霉数目与初始值相比不断增加，防腐体系存在风险。从经济的角度考虑，防腐剂B添加量选择样品3的水平即可保证防腐体系安全。

实施例3

酱油主要的腐败变质问题是产生白膜，已从产膜酱油样品中分离出一株最强的产膜酵母菌，评价A、B、C三种酱油产品对产膜酵母的防腐能力。

1)准备菌种

菌种为试验室分离的产膜酵母菌。

2)制备接种菌悬液

接种产膜酵母的新鲜培养物至麦芽汁培养基中，在28℃的温度下培养50小时，用无菌生理盐水洗涤菌体，采用血球计数法制成每1mL含10⁶～10⁷CFU的菌悬液。

3)供试品接种

在无菌条件下，分别吸取产膜酵母菌悬液接种于三种酱油产品A、B、C中，接种量为1％，接种后充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置于21℃的温度环境下贮存。

4)存活菌测定

在供试品刚接种(0时)及第6、16、27天时，分别从上述每个容器中取供试品10g，用无菌水稀释成1:10、1:10²、1:10³等稀释级。采用平皿菌落计数法测定每份供试品中所含的菌数，所用培养基为孟加拉红琼脂养基。

5)评价与报告

检测结果如下表所示：

由以上结果可知，酱油产品A接种产膜酵母后，在培养期间菌数不断增加，表明其对该菌抑制能力较差；酱油产品B在接种后，培养期间菌数没有发生增加，表明其可抑制该菌的增殖；酱油产品C在接种后，培养期间菌数不断下降，表明其对该菌有较强的抑制与杀灭作用。三种酱油产品对产膜酵母的防腐能力大小为：酱油产品A＜酱油产品B＜酱油产品C。酱油产品A存在开盖后长膜的风险，而酱油产品B和酱油产品C对产膜酵母具有较好的防腐能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用准备好的测试菌种制备菌悬液；

2)在供试品中接种制备好的菌悬液；

3)在刚接种时及每隔预定时间段，从接种后的供试品中取等量的样品，检测样品中所含的菌数；

4)将每隔预定时间段检测得到的菌数与刚接种的初始菌数进行比较，如差值≤0，则判定所述供试品的防腐能力合格，且差值越小，判断所述供试品的防腐能力越强。

2.根据权利要求1所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，所述测试菌种选用标准菌种或从产品中分离到的菌种；或者，所述测试菌种既选用标准菌种又选用从产品中分离到的菌种。

3.根据权利要求2所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，所述标准菌种包括细菌、霉菌、酵母菌中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，所述测试菌种选用标准菌种，根据供试品的水分活度aw在标准菌种中选用适当的菌种：1)如aw≥0.90，选用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；2)如0.85<aw<0.90，选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)；3)如aw≤0.85，选用白色念珠菌、黑曲霉分别进行步骤2)～4)。

5.根据权利要求3所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，步骤2)具体为：选择接种细菌时，将细菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，在34℃～36℃的温度下培养18～24小时；选择接种霉菌时，将霉菌的新鲜培养物接种至PDA培养基中，在25～28℃的温度下培养5～7天；选择接种酵母菌时，将酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基中，在25～28℃的温度下培养48～52小时；上述各培养物用无菌生理盐水稀释即制成所述菌悬液。

6.根据权利要求3所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，步骤2)中，选用细菌制备的菌悬液浓度为10⁷～10⁸CFU/mL，选用真菌制备的菌悬液浓度为10⁶～10⁷CFU/mL。

7.根据权利要求3所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，步骤3)中，接种菌悬液的体积小于供试品体积的0.5％～1％；如接种细菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的接种后供试品中细菌量为10⁵～10⁶CFU，如接种真菌制备的菌悬液，则每1g或每1mL的供试品中真菌量为10⁴～10⁵CFU。

8.根据权利要求1所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，接种后的供试品在检测期间均置于20～25℃的温度下贮存，贮存时间为27～29天。

9.根据权利要求1所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，步骤4)中，将供试品样品采用无菌生理盐水稀释成多个稀释级，采用平皿菌落计数法测定每份供试品样品中所含的菌数。

10.根据权利要求1所述的检测调味品防腐能力的方法，其特征在于，所述预定时间段为6～15天。